基于超高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)技術(shù)優(yōu)選炒酸棗仁-醋五味子藥對(duì)最佳配伍比例

吳溪，孟楣，高家榮

基于超高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)技術(shù)優(yōu)選炒酸棗仁-醋五味子藥對(duì)最佳配伍比例

吳溪，孟楣，高家榮

安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230031

通過超高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)技術(shù)測(cè)定不同配伍比例炒酸棗仁-醋五味子藥對(duì)中酸棗仁皂苷A含量，優(yōu)選最佳配伍比例，為臨床用藥提供參考。設(shè)置不同劑量配比的炒酸棗仁-醋五味子藥對(duì)（1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1），采用Acquity UPLC BEHC18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，乙腈-水為流動(dòng)相梯度洗脫，流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量1 μL，酸棗仁皂苷A色譜峰與相鄰色譜峰的分離度不低于1.5，測(cè)定藥對(duì)中酸棗仁皂苷A含量。酸棗仁皂苷A在0.010 05～0.100 5 μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，回歸方程為＝1 276 209.888 91－162 396.863 01（＝0.999 93），重復(fù)性、穩(wěn)定性和回收率良好。上述9個(gè)不同配伍比例炒酸棗仁-醋五味子藥對(duì)的酸棗仁皂苷A濃度依次為0.015 9、0.015 3、0.016 9、0.011 4、0.013 7、0.013 2、0.018 4、0.014 6、0.010 3 mg/mL。本研究揭示炒酸棗仁-醋五味子配伍比例為7∶3時(shí)酸棗仁皂苷A含量最高，可為臨床養(yǎng)心安神治法遣方用藥提供依據(jù)。

超高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法；炒酸棗仁-醋五味子藥對(duì)；配伍比例；酸棗仁皂苷A

酸棗仁、五味子兩藥在中醫(yī)經(jīng)典安神方劑中多配伍使用，是臨床常用藥對(duì)之一，該藥對(duì)具有滋陰養(yǎng)血、安神鎮(zhèn)驚、消除疲勞、增加耐力等功效，用于治療神經(jīng)衰弱、失眠癥、消渴、慢性蕁麻疹等。本課題前期采用計(jì)算機(jī)編程及關(guān)鍵詞映射法，對(duì)以《中醫(yī)方劑大辭典》為基礎(chǔ)的中醫(yī)方劑數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索并手工檢索2015年版《中華人民共國(guó)藥典》，發(fā)現(xiàn)含有酸棗仁-五味子藥對(duì)的方劑262首，二者的配伍比例有44種，以1∶1、2∶1、3∶1、1∶2、2∶3居多[1]。通過查閱其他文獻(xiàn)得到藥對(duì)的配伍比例一般按1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1進(jìn)行研究[2]，與統(tǒng)計(jì)比例比較接近，因此確定上述9個(gè)比例對(duì)酸棗仁-五味子藥對(duì)進(jìn)行研究。酸棗仁-五味子藥對(duì)配伍多以酸棗仁為主，故以酸棗仁為主要研究目標(biāo)。酸棗仁皂苷是酸棗仁中含量高的化學(xué)成分，其中達(dá)瑪烷型三萜皂苷類化合物如酸棗仁皂苷A是酸棗仁中最重要的皂苷。現(xiàn)代藥理研究表明，酸棗仁皂苷類是其鎮(zhèn)靜安神的主要藥效成分，與化學(xué)類鎮(zhèn)靜催眠藥相比，酸棗仁活性成分有多靶點(diǎn)、多效應(yīng)器官等特點(diǎn)[3-5]。本研究采用超高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)（UPLC-ELSD）技術(shù)測(cè)定酸棗仁皂苷A含量，從而優(yōu)選酸棗仁-五味子藥對(duì)的最佳配伍比例，為臨床中醫(yī)方劑配伍提供參考。

1 儀器與試藥

Waters Acquity H-Class UPLC超高效液相色譜儀，Acquity ELSD檢測(cè)器及Waters Empower2軟件（美國(guó)Waters公司），Acquity UPLC BEHC18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），BP211D電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）。

酸棗仁皂苷A對(duì)照品（批號(hào)110734-200509，含量99.9%），中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），水為屈臣氏純凈水，其他試劑均為分析純。酸棗仁藥材產(chǎn)地為河北贊皇縣，五味子藥材產(chǎn)地為遼寧丹東市，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院孟楣主任中藥師鑒定，分別為鼠李科植物酸棗Mill. var. spinosa（Bunge）Hu ex H. F. Chou的干燥成熟種子和木蘭科植物五味子（Turcz.）Baill.的干燥成熟果實(shí)，依據(jù)《安徽省中藥飲片炮制規(guī)范》炒黃方法和醋制方法[6]對(duì)酸棗仁和五味子藥材分別進(jìn)行炮制，得到炒酸棗仁和醋五味子。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Acquity UPLC BEHC18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），ELSD檢測(cè)器，流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量1 μL，流動(dòng)相A為乙腈、B為水，梯度洗脫程序見表1[7-9]。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序（%）

