探討低劑量地西他濱對(duì)CD4陽(yáng)性T細(xì)胞功能的影響

韓 笑，郭業(yè)磊，代漢仁，佟 川，陳德云，王 瑤，韓為東

解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 生物治療病區(qū)/分子免疫室，北京 100853

長(zhǎng)期以來(lái)基因組突變一直被認(rèn)為是腫瘤形成的核心因素，但是近些年的研究表明，表觀遺傳機(jī)制在腫瘤疾病的進(jìn)展中同樣發(fā)揮了重要的作用[1]。DNA甲基化、組蛋白修飾以及非編碼RNA調(diào)節(jié)等是表觀遺傳修飾的主要機(jī)制，因此靶向或逆轉(zhuǎn)表觀遺傳修飾已經(jīng)成為了極具潛力的腫瘤治療方法[2-3]。其中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(DNA methyltransferase inhibitor，DNMTi)能夠發(fā)揮對(duì)DNMTs抑制的表觀遺傳效應(yīng)而產(chǎn)生抗腫瘤作用。雖然DNMTi對(duì)腫瘤抑制基因重新激活的研究更為廣泛，但有證據(jù)表明DNMTs的抑制會(huì)產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞外的免疫調(diào)節(jié)作用。去甲基化修飾對(duì)于T細(xì)胞的耗竭至關(guān)重要，其能夠抑制耗竭T細(xì)胞中效應(yīng)細(xì)胞功能、增殖、代謝活性和組織歸巢所涉及的關(guān)鍵基因[4-6]。最新研究也證實(shí)DNA甲基化促進(jìn)了T細(xì)胞耗竭并限制了PD-1抑制劑的療效，而DNA去甲基化則增強(qiáng)了PD-1抑制劑介導(dǎo)的T細(xì)胞再生[7]。目前有關(guān)DNMTi的研究更多集中在腫瘤細(xì)胞、T細(xì)胞以及CD8陽(yáng)性T細(xì)胞亞群，對(duì)CD4陽(yáng)性T細(xì)胞的研究報(bào)道較少[8-10]。去甲基化藥物地西他濱(5-氮雜-2'-脫氧胞嘧啶核苷；decitabine，DAC)是一種獨(dú)特的胞嘧啶類似物，能抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，逆轉(zhuǎn)甲基化，并能在體內(nèi)和體外重新激活表觀遺傳沉默的基因[11-12]。本研究采用體外添加DAC對(duì)CD4陽(yáng)性T細(xì)胞進(jìn)行修飾，觀察其對(duì)CD4陽(yáng)性T細(xì)胞增殖、記憶以及細(xì)胞毒性的影響，為地西他濱增強(qiáng)CD4陽(yáng)性T細(xì)胞抗腫瘤功能的研究提供探索方向。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 Raji細(xì)胞(人Burkitt's淋巴瘤細(xì)胞系，美國(guó)ATCC)。

2 主要試劑和儀器 PBS緩沖液，Buffer緩沖液(PBS+0.5%人血清白蛋白+2 mmol/L EDTA)，人外周血淋巴細(xì)胞分離液，X-VIVO15培養(yǎng)基(瑞士 Lonza)，IL-2(美國(guó) PeproTech)，CD3單克隆抗體(日本Takara)，磁力分選柱，人類CD4+T細(xì)胞磁珠分選試劑盒(德國(guó)Miltenyi)，人IL-2、FasL、IFN-γ以及TNF-αValukineTMELISA試劑盒(美國(guó)NOVUS)，流式細(xì)胞抗體CD3-APC、CD4-FITC、CD8-PerCP、CD45RO-APC、CD62L-PE，醫(yī)用離心機(jī)(中國(guó)北京京立離心機(jī))，流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman)，個(gè)人型細(xì)胞分析儀(韓國(guó)NanoEntek)，多功能酶標(biāo)儀VarioskanTMLUX(美國(guó)Thermo Fisher)，CO2培養(yǎng)箱。

3 提取外周血淋巴細(xì)胞 采集3名25 ～ 30歲男性健康供者靜脈血各60 ml(均取得健康供者知情同意)，置于抗凝管中，輕輕搖勻，取6個(gè)50 ml離心管各加入淋巴細(xì)胞分離液15 ml，然后沿管壁緩緩加入0.9%氯化鈉注射液稀釋的靜脈血各35 ml，20℃、2 000 r/min離心20 min，吸取中間環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層，PBS緩沖液洗兩遍。

