化痰消瘀方通過調(diào)節(jié)自噬對大鼠癌前病的改善作用

趙 艷 吳海濤

（勝利油田中心醫(yī)院 藥學(xué)部， 山東 東營257034）

胃癌（gastric cancer，GC） 是常見的惡性腫瘤，發(fā)病率在全球癌癥發(fā)病位居第4 位，病死率第2 位［1］。流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)顯示，我國也是GC 高發(fā)國，大約每3 分鐘就有一名中國人死于胃癌。GC 的發(fā)病機(jī)理尚不十分清楚，GC 的治療仍是惡性腫瘤的難題［2］。GC 發(fā)病前為胃癌前病變（precancerous lesions of gastric cancer，PLGC），PLGC 是慢性胃病出現(xiàn)的腸上皮化生及異型增生，其發(fā)展為GC 的概率較高，若能及時(shí)阻止PLGC 演進(jìn)至GC 的惡性過程，就有可能阻止GC 發(fā)生，但目前西醫(yī)仍缺乏有效的治療藥物［3-4］。

中醫(yī)學(xué)沒有胃癌前病變的病名，根據(jù)臨床表現(xiàn)可將其歸為“痞滿” “癥瘕” “胃脘痛” 等范疇。清代名醫(yī)葉天士在《臨證指南醫(yī)案》 有云“胃痛久而屢發(fā)，必有凝痰聚瘀”?！疤禎帷迸c“瘀血”是胃病共有的病理環(huán)節(jié)，“痰瘀”的形成貫穿于疾病整個(gè)過程，不止在GC 發(fā)生之后，而是在PLGC 時(shí)就已存在。臨床與動(dòng)物研究也已證實(shí)“痰濁” “瘀血” 與PLGC 的關(guān)系緊密［5］?；迪龇绞莿倮吞镏行尼t(yī)院根據(jù)多年的臨床經(jīng)驗(yàn)，在二陳湯的基礎(chǔ)上化裁獲得的經(jīng)驗(yàn)方。多年臨床研究也顯示化痰消瘀方在治療胃病變獲得了較好的效果，但其機(jī)理尚不明確。研究顯示自噬與許多疾病的發(fā)生密切相關(guān)，自噬是細(xì)胞程序性死亡方式，自噬與PLGC 及GC 演變過程密切相關(guān)，自噬在GC 發(fā)生中具有重大意義［6］。本課題擬考察化痰消瘀方對PLGC 大鼠療效及對自噬相關(guān)基因的影響。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級雄性Wister 大鼠，體質(zhì)量180～220 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK（京） 2006-0009。所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，期間自由飲食飲水。

1.2 藥物與試劑化痰消瘀處方由陳皮、法半夏20 g，豬苓、莪術(shù)、紫丹參和薏苡仁各15 g組成，加入藥材5 倍質(zhì)量的純凈水，中火煎煮2 次，40 min／次，合并煎液，調(diào)整濃度3 g 生藥／mL。藥材陳皮、法半夏、豬苓、莪術(shù)、紫丹參和薏苡仁的產(chǎn)地分別為廣東新會、四川成都、貴州貴陽、廣西桂林、云南大理和湖北蘄春，藥材均購于東營百草堂中藥飲片有限公司，由勝利油田中心醫(yī)院藥學(xué)部的副主任藥師張麗芝鑒定分別為蕓香科植物橘的成熟果皮、天南星科植物半夏的塊莖、非褶菌目多孔菌科樹花屬藥用真菌、姜科植物莪術(shù)的干燥根莖、唇形科紫丹參的干燥根及根莖和禾本科植物薏苡的干燥成熟種仁。甲硝基亞硝基胍（美國Sigma 公司），臨用前配制，用超純水配制質(zhì)量濃度為100 μg／mL 溶液，避光保存；胃復(fù)春片（杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司，規(guī)格0.36 g／片，國藥準(zhǔn)字Z20040003）；DNA 提取試劑盒（美國Promega 公司，貨號A1120）；免疫組織化學(xué)染色SP 試劑盒（北京中山生物技術(shù)公司，批號30577916）；LC3（貨號ab48394）、Raptor（貨號ab62557）、Beclin-1（貨號ab202319） 一抗均購自英國Abcam 公司；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔二抗（上海博蘊(yùn)科技有限公司，批號190801）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Thermo 公司，貨號K1622）；BCA 蛋白定量試劑盒（中國碧云天生物技術(shù)研究所，批號20190306）；脫氧膽酸鈉（批號201903）、乙 醇（批號201901） 為化學(xué)純購自東營市華振化工有限公司，臨用前配置，濃度分別為20 mmol／L 和40%。

