美洲大蠊醇提取物對小鼠急性免疫性肝損傷的影響

楊 帥 哈立洋 李阿溶 尹可歡 顧 健

（西南民族大學(xué) 藥學(xué)院， 四川 成都610041）

美洲大蠊Periplaneta Americana L.俗名蟑螂，屬蜚蠊科［1］。作為藥物使用歷史悠久，最早期記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其性寒，味咸、有辛辣味，小毒，具有散瘀、消積、解毒等功效?，F(xiàn)代藥理研究顯示，美洲大蠊具有抗腫瘤、改善血液循環(huán)、促進(jìn)組織修復(fù)、增強(qiáng)免疫、保護(hù)肝臟功能等作用［2-4］。利用美洲大蠊的不同提取物，建立急性免疫性肝損傷小鼠模型，表明美洲大蠊能夠有效治療肝損傷，課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，美洲大蠊75%乙醇提取物對刀豆蛋白A 誘導(dǎo)的急性免疫性肝損傷有一定的保護(hù)作用，但其用藥劑量及調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞作用尚不明確，因此本實(shí)驗(yàn)通過對比美洲大蠊醇提物高、中、低3個(gè)劑量對刀豆蛋白A 誘導(dǎo)的急性免疫性肝損傷的保護(hù)作用，探究用藥劑量對免疫性肝損傷的治療作用，同時(shí)研究3個(gè)劑量組對T 淋巴細(xì)胞中CD4、CD8 細(xì)胞亞群的調(diào)節(jié)作用。

1 材料

1.1 動物 SPF 級，雄性KM 小鼠60 只，體質(zhì)量18～25 g，合格證號0042449，生產(chǎn)許可證號SCXK（川） 2015-030，購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司，室溫（23±2）℃，濕度50%～60%。SPF 級動物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。

1.2 藥物與試劑 美洲大蠊（四川好醫(yī)生藥業(yè)提供，批號ML-20170327），經(jīng)西南民族大學(xué)藥學(xué)院顧健教授鑒定為正品；刀豆蛋白A（美國Sigma 公司，批號ab15323）；聯(lián)苯雙酯（萬邦德制藥集團(tuán)股份有限公司，批號A0-2j171108）；AST 檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20180828）；ALT 檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20180825）；MDA 檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20180827）；SOD 檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20180827）；無水乙醇（AR 級，規(guī)格2.5 L／桶，批號GB678-90，江蘇海興化工有限公司）。

1.3 儀器 全自動生化分析儀（江西特康科技有限公司）；722 可見分光光度計(jì)（上海佑科儀器儀表有限公司生產(chǎn)）；全自動封閉式組織脫水機(jī)（常州市中威電子儀器有限公司）；病理組織漂烘儀（常州市中威電子儀器有限公司）；數(shù)碼三目攝像顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；熒光定量PCR 儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）。

2 方法

2.1 藥物制備 將蟲體研磨成粉，干燥通風(fēng)保存。取干燥蟲粉500 g，加入5 倍量體積的石油醚，超聲脫脂2 次，30 min／次，蒸發(fā)干燥，加入15 倍量體積的75% 乙醇，超聲提取3 次，30 min／次，提取液合并濃縮干燥即得美洲大蠊醇提物，冷藏保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.2 造模及給藥 將60 只小鼠隨機(jī)分為6組，空白組、模型組、聯(lián)苯雙酯組（200 mg／kg） 及美洲大蠊醇提物高、中、低劑量組（90、60、30 mg／kg），每組10 只。張鵬［5］、甘 平［6］、石林琳［7］等研究美洲 大蠊醇提物 為100、200 mg／kg，因此為探究更適宜給藥濃度，本次實(shí)驗(yàn)醇提物組設(shè)置低于上述濃度的高中低3個(gè)劑量組（90、60、30 mg／kg），為后續(xù)綜合各梯度濃度探究更準(zhǔn)確的量效關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)?？瞻捉M和模型組給予同體積的純凈水灌胃，其他各組小鼠按照對應(yīng)給藥劑量灌胃給藥，1 次／d，連續(xù)給藥7 d；末次給藥2 h 后，除空白組外，各組小鼠均尾靜脈注射20 mg／kg 刀豆蛋白A 進(jìn)行造模。造模結(jié)束的各組小鼠，均禁食不禁水，10 h 后，稱定小鼠體質(zhì)量。

