中藥砷劑治療BCR-ABL陽性慢性髓系白血病研究進展

王欣，譚詳敏，王梅竹，李紅玉

中藥砷劑治療BCR-ABL陽性慢性髓系白血病研究進展

王欣1，譚詳敏1，王梅竹1，李紅玉1，2

1.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000

BCR-ABL融合蛋白是慢性髓系白血?。–ML）的生物標(biāo)志物，也是目前針對CML進行藥物開發(fā)設(shè)計的重要靶點。中藥砷劑砒霜（As2O3）和雄黃（As4S4）在治療CML方面具有良好的效果，可通過多種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或分化，但砒霜的高毒性和雄黃的難溶性對其臨床使用帶來極大的困難。本文對目前中藥砷劑及新型砷劑雄黃微生物轉(zhuǎn)化液治療CML的研究和作用機制進行綜述，為中藥砷劑特別是雄黃的二次開發(fā)和應(yīng)用提供參考。

砒霜；雌黃；雄黃；雄黃微生物轉(zhuǎn)化液；凋亡；BCR-ABL；綜述

慢性髓系白血?。╟hronic myeloid leukemia，CML）是起源于造血干細(xì)胞的惡性腫瘤，是由9號染色體和22號染色體形成的費城染色體易位導(dǎo)致BCR和ABL基因融合，表達了BCR-ABL融合蛋白所引起的[1]。該融合蛋白能持續(xù)表達酪氨酸激酶活性，激活下游信號通路，引起細(xì)胞增殖失控[1]。目前，針對CML的藥物治療以酪氨酸激酶抑制劑為主，如伊馬替尼、達沙替尼等。這些抑制劑雖表現(xiàn)出良好的療效，但易產(chǎn)生耐藥性。砷劑是一種有毒化學(xué)物質(zhì)，但其藥用歷史悠久。近年來多項研究表明，砷劑在治療血液系統(tǒng)腫瘤方面效果顯著，能通過促進細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)細(xì)胞分化、激活自噬等多種方式發(fā)揮療效?，F(xiàn)就砷劑在治療CML中的研究進展作一綜述。

1 砒霜

砒霜也稱信石，有殺蟲、截瘧、消癰功效。經(jīng)提取的純凈砒霜為白色霜狀粉末，主要成分為As2O3。2000年美國食品藥品管理局批準(zhǔn)As2O3為治療急性早幼粒細(xì)胞白血病（APL）一線藥物，在治療其他血液腫瘤方面也有較好效果。

1.1 抑制細(xì)胞增殖

腫瘤細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期密切相關(guān)，As2O3通過阻滯細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖。正常細(xì)胞周期由細(xì)胞周期蛋白、細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶和細(xì)胞周期蛋白激酶抑制物共同調(diào)控。細(xì)胞周期蛋白D1作為細(xì)胞周期的正調(diào)控因子，使細(xì)胞周期由G1期進入S期[2]。而As2O3能顯著抑制細(xì)胞周期蛋白D1的表達，使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，最終抑制K562細(xì)胞的增殖[3-4]。細(xì)胞周期存在G1/S期和G2/M期2個限制點，As2O3也能使K562細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，從而抑制細(xì)胞增殖，其機制與細(xì)胞周期抑制基因p57的上調(diào)和細(xì)胞周期促進基因cyclinB的下調(diào)有關(guān)[5]。

1.2 促進凋亡

1.2.1 通過去甲基化調(diào)控細(xì)胞凋亡

甲基化相關(guān)沉默靶點-1（TMS1）是Masumoto等[6]在對細(xì)胞凋亡進行形態(tài)分析時發(fā)現(xiàn)的一種22 kD的蛋白，該蛋白具有Caspase募集域，在細(xì)胞凋亡時聚集成斑點出現(xiàn)，在細(xì)胞凋亡和免疫中發(fā)揮重要作用[7]。Li等[7]研究表明，TMS1在CML細(xì)胞K562中低表達，呈現(xiàn)甲基化狀態(tài)。而As2O3能以劑量依賴的方式上調(diào)TMS1的表達，通過降低DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1的活性，使TMS1去甲基化。同時誘導(dǎo)Bcl-2表達量升高，降低Bax的表達水平，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

