剩余污泥堿性發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選與鑒定

接偉光 姚延軒 彭永臻

摘要：為了能夠縮短剩余污泥堿性發(fā)酵周期，從堿性發(fā)酵剩余污泥中篩選產(chǎn)蛋白酶活力較高的耐堿細(xì)菌，利用形態(tài)學(xué)、生理生化、分子生物學(xué)特征對(duì)篩選到的菌株進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，從堿性厭氧發(fā)酵剩余污泥中最終篩選獲得2株產(chǎn)蛋白酶活力較高的耐堿細(xì)菌HIT-01菌株和HIT-02菌株，經(jīng)鑒定分別為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和芽孢桿菌屬細(xì)菌（Bacillus sp.）。為進(jìn)一步利用篩選獲得的優(yōu)勢(shì)菌株構(gòu)建生物菌劑、從而快速啟動(dòng)污泥堿性發(fā)酵開拓了新思路。

關(guān)鍵詞：剩余污泥;產(chǎn)蛋白酶菌株;篩選;鑒定

中圖法分類號(hào)：X703 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2020）06-0143-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.06.029 ? ? ? ? ? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Screening and identification of protease-producing bacteria from

alkaline fermentation of excess sludge

JIE Wei-guang1，2，YAO Yan-xuan2，PENG Yong-zhen1，3，HU Wei2

（1.National Key Laboratory of Urban Water Resource and Environment，Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，China;2.Department of Food and Environment Engineering，East University of Heilongjiang，Harbin 150066，China;3.Key Laboratory of Beijing for Water Quality Science and Water Environment Recovery Engineering，Beijing University of Technology，Beijing 100124，China）

Abstract： In order to shorten the alkaline fermentation period of excess sludge， alkaline-tolerant strains with high protease-producing activity were isolated from alkaline fermentation of excess sludge and identified by morphological. physiological， biochemical， and molecular characteristic analysis. The results showed that the two screened alkali-tolerant bacterial strains （HIT-01 and HIT-02 strains） which of high protease-producing activity were belongs to Bacillus subtilis and Bacillus sp. This study opens a new idea for further utilizing the screened dominant strains to construct microbial agents and quickly activate alkaline fermentation of sludge.

Key words： excess sludge; protease-producing bacteria; screening; identification

城市污泥（簡(jiǎn)稱污泥）是污水處理廠在對(duì)城市居民生活污水與工業(yè)廢水等進(jìn)行污水處理時(shí)所產(chǎn)生的固體廢棄物，是污水處理的必然產(chǎn)物，其性狀通常是介于固體與液體之間[1]。由于城市和工業(yè)的飛速發(fā)展，各種生活污水和工業(yè)污水等的排放量也隨之不斷增加，這必然導(dǎo)致污泥產(chǎn)量不斷增加[2]。近年來，污泥資源化利用成為了污泥處理處置研究的熱點(diǎn)[3-5]。污泥中含有豐富的有機(jī)物以及氮、磷等營養(yǎng)元素，其中部分有機(jī)物經(jīng)厭氧消化可產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸（Volatile fatty acids，VFAs），VFAs是污水處理廠生物營養(yǎng)物（氮和磷）去除工藝中最適宜的有機(jī)碳源[6，7]。

污泥的種類較多，分類也相對(duì)較為復(fù)雜，根據(jù)污泥的處理方法可以將其分為初次沉淀污泥、剩余活性污泥、腐殖污泥及化學(xué)污泥[8，9]。蛋白質(zhì)和碳水化合物是剩余污泥中的主要有機(jī)物，在剩余污泥酸化階段能夠被轉(zhuǎn)化為VFAs，且其中的乙酸和丙酸是污水處理廠用于脫氮除磷工藝優(yōu)選的有機(jī)碳源[10，11]。研究表明，pH顯著影響剩余污泥發(fā)酵過程中VFAs的產(chǎn)量及組分，且堿性發(fā)酵條件能夠促進(jìn)剩余污泥中有機(jī)物質(zhì)的溶出[12-16]。近年來，大量研究結(jié)果均表明污泥發(fā)酵過程中pH及污泥中微生物菌群結(jié)構(gòu)顯著影響VFAs的產(chǎn)量及組分[17-20]。Liu等[21]研究表明，堿性條件有利于污泥中蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)閂FAs。然而，有關(guān)剩余污泥堿性發(fā)酵過程中優(yōu)勢(shì)產(chǎn)蛋白酶微生物的研究卻鮮見報(bào)道。

