UPLC建立芍藥甘草湯指紋圖譜及測定多種水溶性活性成分的含量△

呂欣鍇，路娟，鄭巧，柴瑞平，俞月，鄧明慧，李海濤，陳曦*

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所 云南分所，云南 景洪 666100

芍藥甘草湯是由白芍、甘草配伍而成的中藥復(fù)方湯劑，其應(yīng)用歷史悠久，療效顯著，早在漢代張仲景所著《傷寒論·辨太陽病脈證并治》中便有記載[1]。方中白芍苦、酸，微寒，養(yǎng)血斂陰、滋養(yǎng)筋脈；甘草甘，平，善入太陰、補(bǔ)脾益氣，兩者相伍，酸甘化陰，制勝脾胃[2]，共奏調(diào)和肝脾、緩急止痛之功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，芍藥甘草湯具有抗炎鎮(zhèn)痛[3-4]、保肝利膽等功效，臨床常用于多種痛癥及炎癥性疾病的治療[5]。

2018年4月，芍藥甘草湯成為《古代經(jīng)典名方目錄(第一批)》所載方劑[6]，使芍藥甘草湯成為近兩年的研究熱門。目前已有學(xué)者建立了芍藥甘草湯的HPLC檢測方法及方中藥材、飲片的部分物質(zhì)基準(zhǔn)[7]，但此法耗時(shí)較長；還有學(xué)者建立了超高效液相色譜法(UPLC)檢測方法，但對多批次藥材的質(zhì)控并未進(jìn)一步檢測與分析[8]。本文建立了同時(shí)檢測多批次芍藥甘草湯水煎液中7種活性成分的UPLC方法。基于實(shí)驗(yàn)室前期對芍藥甘草湯指紋圖譜的考察，進(jìn)一步完善方法，旨在對其整體化學(xué)成分研究及藥效物質(zhì)基準(zhǔn)進(jìn)一步發(fā)掘，為芍藥甘草湯的新劑型開發(fā)及臨床應(yīng)用提供一定參考。

1 材料

1.1 儀器

Waters UPLC H-Class 系統(tǒng)；AB265-S 分析天平(瑞士METTLER公司)；JA11002 電子天平(上海菁海儀器有限公司)；2-16R 臺(tái)式高速微量冷凍離心機(jī)(上海托莫斯科學(xué)儀器有限公司)；奇俞牌智能煎藥壺(2.5 L)(深圳市時(shí)光主語實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司)；各種規(guī)格移液槍(Eppendorf公司)。

1.2 試藥

白芍和甘草飲片經(jīng)北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所云南分所李海濤教授鑒定均為正品，且符合 2015年版《中華人民共和國藥典》標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)藥材批號，將飲片隨機(jī)組合用于制備 11 批次芍藥甘草湯樣品，飲片具體信息見表1。

表1 白芍及甘草飲片信息

甲醇、乙腈(Merck公司)；磷酸(西隴化工股份有限公司)；對照品甘草苷(批號：180305)、異甘草苷(批號：180427)、異甘草素(批號：180321)、芹糖基異甘草苷(批號：170706)、甘草酸銨(批號：180402)、芍藥苷(批號：180302)、芍藥內(nèi)酯苷對照品(批號：180216)均購于上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，純度>98%；實(shí)驗(yàn)用水為屈臣氏蒸餾水。

2 方法及結(jié)果

2.1 色譜條件

Waters Xselect Hss T3 色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)；梯度洗脫(0～5 min，10%～11.3%A；5～30 min，11.3%～100%A)；流速0.3 mL·min-1；柱溫40 ℃；二極管陣列檢測器(PDA)定時(shí)波長處理：0～18 min，230 nm，18.01～30 min，250 nm；進(jìn)樣量：2 μL。

2.2 供試品溶液的制備

《傷寒論》中記載芍藥甘草湯的用法用量：白芍藥、炙甘草各四兩。上二味，以水三升，煮取一升五合，去滓，分溫再服[9]。按照漢代一兩等于15.5 g，一升等于200 mL，一合等于20 mL計(jì)算。稱取甘草、白芍各62 g，加水600 mL，浸泡30 min，用煎藥壺先武火20 min，再文火40 min進(jìn)行煎煮至300 mL。經(jīng)紗布(8層)過濾后，取適量濾液，10 000 r·min-1(離心半徑為 6 cm)，4 ℃，離心10 min，取上清液，過0.22 μm微孔濾膜，濾液用甲醇稀釋5倍，即得。其余樣品-20 ℃冷凍儲(chǔ)存。根據(jù)此法，由不同產(chǎn)地批次飲片制得的11批次芍藥甘草湯，具體見表2。