4 分選CD4+T淋巴細(xì)胞 將上述外周血淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)，每107個(gè)細(xì)胞重懸于40μl Buffer緩沖液，并加入10μl Biotin-Antibody Cocktail，混勻放入4℃冰箱5 min，加入30μl Buffer及20μl Anti-Biotin MicroBeads充分混勻放入4℃冰箱10 min。將磁力柱吸附于磁力架上，用3 ml Buffer沖洗磁力柱，將上述制備好的細(xì)胞懸液加入磁力柱中收集流出的細(xì)胞即CD4+T細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分析CD4+T細(xì)胞的分選效率。

5 細(xì)胞培養(yǎng) 磁珠分選出的CD4+T細(xì)胞直接懸浮在于含有anti-CD3mAb(500 ng/μl)和IL-2(300 U/ml)的培養(yǎng)基中，放置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中。3 d后將細(xì)胞移至新的培養(yǎng)瓶中懸浮培養(yǎng)，每3 d添加新鮮的培養(yǎng)基及IL-2。

6 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞共分為6組，每組6孔。初始細(xì)胞數(shù)1×105/孔，其中CD4+T細(xì)胞組作為對(duì)照組，其他各組按照10 nmol/L、30 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L和1 000 nmol/L添加DAC。分別于3 d、7 d、10 d和14 d使用個(gè)人型細(xì)胞分析儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以細(xì)胞數(shù)/初始細(xì)胞數(shù)作為細(xì)胞增殖倍數(shù)。通過(guò)不同濃度DAC對(duì)細(xì)胞增殖的影響，篩選出促進(jìn)增殖最佳的最低劑量組。按照上述實(shí)驗(yàn)分組，分別在不同的時(shí)間點(diǎn)即0 d、1 d、2 d、5 d和7 d添加DAC，同樣的方法在3 d、7 d、10 d和14 d計(jì)算細(xì)胞增殖倍數(shù)，篩選出促進(jìn)增殖最佳的時(shí)間組，并最終確定添加DAC的最佳劑量和時(shí)間，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。

7 細(xì)胞表型檢測(cè) 上述各組細(xì)胞在7 d時(shí)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型，以CD45RO+CD62L+作為中央記憶型T細(xì)胞(central memory Tcell，TCM)，以CD45RO-CD62L+作為干細(xì)胞樣中央記憶型T細(xì)胞(stem cell-like memory Tcell，TSCM)。

8 腫瘤細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn) 采用基于阻抗的腫瘤細(xì)胞殺傷試驗(yàn)(xCELLigence)來(lái)檢測(cè)靶細(xì)胞的持續(xù)溶解。Raji細(xì)胞被電鍍?cè)?6孔電阻底板中，每孔5×103個(gè)細(xì)胞。24 h后，加入5×104個(gè)效應(yīng)細(xì)胞。共分3組，每組6孔，包括DAC處理的CD4+T細(xì)胞+Raji細(xì)胞組、CD4+T細(xì)胞+Raji細(xì)胞(對(duì)照組)以及不添加效應(yīng)細(xì)胞的Raji細(xì)胞組。每15 min集測(cè)量1次基于阻抗的標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞指數(shù)，監(jiān)測(cè)時(shí)間為96 h。標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞指數(shù)則通過(guò)測(cè)量由Raji腫瘤細(xì)胞黏附引起的晶體管平板上的電流阻抗確定。

9 細(xì)胞因子檢測(cè) 細(xì)胞分2組，每組6孔，細(xì)胞數(shù)5×105/孔，包括DAC處理的CD4+T細(xì)胞和對(duì)照組CD4+T細(xì)胞。各組細(xì)胞培養(yǎng)7 d時(shí)，分別加入Raji細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)5×104/孔。24 h后使用ELISA試劑盒和多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)IL-2、FasL、IFN-γ和TNF-α的分泌。

10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS22.0進(jìn)行研究資料分析。觀測(cè)資料主要為計(jì)量數(shù)據(jù)，均通過(guò)正態(tài)性檢驗(yàn)，以-x±s描述。兩組間的比較為成組t檢驗(yàn)或校正t檢驗(yàn)(統(tǒng)計(jì)量為t)，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

結(jié) 果

1 CD4+T細(xì)胞的分選效率 通過(guò)人類CD4+T細(xì)胞磁珠分選試劑盒和磁力柱對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行分選，磁力柱中流出來(lái)的細(xì)胞即CD4+T細(xì)胞，經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞儀分析CD4+T細(xì)胞的分選效率為95.36% ～ 97.51%，能夠達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需要的純度(流式代表圖見(jiàn)圖1)。