為了能夠加速剩余污泥中蛋白質(zhì)的降解，從而縮短剩余污泥堿性發(fā)酵周期并使該過程能夠產(chǎn)生更多的VFAs，本研究主要從堿性發(fā)酵剩余污泥中篩選產(chǎn)蛋白酶活力較高的耐堿細(xì)菌，利用形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征以及分子生物學(xué)特征對(duì)篩選獲得的產(chǎn)蛋白酶菌株進(jìn)行了鑒定。

1 ?材料與方法

1.1 ?污泥來源

試驗(yàn)所用剩余污泥均來自哈爾濱太平污水處理廠二沉池。剩余污泥取回后靜置24 h，棄上清液，并置于4 ℃保存。剩余污泥初始性質(zhì)均在其混合均勻后測(cè)定，濃縮后的剩余污泥pH為6.82;總固體含量（TS）為13.68 g/L;揮發(fā)性固體含量（VS）為10.36 g/L;溶解性化學(xué)需氧量（SCOD）為142.21 mg/L;可溶性蛋白質(zhì)含量為76.32 mg COD/L;可溶性碳水化合物含量為30.87 mg COD/L。

1.2 ?培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：脫脂乳粉10.0 g，酵母提取物3.0 g，（NH4）2SO4 6.7 g，K2HPO4 1.2 g，KH2PO4 0.7 g，MgSO4 0.5 g，NaCl 0.5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 10.0，121 ℃滅菌20 min[22]。

瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基：脫脂乳粉10.0 g，酵母提取物3.0 g，（NH4）2SO4 6.7 g，K2HPO4 1.2 g，KH2PO4 0.7 g，MgSO4 0.5 g，NaCl 0.5 g，瓊脂粉20.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 10.0，121 ℃滅菌20 min。

透明圈實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基：脫脂乳粉10.0 g，可溶性淀粉10.0 g，蛋白胨5.0 g，酵母提取物2.5 g，KH2PO4 0.5 g，MgSO4 0.5 g，NaCl 1.0 g，瓊脂粉20.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 10.0，121 ℃滅菌20 min。

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白酶胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min。

1.3 ?菌株的分離與鑒定

1.3.1 ?菌株的分離 ?取2.0 g堿性發(fā)酵剩余污泥，將其接種于500 mL富集培養(yǎng)基中，通入氮?dú)? min以保證驅(qū)除培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的氧氣，用橡膠塞密封后于120 r/min、30℃條件下厭氧培養(yǎng)48 h。將富集后的培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋，取適當(dāng)梯度的培養(yǎng)液涂布于瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，繼續(xù)在30 ℃條件下厭氧培養(yǎng)48 h。挑選瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基中長(zhǎng)勢(shì)良好的單菌落，并將其在瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基中進(jìn)行三區(qū)劃線，然后繼續(xù)在30 ℃條件下厭氧培養(yǎng)48 h，重復(fù)以上操作步驟直至獲得細(xì)菌純培養(yǎng)。將以上初篩試驗(yàn)所獲得的菌株分別涂布于透明圈實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基中，30 ℃條件下厭氧培養(yǎng)48 h后，挑選水解圈直徑與菌落直徑比值相對(duì)較大的單菌落。

1.3.2 ?菌落形態(tài)及透射電鏡下菌株形態(tài)鑒定 ?將篩選到的菌株分別接種于LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃條件下厭氧培養(yǎng)48 h。觀察單菌落顏色、形狀和大小等菌落表面特征，并分別對(duì)篩選到的菌株進(jìn)行革蘭氏染色。