2.3 對照品溶液的制備

精密稱取芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草酸銨、芹糖基異甘草苷、異甘草素、異甘草苷、甘草苷對照品5 mg，用純甲醇定容，制得7個(gè)質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的對照品儲(chǔ)備液。精密吸取0.5 mL芍藥內(nèi)酯苷儲(chǔ)備液、2 mL芍藥苷儲(chǔ)備液、1 mL甘草酸銨儲(chǔ)備液、0.2 mL芹糖基異甘草苷儲(chǔ)備液、0.2 mL異甘草素儲(chǔ)備液、0.3 mL異甘草苷儲(chǔ)備液、0.8 mL甘草苷儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，加甲醇定容，制得混合對照品溶液。分別精密吸取適量混合對照品儲(chǔ)備液，用甲醇定容配制成不同濃度的對照品溶液。4 ℃存放備用，測定前使用0.22 μm微孔濾膜過濾。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1精密度試驗(yàn) 精密吸取芍藥甘草湯對照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果測得芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷、芹糖基異甘草苷、異甘草苷、異甘草素、甘草酸銨峰面積的RSD分別為1.68%、2.18%、2.09%、2.64%、2.15%、1.21%、1.79%，表明儀器精密度良好。

2.4.2重復(fù)性試驗(yàn) 取S1批次供試品溶液，按2.1項(xiàng)下測定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果測得芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷、芹糖基異甘草苷、異甘草苷、異甘草素、甘草酸銨峰面積的RSD分別為0.77%、0.94%、0.60%、2.68%、0.85%、0.72%、0.55%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.3穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S1批次供試品溶液，分別于第0、2、4、6、8、12 h，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果測得芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷、芹糖基異甘草苷、異甘草苷、異甘草素、甘草酸銨峰面積的RSD分別為0.25%、1.36%、1.20%、8.39%、11.33%、14.51%、0.60%，表明供試品溶液中各成分在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4專屬性考察 按照2.2項(xiàng)下記錄的供試品溶液制備方法分別制備甘草和芍藥的單味樣品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，見圖1。

注：A.空白溶劑；B.混合對照品；C.單味甘草水煎液；D.單味白芍水煎液；E.S1批次全方；F.S1批次全方局部放大圖；1.芍藥內(nèi)酯苷；2.芍藥苷；3.甘草苷；4.芹糖基異甘草苷；5.異甘草苷；6.異甘草素；7.甘草酸銨。圖1 PDA定時(shí)波長處理后芍藥苷湯樣品及混合對照品色譜圖

2.4.5加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取已知含量的S1批次供試品溶液3份，分別加入已知含量的混合對照品溶液，使得到的混合對照品中化學(xué)成分濃度為已知樣品中化學(xué)成分濃度的80%、100%、120%。用0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液。然后按照2.1項(xiàng)下色譜條件每個(gè)混合對照品溶液重復(fù)進(jìn)樣3次，計(jì)算回收率和RSD。結(jié)果芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷、芹糖基異甘草苷、異甘草苷、異甘草素、甘草酸銨平均回收率分別為93.77%、94.16%、105.62%、103.81%、92.57%、90.87%、91.25%，RSD分別為1.21%、0.07%、0.81%、4.06%、2.72%、0.81%、0.81%，表明本方法準(zhǔn)確可靠，此法加樣回收率良好。

2.5 11批次芍藥甘草湯指紋圖譜的建立及相似度評價(jià)

2.5.1指紋圖譜的建立 將11批次處理好的芍藥甘草湯UPLC圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”2004 A版進(jìn)行色譜峰匹配，得到指紋圖譜，經(jīng)處理后共標(biāo)定59個(gè)共有峰，其中43號色譜峰分離度較好，峰面積較大且穩(wěn)定，保留時(shí)間合適，故確定43號色譜峰為參照峰。并指認(rèn)出7個(gè)共有峰，分別為芍藥內(nèi)酯苷(14號峰)、芍藥苷(15號峰)、甘草苷(17號峰)、芹糖基異甘草苷(28號峰)、異甘草苷(29號峰)、異甘草素(39號峰)、甘草酸銨(41號峰)，11批次芍藥甘草湯UPLC指紋圖譜見圖2。

圖2 11批次芍藥甘草湯UPLC指紋圖譜

2.5.2相似性評價(jià)結(jié)果 利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”2004 A版軟件計(jì)算分析，得到11批芍藥甘草湯供試品色譜圖的相似度，具體數(shù)據(jù)見表3。根據(jù)結(jié)果，11批次相似度>0.98，表明此11批次間差異較小，甘草3個(gè)產(chǎn)地5個(gè)批次及白芍2個(gè)產(chǎn)地4個(gè)批次的飲片質(zhì)量較為均一。