1.3 儀器 GeneAmp 9600型PCR 反應(yīng)擴(kuò)增儀（美國ABI公司）；NAS-99型紫外分光光度計(jì)（美國ACTGene 公司）；Centrifuge5415D型離心機(jī)（德 國 Eppdendorf 公 司）；BC-subMIDI型電泳儀（北京六一儀器廠）；BX 50-3E01型顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

2 方法

2.1 PLGC 大鼠制備 取SPF 級雄性Wister 大鼠給予含有0.03%雷尼替丁的顆粒飼料；第2 周，每日飲用甲硝基亞硝基胍溶液（避光處理），同時(shí)進(jìn)食2 d 和禁食1 d 的饑飽交替法。進(jìn)食日上午8：00 至12：00 給予55℃15%氯化鈉溶液（10 mL／kg） 灌胃，下午14：00 至17：00 給予脫氧膽酸鈉溶液（10 mL／kg） 灌胃；禁食日下午14：00 至17：00 給予乙醇（10 mL／kg） 劑量灌胃。灌胃前后1 h 必須禁食禁水，用鉗子鉗住所有制備PLGC 大模型的大鼠尾部，每次30 min，1 次／7 d，使大鼠處于激怒的狀態(tài)，造模持續(xù)6個(gè)月。

2.2 分組及給藥 將大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、化痰消瘀方低劑量組、化痰消瘀方高劑量組、陽性藥胃復(fù)春組，每組15 只。對照組和模型組大鼠每日予生理鹽水（10 mL／kg）灌胃，化痰消瘀方低、高劑量組分別灌胃給予5、10 g 生藥／kg 化痰消瘀方，胃復(fù)春組給予0.5 g／kg 胃復(fù)春片，連續(xù)給藥4個(gè)月。每日記錄大鼠在治療過程的生存狀況和體質(zhì)量

2.3 HE 染色觀察胃竇部組織病理狀態(tài) 給藥結(jié)束后，大鼠禁食不禁水12 h，取胃組織，用生理鹽水洗凈，取胃竇部組織用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，HE 染色，鏡下觀察病變。

2.4 免疫組化檢測LC3、Raptor、Beclin-1 蛋白表達(dá) 取各組胃黏膜組織石蠟標(biāo)本切片，脫蠟，水化，高壓熱修復(fù)抗原，3% H2O2氧化15 min，滴加LC3、Raptor、Beclin-1 一抗（1∶50），4℃過夜，滴加二抗，37℃孵育30 min，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，脫水透明，封片。PBS 替代一抗作為陰性對照，免疫組織化學(xué)染色陽性為棕褐色或黃色。按強(qiáng)度評分，無色0 分，淺黃色1 分，棕黃色2 分，棕褐色3 分；染色強(qiáng)度按陽性細(xì)胞百分比評分，陰性0 分，陽性細(xì)胞≤10% 1 分，11%～50% 2 分，51%～75% 3 分，≥75% 4 分。蛋白表達(dá)＝強(qiáng)度×陽性細(xì)胞百分比。

2.5 Western blot 檢測胃黏膜組織LC3、Raptor、Beclin-1蛋白表達(dá) 取各組胃黏膜組織，加入400 μL RIPA 裂解組織，4℃離心取上清，BCA 蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，將蛋白定量為2.0 g／L，煮沸10 min，電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，封閉2 h，漂洗，加入LC3（1∶100）、Raptor（1∶100）、Beclin-1（1∶100）、GAPDH（1∶5 000） 一抗，4℃孵育過夜，TBST 洗滌，二抗孵育1 h，TBST 洗滌，加ECL 工作液，顯影，分析，獲得待測蛋白的相對表達(dá)。

2.6 RT-PCR 檢測胃黏膜組織LC3、Raptor、Beclin-1 mRNA表達(dá) 按TRIzol RNA 試劑盒說明提取胃組織總RNA，以紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量，取1 μg 總RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。cDNA 合成體系，焦磷酸二乙酯2 μL，反轉(zhuǎn)錄緩沖液5 μL，上游和下游引物各1.0 μL，加雙蒸水補(bǔ)至25 μL，37℃反應(yīng)50 min；將合成的cDNA 置于PCR 反應(yīng)體系中擴(kuò)增，反應(yīng)體系為cDNA 1.0 μL，10×buffer 2.5 μL，Dntp 0.5 μL，Taq 酶1.0 μL，延伸體系2.0 μL，超純水15 μL，上游和下游引物各0.5 μL，加雙蒸水補(bǔ)至23 μL，反應(yīng)條件96℃預(yù)變性1 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算待測基因的相對表達(dá)量。