利用透射電子顯微鏡觀察菌株形態(tài)特征。在無菌操作條件下分別挑取篩選到的菌株單菌落，并將其分別接種至100 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)至其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，每個(gè)菌株取2片帶膜銅網(wǎng)制備電鏡樣品。首先將制備好的菌懸液滴加至硫酸紙上，并將帶膜銅網(wǎng)放在菌懸液液滴上吸附3～5 min，然后用濾紙將銅網(wǎng)邊緣的菌液吸干;加等量的3%磷鎢酸溶液覆蓋染色40 s后，立即用濾紙將染液吸干，透射電鏡觀察。

1.3.3 ?菌株的生理生化鑒定 ?根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[23]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[24]對(duì)分離獲得的菌株進(jìn)行生理生化鑒定，每項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)3次重復(fù)。

1.3.4 ?菌株分子生物學(xué)鑒定 ?根據(jù)形態(tài)學(xué)特征將篩選到的菌株初步歸類后對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。取在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后的細(xì)菌培養(yǎng)液1～2 mL，10 000 r/min離心2 min，棄上清液，沉淀物以無菌去離子水反復(fù)洗滌并離心2次。采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（Tiangen，北京）提取洗滌并離心后的沉淀物中細(xì)菌基因組DNA。利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取到的基因組DNA，采用紫外分光光度計(jì)（DU800型，美國 Beckman）測(cè)定提取的基因組DNA在260 nm和280 nm波長(zhǎng)處的吸收度，計(jì)算提取的基因組DNA的濃度及純度。

采用引物fD1（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3′）和rP2（5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）[25]，擴(kuò)增細(xì)菌核糖體16S rDNA，擴(kuò)增片段大小約為1.6 kb。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min，57 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán);72 ℃繼續(xù)延伸10 min，4 ℃保存。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。挑選陽性克隆結(jié)果送往生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，將測(cè)序獲得的16S rDNA序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，利用NCBI的BLASTN程序?qū)y(cè)序所得16S rDNA序列進(jìn)行同源性比對(duì)，得到相關(guān)細(xì)菌種屬的序列信息，使用MEGA5.1軟件對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?形態(tài)學(xué)特征

從堿性（pH 10.0）發(fā)酵剩余污泥中共篩選分離出17株細(xì)菌，通過初篩獲得6株生長(zhǎng)穩(wěn)定且耐堿能力較強(qiáng)的產(chǎn)蛋白酶菌株，經(jīng)進(jìn)一步復(fù)篩最終獲得2株產(chǎn)蛋白酶活力較高的耐堿細(xì)菌，將其分別命名為HIT-01菌株和HIT-02菌株，并對(duì)其進(jìn)行鑒定。

菌株HIT-01在LB液體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，所形成的菌落顏色呈淺黃色、不透明，菌落形狀呈圓形、扁平、邊緣整齊、表面干燥且不容易被挑起。菌株HIT-02在LB液體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)所形成的菌落顏色呈乳白色、不透明，菌落形狀呈圓形、中心微凸起、邊緣呈鋸齒形、表面濕潤(rùn)且容易被挑起。革蘭氏染色后經(jīng)鏡檢，菌株HIT-01和HIT-02均為革蘭氏陽性桿菌，能形成芽孢，芽孢為橢圓狀。菌株HIT-01芽孢位于菌體極端或次極端，芽孢形成后菌體不膨大;菌株HIT-02芽孢位于菌體中央或次極端，芽孢形成后菌體膨大。通過透射電鏡觀察菌株HIT-01的菌體形態(tài)如圖1A所示，菌株HIT-01為桿菌，單個(gè)或成對(duì)排列，菌體大小約為（0.82～1.13） μm×（3.16～3.57） μm，周生鞭毛;菌株HIT-02菌體形態(tài)如圖1B所示，為桿菌，成對(duì)或鏈狀排列，菌體大小約為（0.72～1.06） μm×（1.83～2.19） μm，極生鞭毛。

2.2 ?生理生化特征

HIT-01菌株LB液體靜置培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基表面產(chǎn)生菌膜，液體澄清無沉淀;HIT-02菌株LB液體靜置培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基表面不產(chǎn)生菌膜，液體混濁有沉淀。根據(jù)HIT-01和HIT-02菌株生理生化特征（表1），并參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[23]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[24]進(jìn)行相關(guān)分析，初步鑒定HIT-01菌株和HIT-02菌株均為芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）細(xì)菌。