時(shí)間流動(dòng)相A流動(dòng)相B 0 min 20.080.0 1.5 min 40.060.0 2.5 min 40.060.0 3.5 min 70.030.0 4.0 min100.00 5.0 min 20.080.0 7.0 min 20.080.0

2.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱取酸棗仁皂苷A對(duì)照品適量，加甲醇250 mL制成0.020 1 mg/mL的對(duì)照品溶液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，置5 ℃冰箱備用。

2.3 供試品溶液制備

分別取炒酸棗仁、醋五味子（過2號(hào)篩，24目），按1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1比例稱量，得到1～9號(hào)樣品（見表2），分別置于50 mL圓底燒瓶中，將粉末混勻，精密加入60 mL甲醇，加熱回流1 h，放冷，過濾，濾液蒸干，分別加入10 mL蒸餾水溶解，倒入離心管中，3000 r/min離心5 min，取上清液，加石油醚（60～80 ℃）萃取3次，每次15 mL，棄去石油醚層，水層加入5%KOH溶液30 mL，用水飽和正丁醇萃取4次，每次20 mL，合并正丁醇層，用正丁醇飽和氨水洗滌2次，每次10 mL，棄去洗液，揮干正丁醇，殘?jiān)蛹状级ㄈ葜? mL容量瓶中，即得。

表2 不同配伍比例炒酸棗仁-醋五味子藥對(duì)樣品（g）

編號(hào)炒酸棗仁醋五味子 11.0049.008 22.0038.002 33.0037.001 44.0036.001 55.0025.004 66.0024.005 77.0013.000 88.0032.002 99.0021.000

2.4 陰性對(duì)照溶液制備

取醋五味子，按供試品溶液制備方法制備，即得。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液、供試品溶液（1號(hào)）和陰性對(duì)照溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，色譜圖見圖1。在該色譜條件下，酸棗仁皂苷A保留時(shí)間為4.1 min，酸棗仁皂苷A色譜峰與相鄰色譜峰的分離度＞1.5，表明樣品中的酸棗仁皂苷A分離度良好，陰性對(duì)照及其他成分無(wú)干擾。

注：A.對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照

2.5.2 線性關(guān)系的考察

精密吸取對(duì)照品溶液，制成酸棗仁皂苷A濃度分別為2.01、4.02、8.04、12.06、16.08、20.1 μg/mL的系列溶液，各進(jìn)樣5 μL。以酸棗仁皂苷A濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程＝1 276 209.888 91－162 396.863 01，＝0.999 93。結(jié)果表明，酸棗仁皂苷A在0.010 05～0.100 5 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.3 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，結(jié)果RSD＝0.12%，表明精密度良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取2號(hào)供試品溶液，分別于0、2、4、8、12 h按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定酸棗仁皂苷A的峰面積，結(jié)果RSD＝0.14%，表明溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取2號(hào)樣品6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算酸棗仁皂苷A含量，結(jié)果RSD＝0.92%，表明重復(fù)性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗(yàn)

按照2號(hào)樣品比例分別減半稱取樣品6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果平均回收率為96.81%，RSD＝1.62%，見表3。

表3 酸棗仁皂苷A加樣回收率試驗(yàn)

取樣量 /g樣品中含量 /mg加入量 /mg測(cè)得量 /mg回收率 /%平均回收率 /%RSD /% 1.0010.076 40.060 300.134 1595.8 1.0230.074 70.060 300.132 2995.5 1.0170.075 20.060 300.133 9497.4 1.0200.075 00.075 380.149 4898.8 1.0050.076 10.075 380.150 2398.396.811.62 1.0350.073 90.075 380.145 3794.8 1.0130.075 50.090 450.165 0398.9 1.0050.076 10.090 450.162 3695.4 1.0510.072 80.090 450.160 0396.4

2.6 樣品含量測(cè)定

分別吸取9個(gè)配伍比例的供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算酸棗仁皂苷A含量，結(jié)果見表4，酸棗仁皂苷A濃度變化見圖2?？梢?，隨著炒酸棗仁配伍劑量增大、醋五味子配伍劑量減小，酸棗仁皂苷A的濃度變化呈波型；當(dāng)炒酸棗仁與醋五味子配伍比例為7∶3時(shí)，酸棗仁皂苷A含量最高。

表4 不同配伍比例炒酸棗仁-醋五味子藥對(duì)酸棗仁皂苷A濃度

樣品編號(hào)炒酸棗仁∶醋五味子酸棗仁皂苷A/（mg/mL） 11∶90.015 9 22∶80.015 3 33∶70.016 9 44∶60.011 4 55∶50.013 7 66∶40.013 2 77∶30.018 4 88∶20.014 6 99∶10.010 3