2.3 血清ALT、AST 水平及肝脾指數(shù)的測定 造模10 h 后麻醉，眼球取血，分離血清。檢測ALT、AST 水平。頸椎脫臼處死小鼠，取肝臟、脾臟稱定質(zhì)量，肝臟系數(shù)＝（肝臟質(zhì)量／體質(zhì)量） ×100%，脾臟系數(shù)＝（脾臟質(zhì)量／體質(zhì)量） ×100%。

2.4 肝臟組織中MDA、SOD 水平測定 造模10 h 后麻醉，小鼠脫頸處理，剪取部分肝臟組織，冰浴中用生理鹽水制成10%肝勻漿，離心，取上清液檢測SOD、MDA 水平。

2.5 HE 染色觀察肝臟組織病理 取肝左葉同一部位組織，中性甲醛固定，常規(guī)制備切片，HE 染色，光鏡下觀察拍照。小葉增生（＜5%、5%～33%、33%～67%、＞67%） 分別記為0、1、2、3 分?jǐn)?shù)；炎癥浸潤（無病灶、＜2個(gè)病灶／視野、2～4個(gè)病灶／視野、＞4個(gè)病灶／視野） 分別記為0、1、2、3 分?jǐn)?shù)；點(diǎn)狀壞死（無、少見、多見） 分別記為0、1、2 分?jǐn)?shù)。

2.6 免疫組化檢測淋巴細(xì)胞CD4、CD8 取肝臟組織，進(jìn)行石蠟切片微波修復(fù)抗原染色與熱抗原修復(fù)，使用DAB 顯色，最后完成圖像采集。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行分析，血清及肝組織的檢測數(shù)據(jù)計(jì)量資料以（） 表示，符合正態(tài)分布且方差齊性資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；病理學(xué)分級評分等級資料采用Ridit 檢驗(yàn)。以P≤＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 美洲大蠊醇提物對刀豆蛋白A 致急性免疫性肝損傷小鼠肝、脾系數(shù)的影響 與空白組比較，刀豆蛋白A 致急性肝損傷模型組小鼠肝、脾系數(shù)升高，肝脾腫大；與模型組比較，美洲大蠊醇提物組、聯(lián)苯雙酯組均能降低肝、脾系數(shù)（P＜0.05，P＜0.01），改善肝脾組織腫脹程度，見表1。

3.2 美洲大蠊醇提物對小鼠血清ALT、AST 水平的影響 與空白組相比，刀豆蛋白A 致急性肝損傷模型組小鼠血清ALT、AST 水平上升；與模型組比較，美洲大蠊醇提物均能降低ALT、AST 水平（P＜0.05，P＜0.01），見表2。

表1 美洲大蠊醇提物對刀豆蛋白A 致急性肝損傷小鼠臟器系數(shù)的影響（， n＝10）

表1 美洲大蠊醇提物對刀豆蛋白A 致急性肝損傷小鼠臟器系數(shù)的影響（， n＝10）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

表2 美洲大蠊醇提物對刀豆蛋白A 致急性肝損傷小鼠血清AST、ALT 水平影響（， n＝10）

表2 美洲大蠊醇提物對刀豆蛋白A 致急性肝損傷小鼠血清AST、ALT 水平影響（， n＝10）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.3 美洲大蠊醇提物對刀豆蛋白A 致急性肝損傷小鼠肝組織SOD、MDA 水平的影響 與空白組相比，刀豆蛋白A致急性肝損傷模型組小鼠肝組織MDA 水平明顯上升，肝組織SOD 水平下降（P＜0.01）；美洲大蠊醇提物高、中劑量組可升高肝組織SOD 水平，降低MDA 水平（P＜0.05，P＜0.01），見表3。

表3 美洲大蠊醇提物對刀豆蛋白A 致急性肝損傷小鼠肝組織SOD、MDA 水平影響（， n＝10）

表3 美洲大蠊醇提物對刀豆蛋白A 致急性肝損傷小鼠肝組織SOD、MDA 水平影響（， n＝10）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.4 美洲大蠊醇提物對刀豆蛋白A 致急性肝損傷小鼠肝臟組織損傷的影響 正常組肝臟被膜及門管區(qū)完整，肝細(xì)胞分葉明顯，形態(tài)正常，未見病理變化；模型組肝臟被膜完整，肝細(xì)胞分葉不明顯，肝索排列較為紊亂，肝細(xì)胞片狀壞死、出血，肝細(xì)胞胞質(zhì)出現(xiàn)大量空泡變性，有少量肝細(xì)胞空泡變性，伴少量炎性細(xì)胞；給藥組被膜及門管區(qū)完整，肝細(xì)胞壞死、出血情況得到改善，空泡變性減輕，炎細(xì)胞浸潤得到改善。見圖1、表4。