2.3 ?分子生物學(xué)特征

2.3.1 ?基因組DNA的提取 ?利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取的HIT-01菌株和HIT-02菌株基因組DNA。由圖2可知，HIT-01菌株和HIT-02菌株基因組DNA片段大小均在15 000 bp以上，而且條帶清晰。

由表2可知，HIT-01菌株和HIT-02菌株基因組DNA濃度以及OD260 nm/280 nm和OD260 nm/230 nm均符合PCR要求，可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3.2 ?PCR擴(kuò)增結(jié)果 ?HIT-01菌株和HIT-02菌株的16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目的DNA條帶大小均約為1 600 bp（圖3），條帶大小正確，條帶清晰，可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3.3 ?測(cè)序結(jié)果分析 ?將HIT-01與HIT-02菌株的16S rDNA測(cè)序結(jié)果分別提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得的GenBank登錄號(hào)分別為KF738663與KF738664。為顯示HIT-01和HIT-02菌株與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知菌株之間的親緣關(guān)系及其系統(tǒng)地位，分別將HIT-01與HIT-02菌株的16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知菌株序列進(jìn)行比對(duì)，并獲得同源性信息，結(jié)果HIT-01菌株的16S rDNA序列與Bacillus subtilis（DQ993674）的相似性最高，其相似性高達(dá)99%;HIT-02菌株的16S rDNA序列與Bacillus sp.（AB243843）的相似性最高，其相似性為98%。利用MEGA 5.1軟件對(duì)HIT-01和HIT-02菌株的16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知近緣菌株序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，采用Neighbor-joining法對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)（圖4）。由圖4可知，HIT-01菌株與Bacillus subtilis（DQ993674）、Bacillus amyloliquefaciens（KF156785）和Bacillus velezensis（EF433407）聚為一簇，說明他們之間的相似性較高。而HIT-02菌株與由GenBank數(shù)據(jù)庫中所獲得的其他15個(gè)已知近緣細(xì)菌16S rDNA序列相似性較高并聚為一簇。研究表明，芽孢桿菌屬（Bacillus）中的一些細(xì)菌能夠在強(qiáng)堿性條件下生存或產(chǎn)生堿性蛋白酶[25]。然而，由于HIT-02菌株與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知近緣細(xì)菌16S rDNA序列同源性相對(duì)較低，因此無法將其準(zhǔn)確鑒定到種的水平。

基于HIT-01菌株和HIT-02菌株的形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征和分子生物學(xué)特征鑒定結(jié)果，將其分別鑒定為Bacillus subtilis和Bacillus sp.。

3 ?結(jié)論

為了能夠縮短剩余污泥堿性發(fā)酵周期，并使剩余污泥在堿性發(fā)酵過程中能夠產(chǎn)生更多的VFAs，本研究從堿性發(fā)酵剩余污泥中篩選產(chǎn)蛋白酶菌株，并對(duì)篩選獲得的菌株進(jìn)行了形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征以及分子生物學(xué)特征鑒定。同時(shí)，為保證篩選獲得的產(chǎn)蛋白酶菌株應(yīng)用于剩余污泥堿性發(fā)酵，得出以下結(jié)論。

1）從堿性發(fā)酵剩余污泥中共篩選出17株細(xì)菌，經(jīng)初篩后獲得6株生長(zhǎng)穩(wěn)定且耐堿能力較強(qiáng)的產(chǎn)蛋白酶菌株，通過進(jìn)一步復(fù)篩最終獲得2株產(chǎn)蛋白酶活力較高的耐堿細(xì)菌，并將其分別命名為HIT-01菌株和HIT-02菌株。

2）經(jīng)形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征以及分子生物學(xué)特征鑒定，將本研究篩選獲得的耐堿且產(chǎn)蛋白酶能力較高的菌株HIT-01和HIT-02分別鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和芽孢桿菌屬細(xì)菌（Bacillus sp.）。

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