1.2.2 直接調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達

細(xì)胞內(nèi)控制凋亡相關(guān)基因包括Tp53、Bcl-2、fas等。Tp53編碼的p53蛋白是一種腫瘤抑制因子，與細(xì)胞增殖、凋亡及腫瘤的發(fā)生有關(guān)?；罨膒53可進入線粒體中與促凋亡蛋白相互作用，導(dǎo)致線粒體膜通透性改變而釋放細(xì)胞色素C，引起Caspase級聯(lián)反應(yīng)，也可通過抑制抗凋亡蛋白進而促進凋亡發(fā)生[8]。As2O3能下調(diào)p53和Bcl-2蛋白的表達，使K562細(xì)胞周期阻滯于S期而進入凋亡程序[9]。As2O3也可調(diào)節(jié)FAS/FASL受體途徑，對多藥耐藥性細(xì)胞K562/ADM起到抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡的作用[10]。

1.2.3 其他途徑

As2O3聯(lián)合AMN107能引起K562r細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡，從而激活凋亡[11]。As2O3單獨作用于K562r細(xì)胞能降低活性氧水平，促發(fā)凋亡。與硼替佐米聯(lián)用凋亡效果更顯著[12]。另外，As2O3與組蛋白去乙酰化抑制劑SAHA聯(lián)合使用也能發(fā)揮促凋亡作用，其機制可能與AKT信號通路的抑制有關(guān)[13]。

1.3 誘導(dǎo)自噬性死亡

自噬是細(xì)胞在饑餓、能量缺乏等狀態(tài)及病理過程下維持真核細(xì)胞代謝穩(wěn)態(tài)和生存的一種機制，自噬水平高低可介導(dǎo)細(xì)胞的存活和死亡，與腫瘤的發(fā)生和抑制也有密切聯(lián)系[14]。

Cheng等[15]發(fā)現(xiàn)，As2O3處理K562和K562/ADM細(xì)胞后，在熒光顯微鏡下觀察到自噬泡的形成，透射電鏡下也觀察到自噬體出現(xiàn)。RT-PCR和Western blot結(jié)果表明，自噬物Beclin1和LC3表達上調(diào)，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達下調(diào)。表明As2O3能通過自噬介導(dǎo)K562和K562/ADM細(xì)胞死亡，而抗凋亡蛋白Bcl-2對自噬起調(diào)控作用。

1.4 下調(diào)融合蛋白BCR-ABL水平

研究表明，As2O3對野生型和T315I突變的伊馬替尼耐藥細(xì)胞內(nèi)BCR-ABL的mRNA表達無影響，但能降低BCR-ABL的蛋白表達，從而促進凋亡[16]。由于突變體細(xì)胞株內(nèi)還原型谷胱甘肽（GSH）含量低于野生型，同劑量As2O3可完全與突變細(xì)胞株內(nèi)巰基作用，使GSH氧化還原系統(tǒng)酶失去對活性氧的代謝能力，更易促發(fā)凋亡，從而對As2O3產(chǎn)生更高的敏感性。自噬途徑是真核細(xì)胞清除衰老和崩解的細(xì)胞器或局部細(xì)胞蛋白的主要方式之一。研究證明，在K562細(xì)胞中，As2O3可誘導(dǎo)高活性的自噬降解BCR-ABL。利用RNAi干擾Beclin1、Atg7、P62/SQSMT1等基因抑制自噬，使用特異性抑制劑將溶酶體中組織蛋白酶B抑制，均能逆轉(zhuǎn)BCR-ABL降解[17]。在激光共聚焦顯微鏡下可看到BCR-ABL與P62/SQSTM1、溶酶體共定位。因此As2O3可通過自噬的方式降解BCR-ABL。