表1 引物序列

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.00 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（） 表示，多組間比較采用方差分析；等級資料采用秩和檢驗(yàn)，以P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般生存狀況及體質(zhì)量改變 對照組大鼠色白有光澤，活動(dòng)敏捷，食量正常，大便呈顆粒狀，尾淡紅色。模型組大鼠毛色黃而無光，活動(dòng)遲鈍，形體偏瘦，食量少，可見便溏，尾色淡白色?；迪龇降?、高劑量組及胃復(fù)春組大鼠的生存狀況介于對照組與模型組之間。如表2 所示，治療前，與對照組比較，其余組大鼠體質(zhì)量均降低（P＜0.05）。治療后，與對照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量降低（P＜0.05）；與模型組比較，化痰消瘀方組、胃復(fù)春組體質(zhì)量增加（P＜0.05）。

表2 各組大鼠的體質(zhì)量比較（g， x±s， n＝15）

3.2 大鼠胃組織病理改變 如圖1 所示，對照組大鼠胃黏膜上皮完整，固有膜內(nèi)的腺體緊密排列且整齊，細(xì)胞形態(tài)相同，淋巴細(xì)胞少量散在，無明顯的炎癥細(xì)胞浸潤；模型組大鼠胃黏膜腺體萎縮或消失，腺體可見共壁，固有層內(nèi)可見炎細(xì)胞浸潤，浸潤深至黏膜肌層，淋巴細(xì)胞聚集于黏膜，血管有增生，腺體紊亂，基底部腺體上皮增生；化痰消瘀方低、高劑量組胃體和胃竇部黏膜炎癥較輕，可見充血、水腫及上皮細(xì)胞壞死脫落、淋巴細(xì)胞浸潤，少量的嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤；胃復(fù)春組胃黏膜上皮較完整，少量散在的淋巴細(xì)胞，炎性細(xì)胞浸潤黏膜淺層，部分腺體出現(xiàn)萎縮?；迪龇降汀⒏邉┝拷M和胃復(fù)春組的胃組織病理改變介于對照組與模型組之間，腺體排列較整齊，細(xì)胞形態(tài)大略相同，炎癥細(xì)胞浸潤、充血、水腫及上皮細(xì)胞壞死脫落減少。

圖1 大鼠胃組織病理學(xué)觀察（×200）

3.3 大鼠胃組織LC3、Raptor、Beclin-1 蛋白表達(dá) 如圖2～3、表3 所示，胃組織LC3、Raptor、Beclin-1 均在細(xì)胞核或細(xì)胞漿中表達(dá)。與對照組比較，模型組大鼠胃組織LC3、Raptor、Beclin-1 蛋白表達(dá)增高（P＜0.05）；與模型組比較，化痰消瘀方高劑量組、胃復(fù)春組胃LC3、Raptor、Beclin-1蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；與化痰消瘀方低劑量組比，化痰消瘀方高劑量組胃LC3、Raptor 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。

3.4 大鼠胃組織LC3、Raptor、Beclin-1 mRNA 表達(dá) 如表4、圖4 所示，與對照組比較，模型組大鼠胃LC3、Raptor、Beclin-1 mRNA 表達(dá)增高（P＜0.05）；與模型組比，化痰消瘀方組和胃復(fù)春組胃LC3、Raptor、Beclin-1 mRNA 表達(dá)降低（P＜0.05）。

4 討論

化痰消瘀方由陳皮、法半夏、豬苓、莪術(shù)、紫丹參和薏苡仁6 味中藥組成，方中陳皮味苦、辛，性溫，歸肺、脾二經(jīng)，可理氣降逆、燥濕化痰、健脾行氣；法半夏味辛，性溫，可化痰降逆、調(diào)脾胃升降之氣機(jī)，與陳皮聯(lián)用可增強(qiáng)理氣化濕和胃的功效；豬苓利水滲濕；莪術(shù)活血行氣、破血消癥；紫丹參活血化瘀、通經(jīng)止痛、瘀滯消除；薏苡仁味甘、淡，性涼，歸脾胃肺經(jīng)，健脾利濕，諸藥共奏健脾理氣及化痰消瘀之功［7-13］。多年的臨床研究顯示，化痰消瘀方具有保護(hù)胃黏膜、改善胃黏膜血液循環(huán)、增強(qiáng)黏膜上皮細(xì)胞的再生及修復(fù)功能，可逆轉(zhuǎn)慢性萎縮性胃炎，改善腸上皮化生或異型增生。本研究顯示，給予PLGC 大鼠化痰消瘀方連續(xù)4個(gè)月，PLGC 大鼠的生存狀態(tài)明顯改善，胃組織炎癥、水腫、上皮細(xì)胞壞死脫落和淋巴細(xì)胞浸潤等病變均明顯改善，進(jìn)一步證實(shí)了化痰消瘀方對胃病變具有明確的治療效果。

