HPLC-ELSD 法同時測定銀怡片中2 種成分

于桂芳 胡寶玲 胡軍華 曹苗苗 黃文哲 王振中 蕭 偉

（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司， 江蘇 連云港222001）

氨基葡萄糖是一種從天然甲殼中提取的氨基己糖，為人體及動物體內關節(jié)組織中糖蛋白的天然成分［1］；硫酸軟骨素是一種從動物軟骨中提取的酸性粘多糖［2］，兩者廣泛用于增加骨密度類的保健食品中。目前，國內外法規(guī)及文獻報道的氨基葡萄糖常用檢測方法有紫外分光光度 法［3-4］、HPLC-UV 法［5-8］、HPLC-ELSD 法［9-11］，其中紫外分光光度法樣品需衍生化處理，操作繁瑣，穩(wěn)定性、重復性差；HPLC-UV 法（包括衍生化法） 靈敏度低，衍生操作繁瑣；HPLC-ELSD 靈敏度高，但色譜柱大多采用C18，出峰時間短，分離效果差，少數(shù)采用氨基色譜柱，但重復性差，而硫酸軟骨素常用的檢測方法有Elson-Morgan 法［12］、咔唑法［13］、滴定法［14-15］、HPLC-酶解法［16］、HPLC-UV［17-18］法、HPLC-ELSD 法［19］，其中前三者操作繁瑣，專屬性、準確性差；HPLC-酶解法專屬性、準確性好，但樣品處理繁瑣，而且酶試劑價格較高；HPLC-ELSD 偶有報道，但與氨糖一樣，配套的色譜柱大多為C18和氨基；目前，以氨基葡萄糖和硫酸軟骨素為原料的保健食品中同時測定兩者含有量時主要依據(jù)GB／T 20365-2006［20］，該方法采用紫外檢測器、強陰離子C18色譜柱、離子對試劑，存在靈敏度低、分離效果差、操作繁瑣等不足，故開發(fā)一種操作簡便、靈敏度和準確度高、重復性好的方法具有重要意義。本實驗針對氨基葡萄糖、硫酸軟骨素紫外吸收弱和極性大的問題，采用高效液相-蒸發(fā)光散射檢測器（HPLC-ELSD）法結合酰胺色譜柱同時測定銀怡片中兩者含有量，以期為該制劑質量控制提供參考。

1 材料

1.1 試劑與藥物D-葡萄糖鹽酸鹽（含有量100%，批號140649-201304）、硫酸軟骨素鈉（含有量99.1%，批號140792-201702） 對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。D-氨基葡萄糖硫酸鉀鹽（批號0220170355）、硫酸軟骨素（來源牛骨，批號072017020） 原料藥（江蘇奧新生物工程有限公司）。銀怡片為江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司在研品種，是由骨碎補、葛根、D-氨基葡萄糖硫酸鉀鹽、硫酸軟骨素鈉、檸檬酸鈣、輔料經加工制成的保健食品，批號20180201、20180202、20180203。乙腈（批號17050287）、三乙胺（批號16050721） 為色譜純（美國Tedia 公司）；乙酸銨為色譜純［批號1704005，阿拉丁試劑（上海） 有限公司］；超純水（18 Ω）。

1.2 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司），配置Alltech 2000ES ELSD 檢測器；XP6 電子天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；BSA224S-CW 電子天平（德國Sartorius 公司）；Milli-Q Academic 超純水機（美國Millipore公司）；KQ-500DB 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；CIMODHG-91438S-Ⅲ電熱恒溫鼓風干燥箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Waters Xbridge Amide 色譜柱（酰胺柱，4.6 mm×150 mm，3.5 μm）；以乙腈-50 mmol／L 乙酸銨（含0.6%三乙胺） 為流動相，等度洗脫（75：25）；體積流量0.8 mL／min；柱溫40℃；蒸發(fā)光散射檢測器，漂移管溫度105℃；載氣N2，體積流量2.5 mL／min；進樣量5 μL。

