HPLC檢測(cè)不同配比三七-黃連藥對(duì)中3種成分的溶出率△

陳雪平，郭麗娜，王單單，田會(huì)東，裴媛，王瑞*

1.漯河市中心醫(yī)院 藥學(xué)部，河南 漯河 462300；2.武漢大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430000

三七是五加科人參屬植物三七Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen.的干燥根和根莖，性甘,微苦。在《本草新編》中被稱作“止血之神藥”；其化學(xué)成分主要是達(dá)瑪烷型皂苷、黃酮類、氨基酸等，如人參二醇型皂苷、原人參三醇型皂苷三七[1]。三七具有散瘀止血、消腫定痛的生物活性，臨床上主要用于治療咯血、吐血、崩漏、外傷出血、跌撲腫痛等[2]。黃連CoptischinensisFranch.是毛茛科黃連屬多年生草本植物，具有抗菌、抗病毒、抗炎、降血糖、降血脂、抗氧化等藥理作用，臨床用于黃疸、高熱神昏等[2]。三七與黃連是臨床上常用的藥對(duì)之一，我國(guó)傳統(tǒng)的以三七、黃連為主藥的中藥復(fù)方制劑有中藥復(fù)方三七貝連蜜糊[3]、苦參黃連湯[4]、復(fù)方三七飲[5]、三七芪連湯[6]等。藥對(duì)是中藥復(fù)方最常用的配伍形式，組成簡(jiǎn)單卻具備中藥復(fù)方配伍的基本特點(diǎn)，是以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，并經(jīng)過長(zhǎng)期臨床實(shí)踐證明行之有效和有一定組合法度的兩對(duì)相對(duì)固定中藥的配對(duì)，通過配伍組合發(fā)揮協(xié)同增效或配伍減毒等作用[7]。雖然三七-黃連藥對(duì)在臨床上廣泛應(yīng)用，但目前兩者的配伍比例鮮有報(bào)道。研究表明藥對(duì)的不同配比對(duì)有效成分的溶出率有較大影響[8-11]。三七皂苷R1、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rg1是三七總皂苷的主要活性成分，檢測(cè)三者的含量對(duì)三七-黃連藥對(duì)的質(zhì)量評(píng)價(jià)具有重要意義[12]。因此，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了9個(gè)三七-黃連的配比，研究不同配比下三七-黃連藥對(duì)中主要活性成分的溶出率變化規(guī)律，并從化學(xué)成分視角探討最佳配比，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

LC-20A島津高效液相色譜儀、DGU-20A3R在線脫氣系統(tǒng)、全波長(zhǎng)色譜工作站、SPD-M20A光電二極管陣列紫外-可見光檢測(cè)器、SIL-20AC自動(dòng)進(jìn)樣器、CT0-20AC柱溫箱(日本島津公司)；臺(tái)式高速離心機(jī)(16K，珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司)；超聲波清洗器(SB25-12D，寧波新芝生物科技股份有限公司)；電子分子天平(JY，上海衡平儀器儀表廠)；純水儀(Milli-Q，美國(guó)Millipore公司)。

三七皂苷R1對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110745-201820，純度：93.1%)；人參皂苷Rb1對(duì)照品(斯坦福分析化學(xué)公司，批號(hào)：GSB-107939，純度：98.34%)；人參皂苷Rg1對(duì)照品(斯坦福分析化學(xué)公司，批號(hào)：GSB-705891，純度：99.87%)。三七和黃連購(gòu)自安徽。經(jīng)漯河市中心醫(yī)院藥學(xué)部于曉濤主任鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Agilent C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)；流動(dòng)相為乙腈(A)-水(B)，線性梯度洗脫(0～25 min，2%～20%A；25～50 min，20%～45%A；50～60 min，45%～70%A；60～65 min，70%～70%A；65～70 min，70%～2%A)；流量為1.0 mL·min-1；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm；進(jìn)樣體積10 μL。