圖2 免疫組化檢測各組大鼠胃組織LC3、Raptor、Beclin-1 蛋白表達(dá)（×200）

圖3 Western blot 檢測各組大鼠胃組織LC3、Raptor、Beclin-1 蛋白表達(dá)

表3 各組大鼠胃組織LC3、Raptor、Beclin-1 蛋白表達(dá)比較（， n＝15）

表3 各組大鼠胃組織LC3、Raptor、Beclin-1 蛋白表達(dá)比較（， n＝15）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05；與化痰消瘀方低劑量組比較，△P＜0.05。

表4 各組大鼠胃LC3、 Raptor、 Beclin-1 mRNA 表達(dá)比較（， n＝15）

表4 各組大鼠胃LC3、 Raptor、 Beclin-1 mRNA 表達(dá)比較（， n＝15）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05；與化痰消瘀方低劑量組比較，△P＜0.05。

圖4 RT-PCR 檢測各組大鼠胃LC3、Raptor、 Beclin-1 mRNA 表達(dá)

細(xì)胞自噬作為依賴溶酶體的降解途徑，腫瘤細(xì)胞的自噬對于腫瘤細(xì)胞的生長具有至關(guān)重要的作用，腫瘤細(xì)胞因?yàn)樯L快速而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞處于相對缺氧狀態(tài)，腫瘤細(xì)胞可通過自噬提供營養(yǎng)及能量，促進(jìn)腫瘤的持續(xù)生長。LC3是細(xì)胞自噬發(fā)生的敏感標(biāo)志物，LC3 表達(dá)可用于評估自噬的活性程度，研究［14-15］報(bào)道與非癌或癌旁組織比，胃癌組織中LC3 表達(dá)異常升高。PI3K／AKT／mTOR 信號通路對自噬發(fā)揮重要調(diào)控作用，Raptor 是該通道的核心分子，參與調(diào)控蛋白質(zhì)合成、代謝、血管生成和自噬等過程，Raptor表達(dá)可反映mTOR 的生物學(xué)活性。研究表明，Raptor 在早期胃癌組織表達(dá)不僅高于正常胃黏膜也高于慢性萎縮性胃炎胃組織，Raptor 在胃癌的表達(dá)越高，患者的預(yù)后越差，在胃上皮內(nèi)瘤變階段，Raptor 被激活，細(xì)胞開始處于活躍增殖狀態(tài)。Beclin-1 在人類癌癥發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用，胃癌組織Beclin-1 的高表達(dá)提示腫瘤細(xì)胞處于活躍生長期［16-18］。本課題結(jié)果顯示，與對照組比較，PLGC 模型組大鼠胃組織的LC3、Raptor 和Beclin-1 蛋白及mRNA 表達(dá)明顯增高。既往的病理研究認(rèn)為，當(dāng)胃部發(fā)生炎性反應(yīng)時(shí)，胃黏膜的腺體呈現(xiàn)萎縮與減少，萎縮的細(xì)胞內(nèi)自噬泡、微囊泡和殘留小體顯著增加，再加上固有腺黏液顆粒擴(kuò)張，自噬泡容易被機(jī)械擠壓到胞膜下直至與細(xì)胞膜融合，因此細(xì)胞膜的LC3、Raptor 和Beclin-1 表達(dá)增高，一定程度反映了胃病變的程度［19］。給予化痰消瘀方后，PLGC 大鼠胃組織的LC3、Raptor 和Beclin-1 蛋白及mRNA 均明顯降低，提示化痰消瘀方有助于抑制PLGC 的自噬。相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道，化痰消瘀方中的組成或成分對LC3、Raptor 和Beclin-1 相關(guān)的自噬具有一定的抑制作用，如黃小波等［20］分離培養(yǎng)HUVEC細(xì)胞，考察陳皮-半夏對Beclin-1 和LC-3 等自噬通路的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果顯示陳皮-半夏可能通過抑制HUVEC 細(xì)胞中Beclin-1 和LC-3 的表達(dá)，而發(fā)揮提高內(nèi)皮細(xì)胞存活率，治療動(dòng)脈粥樣硬化的作用。唐丹麗等［21-22］研究顯示，與空白對照組比較，含有半夏的栝蔞薤白半夏湯組可降低心肌細(xì)胞的Beclin-1 和LC-3 表達(dá)，從而抑制自噬而起到心肌保護(hù)作用。白曄等［23］體外研究顯示，采用石油醚提取含有半夏和茯苓的化痰消食方可通過下調(diào)LC3 表達(dá)而拮抗內(nèi)皮細(xì)胞的自噬性死亡。

綜上所述，PLGC 存在明顯的細(xì)胞自噬，化痰消瘀方可用于治療PLGC，其可能機(jī)理在于降低胃LC3、Raptor 和Beclin-1 自噬相關(guān)蛋白及mRNA 表達(dá)。