2.2 對照品溶液制備 分別精密稱取經105℃干燥4 h 的氨基葡萄糖鹽酸鹽、硫酸軟骨素鈉對照品4.631、4.705 mg，置于20 mL 量瓶中，加入2 mL 乙腈振蕩使其分散均勻，加水超聲溶解后冷卻至室溫，水定容至刻度，搖勻，即得每1 mL 分別含氨基葡萄糖鹽酸鹽、硫酸軟骨素鈉0.231 6、0.2 331 mg 的低濃度對照品溶液，同法制備每1 mL分別含兩者0.587 7、0.589 3 mg 的高濃度對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備 取本品適量，除去薄膜衣研細，精密稱取100 mg，置于50 mL 量瓶中，加入5 mL 乙腈超聲1 min，加水至接近刻度，超聲10 min，水定容至刻度，搖勻，離心，即得。

2.4 專屬性試驗 取不含氨基葡萄糖硫酸鉀鹽、硫酸軟骨素鈉的陰性樣品，按“2.3” 項下方法制備陰性供試品溶液。精密吸取對照品、供試品、陰性供試品溶液各5 μL，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，結果見圖1。由圖可知，供試品呈現(xiàn)與對照品保留時間一致的色譜峰，陰性供試品在相應保留時間處基本無雜質峰出現(xiàn)，表明該方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC-ELSD 色譜圖

2.5 線性關系考察 分別精密稱取105℃下干燥4 h 的氨基葡萄糖鹽酸鹽、硫酸軟骨素鈉對照品 43.118、42.550 mg，置于10 mL 量瓶中，加入1 mL 乙腈振蕩使其分散均勻，加水超聲溶解后冷卻至室溫，水定容至刻度，搖勻，即得每1 mL 分別含氨基葡萄糖鹽酸鹽、硫酸軟骨素鈉4.311 8、4.216 7 mg 的貯備液，精密量取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL 于10 mL 量瓶中，水稀釋至刻度，制成每1 mL 含氨基葡萄糖鹽酸鹽0.172 5、0.258 7、0.344 9、0.431 2、0.517 4、0.603 7、0.689 9 mg，含硫酸軟骨素鈉0.168 7、0.253 0、0.337 3、0.421 7、0.506 0、0.590 3、0.674 7 mg 的系列質量濃度的對照品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定。以質量濃度的自然對數(shù)為橫坐標（X），峰面積的自然對數(shù)為縱坐標（Y） 進行回歸，得方程分別為氨基葡萄糖鹽酸鹽Y＝1.362 5X＋6.12（r＝0.999 9）、硫酸軟骨素 鈉Y＝1.398 6X＋5.075 8（r＝0.999 4），分別在 0.172 5～0.689 9、0.168 7～0.674 7 mg／mL范圍內線性關系良好。

2.6 定量限檢測 取低質量濃度對照品溶液逐級稀釋，以S／N＝10 為定量限，測得氨基葡萄糖鹽酸鹽、硫酸軟骨素鈉分別為0.162、0.283 μg。

2.7 精密度試驗 取低、中、高質量濃度對照品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得氨基葡萄糖鹽酸鹽峰面積RSD 分別為0.73%、0.66%、1.38%，硫酸軟骨素鈉分別為2.47%、2.09%、1.57%，表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗 取同一對照品、供試品溶液，于0、2、4、6、8、10、12、15 h 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得氨基葡萄糖鹽酸鹽峰面積RSD 分別為0.96%、1.97%，硫酸軟骨素鈉分別為1.65%、3.15%，表明溶液在15 h 內穩(wěn)定性良好。

2.9 重復性試驗 取同一批樣品（批號20180201），按“2.3” 項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得氨基葡萄糖硫酸鉀鹽、硫酸軟骨素鈉含有量RSD 分別為1.95%、0.32%，表明該方法重復性良好。