2.2 樣品制備

2.2.1供試品樣品制備 三七和黃連按照1∶0、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、4∶1、3∶1、2∶1、0∶1共9種不同比例分別精密稱取2味中藥，每個(gè)比例均為10 g，于500 mL圓底燒瓶中加20倍量水，浸泡2 h。加熱回流提取1 h，過濾，轉(zhuǎn)移到離心管中，99×g離心10 min，取上清液置于250 mL容量瓶中，加水定容，搖勻。精密吸取2 mL，0.45 μm微孔濾膜過濾，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2對(duì)照品溶液的制備 精密稱取適量，水溶解定容于1 mL容量瓶中，搖勻，制成的混合對(duì)照品溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，-20 ℃保存，備用。

2.2.3HPLC檢測(cè) 分別取上述制備的樣品各10 μL，注入HPLC色譜儀，按2.1項(xiàng)下的色譜條件檢測(cè)，色譜圖見圖1。

2.3 線性關(guān)系考察

分別精密吸取2.2.2項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL置于10 mL容量瓶中，水定容，搖勻。精密吸取10 μL注入HPLC色譜儀，在2.1項(xiàng)下的色譜條件檢測(cè)。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的線性回歸方程，分別是Y=3 944 200X+25 079.6(0.40～0.18 mg·mL-1，r=0.999 6)、Y=5 381 900X+185 331.0(0.1～0.68 mg·mL-1,r=0.999 6)和Y=4 117 930X+149 098.0(0.16～0.70 mg·mL-1,r=0.999 6)。r均大于0.999，表明線性方程在檢測(cè)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

注：A.對(duì)照品；B.黃連；C.三七；D.三七-黃連配伍比為1∶1；E.三七-黃連配伍比為1∶2；F.三七-黃連配伍比為1∶3；G.三七-黃連配伍比為1∶4；H.三七-黃連配伍比為2∶1；I.三七-黃連配伍比為3∶1；J.三七-黃連配伍比為4∶1；1.三七皂苷R1；2.人參皂苷Rg1；3.人參皂苷Rb1。圖1 三七-黃連不同配伍比的HPLC圖

2.4 系統(tǒng)適用性

取上述制備的混合對(duì)照品溶液的中間濃度，按2.1項(xiàng)下的色譜條件檢測(cè)，計(jì)算理論塔板數(shù)(N)，N=16(tR/w)2(tR是保留時(shí)間，w是化合物基線的峰寬)，三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1的理論塔板數(shù)分別是125 685、105 813、46 178；拖尾因子(T)，T=w0.05/2 d(w是化合物基線的峰寬，d是峰前沿到峰頂點(diǎn)之間的距離)，三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1的拖尾因子分別是1.041、1.006、0.970，3個(gè)化合物的拖尾因子都在0.95～1.05，符合2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定。取中間濃度的混合對(duì)照品溶液，用水稀釋到適當(dāng)濃度，按2.1項(xiàng)下的色譜條件檢測(cè)，當(dāng)信噪比分別為3和10時(shí)，此時(shí)對(duì)應(yīng)化合物的濃度分別為檢測(cè)下限和定量下限，三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1的檢測(cè)下限分別是0.860、0.052、2.037 μg，定量下限分別是2.860、0.174、6.790 μg，3個(gè)化合物的濃度都大于定量下限，表明該方法系統(tǒng)適用性良好。

2.5 精密度

日內(nèi)精密度：取上述制備的混合對(duì)照品溶液高、中、低3個(gè)濃度，每個(gè)樣品連續(xù)進(jìn)樣6次，在2.1項(xiàng)下的色譜條件檢測(cè)，計(jì)算連續(xù)6次的RSD；日間精密度：同樣取混合對(duì)照品溶液的高、中、低3個(gè)濃度，每個(gè)樣品每天連續(xù)進(jìn)樣2次，連續(xù)進(jìn)樣3 d，在2.1項(xiàng)下的色譜條件檢測(cè)，計(jì)算6次進(jìn)樣的RSD，如表1所示，表明精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性

取上述制備的混合對(duì)照品溶液高、中、低3個(gè)濃度，分別在0、2、4、8、16、24 h通過2.1項(xiàng)下的色譜條件檢測(cè)，計(jì)算RSD，如表1所示，表明供試品溶液24 h穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性