2 雌黃

雌黃也稱石黃、黃金石，是與雄黃共生的砷類礦石，主要成分是As2S3?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》中雌黃被列為中品。《本草綱目》《千金翼方》等也對雌黃入藥有所記載，能解毒、殺蟲、消腫。2000年，研究報道了首例As2S3治療APL取得血液學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)與分子生物學(xué)完全緩解[18]。近年來，針對雌黃治療CML的研究主要集中在納米雌黃上。由于傳統(tǒng)雌黃顆粒較大、不溶于水、生物利用度低，臨床運用受限。林梅等[19]運用納米技術(shù)將雌黃制成納米粒，采用透射電鏡、X射線能譜進行表征，發(fā)現(xiàn)納米粒在不改變As2S3含量基礎(chǔ)上，顯著降低雌黃粒徑，提高生物利用度。此外，納米雌黃可抑制K562細(xì)胞增殖，激活凋亡相關(guān)基因和蛋白的表達，調(diào)控端粒酶活性等，在抗CML方面作用優(yōu)于傳統(tǒng)雌黃[19-22]。

2.1 誘導(dǎo)凋亡

2.1.1 調(diào)控凋亡相關(guān)基因表達

Survivin是凋亡抑制因子家族成員，能直接結(jié)合Caspase-3、Caspase-7，并抑制其活性[23]。納米雌黃能抑制K562增殖并誘導(dǎo)凋亡，效果優(yōu)于雌黃[20，22]。其機制是下調(diào)抗凋亡基因Survivin和Bcl-2表達，同時上調(diào)促凋亡基因Bax表達，從而誘導(dǎo)凋亡[19-20]。

2.1.2 下調(diào)端粒酶活性

端粒酶在腫瘤細(xì)胞中被過度激活，以彌補細(xì)胞分裂導(dǎo)致的端粒縮短，是細(xì)胞始終維持分裂狀態(tài)而不發(fā)生凋亡。納米雌黃能抑制端粒酶基因的表達、下調(diào)端粒酶活性而誘導(dǎo)凋亡，效果優(yōu)于傳統(tǒng)雌黃[19，21]。

3 雄黃

雄黃也是一種含砷礦物藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。雄黃主要成分為As4S4，對CML也具有良好的治療效果，目前已知的作用機理如下。

3.1 促進凋亡

3.1.1 下調(diào)miRNA表達

MicroRNA（miR）是一種內(nèi)源性非編碼的小分子RNA，直接結(jié)合靶基因，對其mRNA進行剪切修飾或抑制翻譯過程調(diào)控基因的表達，在K562細(xì)胞中，BCR-ABL下游分子RalA是miR181a的直接靶點，過表達的miR181a直接靶向RalA基因下調(diào)RalA的mRNA和蛋白表達，從而抑制細(xì)胞周期并誘導(dǎo)凋亡[24]。Gong等[25]發(fā)現(xiàn)，雄黃能以劑量依賴的方式降低K562細(xì)胞中miR181的表達，進而下調(diào)Bcl-2，增強Casepase-3活性，誘導(dǎo)凋亡。在過表達miR181的K562中，加入雄黃可抑制miR181的過表達而使凋亡增加。

3.1.2 下調(diào)端粒酶活性

端粒是存在于染色體末端的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，與端粒相關(guān)蛋白共同保護染色體的完整性，還能控制細(xì)胞周期。正常細(xì)胞中端粒會隨著細(xì)胞分裂而縮短，但在腫瘤細(xì)胞中，由于端粒酶被激活，端粒始終保持較短的長度使細(xì)胞不斷分裂[26]。雄黃能以劑量依賴的方式抑制K562細(xì)胞中的端粒酶活性，促進細(xì)胞凋亡發(fā)生[27]。

3.1.3 調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子

STAT5是BCR-ABL下游蛋白分子，被JAK磷酸化后將BCR-ABL致癌信號傳到細(xì)胞核內(nèi)導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生惡變。雄黃能降低JAK2表達，抑制STAT5的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，同時上調(diào)促凋亡蛋白Bax表達，最終激活Caspase-3、降解PARP，引起細(xì)胞凋亡[28]。

3.2 降解BCR-ABL

3.2.1 泛素化降解BCR-ABL

泛素-蛋白酶體通路是細(xì)胞選擇性降解受體酪氨酸激酶的主要途徑，其降解過程包括2個階段：第一個階段是泛素與底物共價連接使底物帶上泛素化標(biāo)記，第二個階段是泛素化的底物通過內(nèi)吞噬進入細(xì)胞，在蛋白酶體內(nèi)水解成多肽或氨基酸[29]。c-CBL蛋白是造血組織及其他組織中廣泛表達的主要細(xì)胞質(zhì)蛋白，該蛋白具有保守的氨基端。氨基端有2個重要的結(jié)構(gòu)域，一個是酪氨酸激酶結(jié)合（TKB）域，另一個是C3HC4鋅結(jié)合環(huán)指（RF）結(jié)構(gòu)域。TKB域主要與酪氨酸激酶或其他底物結(jié)合，RF域與泛素結(jié)合酶E2相結(jié)合，兩結(jié)構(gòu)的存在使其具有E3連接酶活性，從而介導(dǎo)泛素化，最終使底物降解[30]。