圖1 各組肝組織病理切片圖（HE，×400）

表4 各組肝組織病理分級（n＝10）

3.5 美洲大蠊醇提物對刀豆蛋白A 致急性肝損傷小鼠肝組織淋巴細(xì)胞CD4、CD8 的影響 模型組小鼠肝組織CD4、CD8 的陽性細(xì)胞IOD 呈上升趨勢，尤其是CD8 陽性細(xì)胞的上升幅度更大；與模型組比較，美洲大蠊醇提物清晰可見CD4、CD8 的陽性細(xì)胞IOD 下降（P＜0.01），說明美洲大蠊醇提物治療刀豆蛋白A 誘導(dǎo)的免疫性肝損傷機(jī)制，可能是通過調(diào)節(jié)CD4、CD8 的陽性細(xì)胞數(shù)量，改善免疫功能紊亂，從而保護(hù)肝臟。見表5、圖2～3。

4 討論

肝損傷是臨床上的常見病，各種物理和化學(xué)因素均可導(dǎo)致急、慢性肝損傷。肝損傷后，固有的免疫細(xì)胞分泌促纖維化因子，如TGF-β、血小板來源生長因子（PDGF）、IL-13 和IL-4 等，導(dǎo)致肝纖維化，并逐漸發(fā)展成肝小葉結(jié)構(gòu)的破壞及結(jié)節(jié)形成，最終演變成肝硬化或肝癌。因此，控制或逆轉(zhuǎn)肝損傷具有重要意義。實(shí)驗(yàn)依據(jù)操作簡便，具有肝臟特異性等特點(diǎn)［8-9］，所測指標(biāo)模型組與空白組比較均有顯著性差異，說明造模成功。

表5 美洲大蠊醇提物對刀豆蛋白A 致急性肝損傷小鼠T 淋巴細(xì)胞亞群的影響（， n＝10）

表5 美洲大蠊醇提物對刀豆蛋白A 致急性肝損傷小鼠T 淋巴細(xì)胞亞群的影響（， n＝10）

注：與模型組比較，**P＜0.01。

圖2 CD4 的免疫組化圖（IHC，×100）

圖3 CD8 的免疫組化圖（IHC，×100）

血清AST、ALT 可以反映肝細(xì)胞受損程度以及線粒體損傷的情況，根據(jù)肝組織中MDA、SOD 水平變化，能夠推測出機(jī)體細(xì)胞受氧自由基攻擊以及減少細(xì)胞和組織損傷的程度［9-11］。美洲大蠊醇提物調(diào)節(jié)T 淋巴細(xì)胞方面，尚無相關(guān)報(bào)道，機(jī)體維持正常的免疫功能狀態(tài)有賴于T 淋巴細(xì)胞亞群維持一定的比例，因此本次實(shí)驗(yàn)探究美洲大蠊醇提物對T 淋巴細(xì)胞亞群的調(diào)節(jié)作用。與空白組比較，模型組CD4 和CD8 細(xì)胞亞群的數(shù)量上升，CD8 細(xì)胞亞群趨勢更為顯著，強(qiáng)陽性細(xì)胞數(shù)目增多；與模型組比較，美洲大蠊醇提物下調(diào)CD4 和CD8 細(xì)胞亞群的數(shù)量，改善細(xì)胞陽性程度，調(diào)節(jié)T 淋巴細(xì)胞亞群，使其達(dá)到一個(gè)相互平衡的狀態(tài)，減輕對肝細(xì)胞的毒性，改善免疫功能紊亂，阻斷肝損傷從急性向慢性的進(jìn)一步發(fā)展。

本研究顯示，美洲大蠊醇提物均可以不同程度的降低肝脾系數(shù)和血清ALT、AST 水平，降低肝臟組織中的MDA水平，升高SOD 水平，美洲大蠊醇提物高劑量組效果優(yōu)于醇提物中劑量組及醇提物低劑量組，美洲大蠊醇提物能抑制肝臟和脾臟的免疫反應(yīng)，減輕肝臟細(xì)胞損傷，以及抗脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和清除肝內(nèi)自由基。同時(shí)，美洲大蠊醇提物調(diào)節(jié)T 淋巴細(xì)胞亞群，使其達(dá)到一個(gè)相互平衡的狀態(tài)，減輕對肝細(xì)胞的毒性，改善免疫功能紊亂，抑制急性免疫性肝損傷向慢性免疫性肝損傷的進(jìn)一步發(fā)展，從而保護(hù)肝臟。