2.10 加樣回收率試驗 精密稱取本品50 mg（批號20180201，氨基葡萄糖硫酸鉀鹽、硫酸軟骨素鈉含有量分別為27.02%、23.16%），置于50 mL 量瓶中，對照品加入量與所取供試品中待測成分量之比為1∶1（以固體形式加入），按“2.3” 平行制備6 份供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下測定，結果見表1。

2.11 樣品含有量測定 取本品3 批，按“2.3” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，結果見表2。此外，由處方可測得氨基葡萄糖硫酸鉀、硫酸軟骨素鈉理論含有量分別為28%、23%，可知實測值與理論值較為接近。

3 討論

3.1 色譜柱選擇 親水性色譜柱（HILIC） 適合分離在反相色譜柱上不保留的極性化合物，尤其是對強極性堿性化合物的保留能力較強，通常用于分離水溶性極強的極性化合物，而且適配于LC-MS 及LC-ELSD。酰胺色譜柱屬于HILIC 系列，本實驗以其分離水溶性成分氨基葡萄糖和硫酸軟骨素，保留時間由C18色譜柱的2 min 左右延長至7 min（氨基葡萄糖） 和15 min（硫酸軟骨素） 左右，同時保留時間適中，分離效果較好。另外，氨基色譜柱雖也可用于糖類等大極性化合物的分離，但其重復性差，故綜合考慮，本實驗選擇HILIC 系列的Amide 色譜柱。

表1 各成分加樣回收率試驗結果（n＝6）

表2 各成分含有量測定結果（n＝3）

3.2 檢測器選擇 ELSD 作為通用型檢測器，不依賴于化合物光學特性，對非揮發(fā)化學組分均有良好的響應，廣泛應用于皂苷、萜類、生物堿、糖等中藥成分的質量控制［21］。另外，氨基葡萄糖、硫酸軟骨素幾乎無紫外吸收，可不經衍生化直接測定，操作簡便，靈敏度高，故選擇ELSD 檢測器。

3.3 流動相選擇 本實驗比較了乙腈-水、乙腈-甲酸，乙腈-三乙胺、乙腈-乙酸銨、乙腈-乙酸銨-三乙胺等流動相，發(fā)現(xiàn)乙腈-水洗脫時氨基葡萄糖、硫酸軟骨素均未出峰；乙腈-甲酸洗脫時氨基葡萄糖裂峰，峰形差，而硫酸軟骨素未出峰；乙腈-三乙胺洗脫時兩者均未出峰；乙腈-乙酸銨洗脫時兩者均出峰，但氨基葡萄糖裂峰，而且與硫酸軟骨素幾乎重合；乙腈-乙酸銨-三乙胺洗脫時，兩者保留時間合適，峰形相對較好，故選擇該流動相。然后，在此基礎上考察乙酸銨、三乙胺的濃度，優(yōu)選出分離效果最佳的乙腈-50 mmol／L 乙酸銨（含0.6%三乙胺）。

3.4 與GB 20365-2006 方法對比 前期取同一批樣品（批號20180201），按照GB 20365-2006 方法測定，發(fā)現(xiàn)氨基葡萄糖、硫酸軟骨素幾乎無保留，均在2 min 左右出峰，與雜質峰的分離度小于1.0，無法準確測定兩者含有量。本實驗發(fā)現(xiàn)2 種成分分別在6、14 min 左右出峰，保留時間適中，分離度大于1.5，而且所測含有量與相應理論值接近。

4 結論

本實驗采用HPLC-ELSD 法，參考GB／T 20365-2006 中供試品處理方法同時測定銀怡片中氨基葡萄糖、硫酸軟骨素的含有量，經方法學驗證發(fā)現(xiàn)，該成分專屬性、精密度、準確性、重復性等較好，而且操作簡便，靈敏度高，適合增加骨密度類保健食品中2 種成分含有量的同時測定，并為該類產品質量控制提供參考依據(jù)。