圖1 分選CD4+ T細(xì)胞Fig. 1 Selection of CD4+ subsets from Tcells

2 添加DAC的最低劑量及最佳時(shí)間 通過(guò)不同劑量和添加時(shí)間篩選出促進(jìn)CD4+T細(xì)胞增殖最佳的DAC劑量和時(shí)間：1)劑量：5種不同劑量DAC實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，3 d時(shí)各組細(xì)胞均出現(xiàn)增殖，其中200 nmol/L和1 000 nmol/L組細(xì)胞增殖倍數(shù)顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，其他各組和對(duì)照組細(xì)胞的增殖倍數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。7 d時(shí)各組與對(duì)照組細(xì)胞的增殖倍數(shù)差異顯著，其中10 nmol/L、30 nmol/L和100 nmol/L組細(xì)胞增殖倍數(shù)顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，200 nmol/L和1 000 nmol/L組細(xì)胞增殖倍數(shù)顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。10 d時(shí)各組間細(xì)胞增殖均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。14 d時(shí)10 nmol/L、30 nmol/L和100 nmol/L組細(xì)胞增殖倍數(shù)顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，200 nmol/L和1 000 nmol/L組細(xì)胞增殖倍數(shù)顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。由此篩選出促進(jìn)細(xì)胞增殖效果最佳的最低DAC劑量為10 nmol/L，并作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的使用劑量(圖2A)。2)時(shí)間：確定DAC添加實(shí)驗(yàn)劑量后，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探索DAC添加時(shí)間：分別在5個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)添加10 nmol/L DAC。結(jié)果顯示，3 d時(shí)各時(shí)組間的細(xì)胞增殖均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。7 d、10 d和14 d時(shí)，Day0、Day1和Day2組的細(xì)胞增殖倍數(shù)均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，而Day5和Day7組細(xì)胞增殖倍數(shù)與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。另外，Day0、Day1和Day2組的組間細(xì)胞增殖倍數(shù)以及Day5和Day7組的組間細(xì)胞增殖倍數(shù)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在細(xì)胞培養(yǎng)3 d以后添加DAC，幾乎不再影響細(xì)胞的增殖。因此，由此最終確定了添加DAC的最低劑量和最佳時(shí)間為10 nmol/L、Day 0(圖2B)。

3 DAC修飾的CD4+T細(xì)胞的記憶表型增強(qiáng) 7 d時(shí)檢測(cè)記憶細(xì)胞表型(CD45RO，CD62L)。結(jié)果顯示，TCM表型(CD45RO+CD62L+)較對(duì)照組顯著增加(P＜0.001)，TSCM表型(CD45RO-CD62L+)較對(duì)照組也顯著增加(P＜0.05)。結(jié)果提示DAC有助于提高CD4+T細(xì)胞記憶性，中央記憶型T細(xì)胞以及干細(xì)胞樣中央記憶型T細(xì)胞的比例增加最為顯著(圖3)。

圖2 不同劑量和時(shí)間點(diǎn)添加DAC對(duì)CD4+ T細(xì)胞增殖的影響(aP＜0.05； n=3)A： 不同劑量； B： 不同時(shí)間Fig. 2 Effect of adding DAC at different doses and time points on the proliferation of CD4+ Tcells (aP＜0.05； n=3)A: Different doses； B: Different time points

圖3 低劑量DAC對(duì)CD4+ T細(xì)胞記憶表型的影響Fig. 3 Effect of low-dose DAC on memory phenotype of CD4+ Tcells (aP＜0.05； bP＜0.001；n=3)

圖5 低劑量DAC對(duì)CD4+ T細(xì)胞接觸腫瘤抗原后細(xì)胞因子分泌能力的影響Fig. 5 Effect of low-dose DAC on cytokine secretion of CD4+ Tcells exposed to tumor antigen (aP＜0.05； bP＜0.001；n=3)

4 DAC修飾的CD4+T細(xì)胞腫瘤溶解能力增強(qiáng) 通過(guò)xCELLigenceⅠ阻抗系統(tǒng)進(jìn)行96 h效靶比(E∶T)為10∶1的殺傷實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示DAC修飾的CD4+T細(xì)胞腫瘤溶解能力優(yōu)于對(duì)照組，說(shuō)明DAC能夠維持CD4+T細(xì)胞持續(xù)抑制腫瘤的能力(圖4)。

5 DAC修飾的CD4+T細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌增強(qiáng)將培養(yǎng)7 d的效應(yīng)細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞按照10∶1的比例進(jìn)行共培養(yǎng)，24 h后收集培養(yǎng)上清進(jìn)行ELISA檢測(cè)。結(jié)果顯示，DAC修飾后的CD4+T細(xì)胞與Raji細(xì)胞共培養(yǎng)后其分泌的IL-2、FasL、IFN-γ以及TNF-α顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明DAC修飾的CD4+T細(xì)胞遇到抗原后，分泌細(xì)胞因子的能力增強(qiáng)，而這些細(xì)胞因子可以促進(jìn)T細(xì)胞增殖及增強(qiáng)細(xì)胞毒性(圖5)。