圖2 不同配伍比例炒酸棗仁-醋五味子藥對(duì)中酸棗仁皂苷A濃度變化曲線

3 討論

本研究預(yù)試驗(yàn)中比較了加熱回流提取法和超聲提取法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)加熱回流1 h可使酸棗仁皂苷A充分溶出，因此選擇加熱回流提取法進(jìn)行供試品的提取。深入比較樣品溶液的預(yù)處理方法，對(duì)于回流提取后樣品直接蒸干定容和樣品蒸干后增加一系列處理步驟2種方法進(jìn)行比較，后者效果較好，通過石油醚萃取除去脂溶性成分，以及其他溶劑的洗滌，可避免雜質(zhì)的干擾。

酸棗仁皂苷A為三萜皂苷類成分，紫外吸收效果差，不宜采用二極管陣列檢測(cè)器，而蒸發(fā)光散射檢測(cè)器為質(zhì)量型通用檢測(cè)器，可檢測(cè)揮發(fā)性低于流動(dòng)相的化合物。本試驗(yàn)將超高效液相色譜用于酸棗仁皂苷A的研究，經(jīng)UPLC-ELSD測(cè)定，與普通HPLC采用C18填料的色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）比較，分析速度提高了4倍以上，具有較高的分析通量，同時(shí)也具有良好的準(zhǔn)確度、精密度和耐用性，方法可靠，重復(fù)性好。

酸棗仁與五味子從古至今有多種炮制方法，及至現(xiàn)代，酸棗仁的主要炮制方法為清炒，五味子主要為醋制。研究表明，酸棗仁通過炒制能夠達(dá)到“生效熟增”的目的，主要與藥效相關(guān)的主要化學(xué)成分含量變化有關(guān)[10]。中藥制劑發(fā)揮藥理、藥效作用與其化學(xué)成分含量和配伍比例密切相關(guān)，中藥量效關(guān)系是確定臨床用藥劑量的依據(jù)，也是確保用藥有效性和安全性的基礎(chǔ)。前期文獻(xiàn)研究表明酸棗仁與五味子藥對(duì)配伍以酸棗仁為主，但最佳配伍比例并不確定。本試驗(yàn)通過考察酸棗仁主要有效成分酸棗仁皂苷A含量變化，結(jié)果顯示炒酸棗仁與醋五味子的最佳配伍比例為7∶3，在化學(xué)成分上為炒酸棗仁與醋五味子的合理配伍提供了依據(jù)，可指導(dǎo)臨床遣方用藥。

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Optimization Compatibility Ratio of Fried Ziziphi Spinosae Semen-Vinegated Schisandra Chinensis Fructus Based on UPLC-ELSD Technique

WU Xi, MENG Mei, GAO Jiarong

To determine the contents of Jujubaside A with different compatibility ratios of fried Ziziphi Spinosae Semen - vinegated Schisandra Chinensis Fructus based on UPLC-ELSD technique; To select the best compatibility ratio; To provide references for clinical medication.Different compatibility ratios of fried Ziziphi Spinosae Semen and vinegated Schisandra Chinensis Fructus were set as 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2, and 9:1. Acquity UPLC BEHC18 (2.1 mm × 50 mm, 1.7 μm) was used as the chromatographic column to detect the contents of Jujubaside A; acetonitrile-water (gradient elution) was used as the mobile phase with 0.3 mL/min flow rate; the detector was ELSD; the column temperature was 30 ℃; the volume was 1 μL. The separation of Jujubaside A chromatographic peak from adjacent chromatographic peaks was not less than 1.5. The contents of Jujubaside A with different compatibility ratios of fried Ziziphi Spinosae Semen - vinegated Schisandra Chinensis Fructus were detected.The regression equation of Jujubaside A was=1 276 209.888 91- 162 396.863 01 (=0.999 93) in the range of 0.010 05–0.100 5 μg, showing a good linear relationship. The repeatability, stability and recovery rate were fine as well. The concentrations of Jujubaside A were 0.015 9, 0.015 3, 0.016 9, 0.011 4, 0.013 7, 0.013 2, 0.018 4, 0.014 6, 0.010 3 mg/mL in the above nine different compatibility ratios of fried Ziziphi Spinosae Semen - vinegated Schisandra Chinensis Fructus.When the compatibility ratio of fried Ziziphi Spinosae Semen - vinegated Schisandra Chinensis Fructus is 7:3, the content of Jujubaside A is the highest, which can provide references for prescribing and medication of clinical method of tranquilizing by nourishing the heart.

UPLC-ELSD; fried Ziziphi Spinosae Semen - vinegated Schisandra Chinensis Fructus; compatibility ratios; Jujubaside A

R284.1

A

1005-5304(2020)06-0065-04

10.3969/j.issn.1005-5304.201904234

安徽高校省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目（KJ2012Z220）；安徽中醫(yī)學(xué)院青年科學(xué)研究基金（2013qn009）

高家榮，E-mail：zyfygjr2006@126.com

（2019-04-16）

（2019-05-08；編輯：陳靜）