Mao等[30]研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，雄黃組c-CBL含量升高，而BCR-ABL含量降低。構(gòu)建c-CBL過表達的K562細(xì)胞模型，觀察到BCR-ABL含量降低，而通過siRNA敲除c-CBL的K562細(xì)胞，BCR-ABL含量升高。表明c-CBL確實影響B(tài)CR-ABL含量。為證實c-CBL介導(dǎo)BCR-ABL泛素化降解的假設(shè)，構(gòu)建野生型和c-CBL突變的K562細(xì)胞模型，野生型細(xì)胞中，BCR-ABL泛素化降解水平高于突變型。通過對c-CBL代謝情況分析，發(fā)現(xiàn)雄黃并不能促進c-CBL表達，而是通過抑制其泛素化降解的方式升高c-CBL的水平。進一步實驗表明，雄黃靶向于RF結(jié)構(gòu)域，證明其通過介導(dǎo)泛素化-蛋白體途徑降解BCR-ABL。

3.2.2 自噬性降解BCR-ABL

小窩蛋白（Caveolin）是由Caveolin基因家族編碼的分子量為21～24 kD膜蛋白，存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞膜[31]。Cav-1基因是Caveolin基因家族成員之一，是胞膜窖主要結(jié)構(gòu)成分，與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲及多藥耐藥有關(guān)[32]。Shi等[33]發(fā)現(xiàn)，雄黃納米粒處理后K562細(xì)胞BCR-ABL和磷酸化BCR- ABL蛋白表達均低于對照組。進一步實驗表明，雄黃納米粒可通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路，提高Cav-1蛋白表達，激活K562細(xì)胞自噬，促使融合蛋白降解。

4 雄黃微生物轉(zhuǎn)化液

雄黃雖然具有良好的藥用價值，但其溶解度極低，難以應(yīng)用于臨床。為改善雄黃的難溶性，對雄黃及相關(guān)藥物進行二次開發(fā)和改良，本實驗室利用氧化亞鐵硫桿菌，開發(fā)出一整套微生物浸出工藝，成功將雄黃經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化得到雄黃微生物轉(zhuǎn)化液（RTS）[34]，顯著提高雄黃的生物利用度[35-37]，其抗肺癌、肝癌和白血病效果優(yōu)于傳統(tǒng)雄黃及As2O3[35-40]。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，RTS對CML及多藥耐藥CML均有較好的生長抑制效果，主要涉及調(diào)控以下幾個關(guān)鍵點。

4.1 調(diào)控多藥耐藥相關(guān)蛋白表達

多藥耐藥產(chǎn)生的機理包括藥物運轉(zhuǎn)體的改變、藥物在細(xì)胞內(nèi)代謝變化、藥物在細(xì)胞內(nèi)靶點變化等。其中，P-糖蛋白（P-gp）是最受關(guān)注的靶點。P-gp作為藥物轉(zhuǎn)運泵，當(dāng)其構(gòu)象改變時會將藥物泵出細(xì)胞外，使胞內(nèi)藥物濃度降低，從而降低抗腫瘤效應(yīng)[41]。研究表明，0.2 μg/mL RTS作用4 h后，能下調(diào)K562/ADM細(xì)胞多藥耐藥基因1的mRNA水平，降低P-gp的表達，而As2O3和雄黃無此作用。細(xì)胞內(nèi)砷含量測定結(jié)果顯示，用0.2 μg/mL As2O3、雄黃、RTS作用K562/ADM細(xì)胞4 h，RTS處理的細(xì)胞內(nèi)砷含量分別是As2O3和雄黃的2、16倍[35]。