討 論

T淋巴細(xì)胞在抗腫瘤免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的作用，以T細(xì)胞為主的過(guò)繼性免疫細(xì)胞在腫瘤免疫治療領(lǐng)域也越來(lái)越受到重視。雖然T細(xì)胞相關(guān)的過(guò)繼性免疫治療需要經(jīng)過(guò)體外的擴(kuò)增培養(yǎng)或基因工程化改造，但是主要分群仍然是CD4+和CD8+T細(xì)胞，兩者相互協(xié)調(diào)共同發(fā)揮抗腫瘤功效[13-14]。幼稚CD4+T細(xì)胞可以根據(jù)特征性效應(yīng)細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子分化為不同輔助性T細(xì)胞(Th)，CD4+T細(xì)胞的持續(xù)性和記憶性是T細(xì)胞體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間抗腫瘤的關(guān)鍵[15]。CD8+T細(xì)胞是T細(xì)胞發(fā)揮腫瘤殺傷作用的主要細(xì)胞群，但是缺失CD4+T細(xì)胞的幫助會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的CD8+T細(xì)胞耗竭[16]。因此，如果能夠體外增強(qiáng)CD4+T細(xì)胞的功能，可能是提高過(guò)繼免疫細(xì)胞療效的關(guān)鍵。

本研究探索了5種不同劑量和5個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)添加DAC對(duì)CD4+T細(xì)胞增殖的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高劑量的DAC，尤其是超過(guò)200 nmol/L劑量時(shí)，在體外培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)降低CD4+T細(xì)胞的增殖。在1 000 nmol/L時(shí)，T細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)大量的死亡。在10 ～ 100 nmol/L劑量范圍內(nèi)，DAC能夠促進(jìn)CD4+T細(xì)胞的增殖。值得注意的是，無(wú)論是CD4+還是CD8+T細(xì)胞，來(lái)自中央記憶型T細(xì)胞亞群比效應(yīng)記憶型T細(xì)胞亞群具有更加持續(xù)性的抗腫瘤能力[13,17-18]。本研究證實(shí)，DAC修飾的CD4+T細(xì)胞TCM表型以及TSCM表型顯著增加。

圖4 低劑量DAC對(duì)CD4+T細(xì)胞持續(xù)抑制腫瘤能力的影響Fig. 4 Effect of low-dose DAC on long-term tumor inhibition ability of CD4+ Tcells(n=3)

當(dāng)T細(xì)胞處于耗竭狀態(tài)時(shí)，其分泌的細(xì)胞因子IL-2、TNF-α和IFN-γ等降低，從而降低了細(xì)胞的溶解及增殖能力[19]。本研究通過(guò)ELISA檢測(cè)效應(yīng)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后細(xì)胞因子的分泌結(jié)果提示，DAC組的IL-2、FasL、IFN-γ以及TNF-α較對(duì)照組顯著增高。IL-2是促進(jìn)T細(xì)胞增殖的關(guān)鍵細(xì)胞因子，而FasL、IFN-γ以及TNF-α則是T細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒作用的關(guān)鍵細(xì)胞因子。DAC不但能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖相關(guān)的細(xì)胞因子分泌，同時(shí)還能夠促進(jìn)細(xì)胞毒相關(guān)的細(xì)胞因子分泌，與相關(guān)研究觀察到DNA去甲基化能夠增強(qiáng)體內(nèi)IL-2及INF-γ分泌的結(jié)果相符[10,20-21]。在細(xì)胞因子分泌增多的同時(shí)，本研究觀察到了DAC修飾的T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷作用的增強(qiáng)。CD8+T細(xì)胞是發(fā)揮抗腫瘤作用的主要作用細(xì)胞，CD4對(duì)與腫瘤細(xì)胞的殺傷作用很弱。但本研究觀察到，在DAC處理后CD4的抗腫瘤能力有了明顯的提高，雖然無(wú)法達(dá)到100%清除腫瘤細(xì)胞能力，但相對(duì)于未修飾CD4+T細(xì)胞，DAC修飾后的CD4+T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)揮了長(zhǎng)效抑制作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，低劑量DAC能夠顯著促進(jìn)CD4+T細(xì)胞增殖和記憶表型，并提高持續(xù)抑制腫瘤細(xì)胞增長(zhǎng)和分泌細(xì)胞因子的能力。在此研究基礎(chǔ)上，我們將進(jìn)一步通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證DAC修飾的T細(xì)胞的抗腫瘤功效，進(jìn)行基因組學(xué)水平分析探索DAC對(duì)CD4+T細(xì)胞關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子以及信號(hào)通路等的影響。