2.6 11批次芍藥甘草湯中7種水溶性成分線性關(guān)系考察及含量測定

為進(jìn)一步對不同產(chǎn)地批次藥材進(jìn)行分析，我們對11批次芍藥甘草湯中已指認(rèn)的7種成分進(jìn)行了含量測定。首先以對照品的質(zhì)量濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，建立各成分標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程和r，結(jié)果見表4。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各批次芍藥甘草湯中7種水溶性成分的含量，結(jié)果見表5。結(jié)果表明，各產(chǎn)地各批次藥材的各成分含量存在差異，但總體而言差異較小，此結(jié)果與相似度評價(jià)結(jié)果趨于一致。

3 討論

芍藥甘草湯是由芍藥、甘草配伍所得，兩者協(xié)同共奏調(diào)和肝脾、柔筋止痛之功效，其化學(xué)成分復(fù)雜多樣，研究表明[11]，芍藥甘草湯的原方入血成分多達(dá)17種，因此對原方中化學(xué)成分的整體研究顯得尤為重要。將芍藥、甘草中較為穩(wěn)定且分離良好的7種成分作為本實(shí)驗(yàn)考察重點(diǎn)，其中5種成分來自甘草，2種成分來自芍藥，包括了芍藥苷、甘草苷、異甘草苷、甘草酸等重要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[12]。

表3 11批芍藥甘草湯供試品色譜圖中色譜圖相似度

表4 芍藥甘草湯各成分標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

注：甘草酸質(zhì)量=甘草酸銨質(zhì)量/1.020 7[10]。

實(shí)驗(yàn)最初選擇乙腈(A)-醋酸-醋酸銨緩沖溶液(pH=4.5)(B)作為流動(dòng)相，采用梯度洗脫28 min的方法，發(fā)現(xiàn)此法波動(dòng)較大，對部分成分的分離度不佳，影響其含量測定；隨后將流動(dòng)相B改為0.1%的磷酸水溶液，并將梯度洗脫延長至40 min，較前者，此法較為穩(wěn)定，且分離度均較佳，但前20 min出峰較少，運(yùn)行時(shí)間較長，效率較低；最后調(diào)整梯度洗脫程序，將方法穩(wěn)定在30 min。此法穩(wěn)定性較佳，峰形較好且簡單易行，適用于芍藥甘草湯的初步定性定量分析。

本實(shí)驗(yàn)的芍藥甘草湯是根據(jù)古代經(jīng)典名方開發(fā)要求進(jìn)行制備，其水煎液濃度較高，成分復(fù)雜，且不同成分的最大紫外吸收存在差異。根據(jù)實(shí)驗(yàn)及查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、芹糖基異甘草苷、異甘草苷、甘草苷這5種成分在230 nm附近響應(yīng)較高[13-14]，甘草酸銨和異甘草素的最大吸收波長于250 nm左右[15]，而單一在230 nm或250 nm下部分峰響應(yīng)較低，因此很難在單一波長下對其整體化學(xué)成分進(jìn)行表征。故最終選擇二極管陣列檢測器(PDA)定時(shí)波長：0～18 min，230 nm；18.01～30 min，250 nm。此波長下基線平穩(wěn)，峰響應(yīng)值較高。

本文建立了同時(shí)檢測芍藥甘草湯中7種水溶性成分的超高效液相色譜法(UPLC)，通過建立了指紋圖譜、相似度評價(jià)分析，發(fā)現(xiàn)由甘草3個(gè)產(chǎn)地5個(gè)批次、白芍2個(gè)產(chǎn)地4個(gè)批次飲片制得的11批芍藥甘草湯的相似度均大于0.98，表明該11批次芍藥甘草湯樣品間差異較小，制備工藝較為穩(wěn)定。隨后對 11批次樣品進(jìn)行含量測定，發(fā)現(xiàn)2個(gè)產(chǎn)地共4批次白芍、3個(gè)產(chǎn)地5批次甘草中各成分含量差異較小，RSD<15%，此結(jié)果與相似度評價(jià)結(jié)果趨于一致。綜上所述，本研究從定性、定量的角度，對經(jīng)典名方——芍藥甘草湯的物質(zhì)基準(zhǔn)進(jìn)行了初步研究，建立了芍藥甘草湯穩(wěn)定、簡便的UPLC測定方法，為其進(jìn)一步基礎(chǔ)研究、新劑型發(fā)展及臨床應(yīng)用提供參考。

表5 11批次芍藥甘草湯中7種成分含量 μg·mL-1