4.2 增加細(xì)胞對砷的敏感性

水通道蛋白9（AQP9）是一種與砷跨膜轉(zhuǎn)運相關(guān)的水通道蛋白，與白血病細(xì)胞對砷劑的敏感性有關(guān)[42]。Wang等[35]發(fā)現(xiàn)，相較于As2O3和雄黃，RTS能顯著提高K562、K562/ADM細(xì)胞中AQP9的mRNA和蛋白表達，增加2種細(xì)胞內(nèi)砷蓄積量，且相同時間內(nèi)RTS在K562/ADM細(xì)胞中蓄積量遠(yuǎn)高于K562。

4.3 激活自噬

Wang等[37]研究發(fā)現(xiàn)，RTS、As2O3、雄黃均能以時間和劑量依賴的方式抑制K562和K562/ADM細(xì)胞增殖，但RTS效果優(yōu)于As2O3和雄黃，且RTS對K562/ADM比對K562作用更顯著。進一步實驗發(fā)現(xiàn)，RTS可激活自噬并降解融合蛋白BCR-ABL。RTS處理K562/ADM后，自噬泡增多，LC3-Ⅱ、Beclin1和mTOR表達升高，但自噬抑制劑氯喹（CQ）可部分逆轉(zhuǎn)這些現(xiàn)象的產(chǎn)生，表明RTS可激活自噬。同時，cleaved Caspase-3蛋白表達升高，Bcl-2和BCR-ABL蛋白表達下降；使用CQ抑制自噬后，這種效應(yīng)仍可被逆轉(zhuǎn)。免疫熒光染色實驗發(fā)現(xiàn)RTS能增強LC3、P62/SQTM1與BCR-ABL的共定位，表明RTS能激活CML細(xì)胞自噬，可促進BCR-ABL的降解，發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。

5 小結(jié)

砷劑雌黃和雄黃在白血病治療中有較好的療效，能引發(fā)包括CML細(xì)胞在內(nèi)的白血病細(xì)胞發(fā)生凋亡、自噬或分化，同時不良反應(yīng)和毒副作用較As2O3略低。這些成果都使砷劑在治療白血病的研究和應(yīng)用方面受到普遍關(guān)注。雄黃和雄黃復(fù)方有較好的臨床價值，但雄黃的不溶性使其臨床應(yīng)用受到嚴(yán)重制約。本實驗室將生物冶金技術(shù)引入雄黃炮制過程，借助特定微生物得到RTS，證實其可通過激活凋亡和自噬有效抑制CML的增殖，并且在解決耐藥性上具有較好的研究前景。我們近期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RTS對伊馬替尼耐藥的CML細(xì)胞也具有較強的增殖抑制作用和融合蛋白降解效應(yīng)。今后我們將結(jié)合T315I突變的BCR-ABL陽性CML細(xì)胞模型，繼續(xù)進行深入研究，為RTS相關(guān)研究和雄黃二次開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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Research Progress inTCM Arsenic for Treatment of BCR-ABL Positive Chronic Myeloid Leukemia

WANG Xin1, TAN Xiangmin1, WANG Meizhu1, LI Hongyu1,2

The BCR-ABL fusion protein is a biomarker of chronic myeloid leukemia (CML), which is currently an important target for drug development and design of CML. TCM arsenic (As2O3) and realgar (As4S4) have been proven to show significantly efficacy in the treatment of CML, which can induce apoptosis or differentiation through many approaches. However, the high toxicity of arsenic and the poor solubility of realgar hamper their clinical application. In this article, the research progress and mechanism of the current TCM arsenic and a novel arsenic agent, realgar transforming solution in the treatment of CML were reviewed, which could provide references for the secondary development and application of TCM arsenic, especially realgar.

arsenic; yellow arsenic; realgar; realgar transforming solution; apoptosis; BCR-ABL; review

R2-05；R285

A

1005-5304(2020)06-0136-05

10.3969/j.issn.1005-5304.201905205

國家自然科學(xué)基金（81403145、81560715）；國家科技重大專項－重大新藥創(chuàng)制（2015ZX09501-004-008）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金（lzujbky-2018-136、lzujbky-2017-206）

李紅玉，E-mail：lihy@lzu.edu.cn

（2019-05-15）

（2019-06-06；編輯：華強）