按2.2.1項(xiàng)下方法制備三七-黃連質(zhì)量比為1∶1的供試品溶液6份，在2.1項(xiàng)下的色譜條件檢測(cè)。計(jì)算3份供試品溶液的平均含量的RSD，結(jié)果如表1所示，表明該方法重復(fù)性較好。

2.8 加樣回收率

精密量取三七-黃連質(zhì)量比為1∶1的供試品溶液6份，每份1 mL，分別加入已知量的對(duì)照品，制備供試品溶液，在2.1項(xiàng)下的色譜條件檢測(cè)，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 HPLC檢測(cè)三七-黃連藥對(duì)中3種成分含量的方法學(xué)考察(n=6)

2.9 結(jié)果

2.9.1有效成分溶出率 按2.1項(xiàng)下檢測(cè)的9個(gè)三七-黃連不同配比的含量，計(jì)算有效成分溶出率，公式如下，結(jié)果見圖2～4和表2。

單一成分的溶出率=(該化合物在提取物中的含量/
該化合物對(duì)應(yīng)生藥材的取樣量)×100%

(1)

三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1溶出率隨不同比例的變化趨勢(shì)分別見圖2～4。由圖2可知當(dāng)三七-黃連配伍比為1∶4時(shí)，三七皂苷R1的溶出率最好，當(dāng)三七-黃連配伍比為1∶2時(shí)，人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的溶出率最好。

圖2 不同配伍比例三七-黃連藥對(duì)中三七皂苷R1溶出率變化

圖3 不同配伍比例三七-黃連藥對(duì)中人參皂苷Rg1溶出率變化

圖4 不同配伍比例三七-黃連藥對(duì)中人參皂苷Rb1溶出率變化

表2 三七-黃連不同配伍比例下3個(gè)成分的溶出率(n=3) %

2.9.2最優(yōu)配比結(jié)果 以三七-黃連藥對(duì)中3個(gè)有效成分為考察指標(biāo)，采用“歸一化法”處理數(shù)據(jù)，通過Hassan法進(jìn)行數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)化，計(jì)算各指標(biāo)的“歸一值”，公式如下[13]：

di=(Yi-Ymin)/(Ymax-Ymin)

(2)

再通過各指標(biāo)的“歸一值”，得到總“歸一值”(A)，公式如下[14-15]：

A=(d1×d2……×dn)1/n

(3)

結(jié)果如表所示。由表3可知，當(dāng)三七-黃連配伍比為1∶4時(shí)，3種成分的溶出率最好，配伍比為3∶1時(shí)，三者的溶出率最差。

表3 三七-黃連不同配伍比例下3個(gè)成分的總評(píng)歸一值

3 討論

研究結(jié)果顯示，不同配伍比例的三七-黃連藥對(duì)對(duì)有效成分的溶出影響較大。其中R1的溶出率隨黃連比例的升高而增加，Rg1和Rb1的溶出率隨黃連的比例升高先增加后降低，當(dāng)三七-黃連配伍比為1∶2時(shí)，兩者的溶出率最大。本研究選取的3個(gè)成分屬于三七-黃連藥對(duì)的主要藥效物質(zhì)，被《中華人民共和國(guó)藥典》列為對(duì)應(yīng)藥材的質(zhì)量控制性指標(biāo)。因此，以三者的溶出率為指標(biāo)進(jìn)行最優(yōu)配比關(guān)系考察具有一定的代表性。通過計(jì)算三七-黃連不同配比條件下3個(gè)成分溶出率的總評(píng)歸一值，發(fā)現(xiàn)當(dāng)三七-黃連比例為1∶4時(shí)，三者的總?cè)艹雎首畲螅瑸?∶1時(shí)有成效成分的總?cè)艹雎首畈睢?/p>

本研究從化學(xué)成分的角度對(duì)中藥藥對(duì)三七-黃連最佳配比關(guān)系進(jìn)行了研究，在以后的科研工作中，將從藥效學(xué)的視角做進(jìn)一步的探討，為三七-黃連藥對(duì)的最佳配伍比例的確定提供參考。