黔產(chǎn)徐長卿根莖化學成分及抗煙草花葉病毒活性

唐 攀，陳 潔，晏 英,，胡嘉琪，徐 冉,，張吉泉,，湯 磊,*

1貴州醫(yī)科大學藥學院，貴陽 550025；2貴州醫(yī)科大學 貴州省化學合成藥物研發(fā)利用工程技術研究中心，貴陽 550004

徐長卿Cynanchumpaniculatum(Bunge)Kitagawa為蘿摩科鵝絨藤屬多年生草本植物，其干燥根和根莖入藥，味辛、性溫，歸肝、腎經(jīng)，具有祛風化濕、止痛止癢的功能，用于治療風濕痹痛、胃痛脹滿、牙痛、腰痛、跌打傷痛、風疹、濕疹等癥[1]。全世界約有蘿摩科植物180屬，2 200種，分布于世界熱帶、亞熱帶和少數(shù)溫帶地區(qū)。我國約有44屬、245種、33變種，分布于西南及東南部以及少數(shù)西北與東北各省區(qū)。其主要成分丹皮酚具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗病毒、抗菌、抗蛇毒、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、保護心血管等作用[2]。臨床應用廣泛，已開發(fā)的徐長卿注射液用于鎮(zhèn)痛、消炎及類風濕性關節(jié)炎[3]，復方徐長卿洗劑聯(lián)合西藥用于各型濕疹的臨床治療[4]，復方徐長卿合劑作鼻腔沖洗，治療常年性變態(tài)性鼻炎[5]。研究發(fā)現(xiàn)，從徐長卿中分離得到的一系列seco-pregnane類C21甾體化合物具有很強的抗煙草花葉病毒(TMV)活性，該類化合物能高選擇性地抑制TMV亞基因組RNA的表達，而對病毒基因組RNA沒有影響，同時，化合物還能明顯抑制TMV的長距離移動[6]，說明該類C21甾體化合物對TMV新穎的作用機制為抗病毒制劑研究帶來新的機遇。為了繼續(xù)尋找具有抗TMV活性的化學成分，我們對黔產(chǎn)徐長卿根莖的化學成分進行了研究，并對化合物進行了抗TMV活性測試。

1 儀器與材料

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化，N-1300D-WD)，Bruker AV-600 MHz 核磁共振儀(德國布魯克公司)；四甲基硅烷(TMS)為內(nèi)標；Bruker HTC/Esquire 質(zhì)譜儀(德國布魯克公司)；高效液相色譜儀為Agilent 1200型(美國安捷倫科技司)；色譜柱Waters sunfire C18(10 × 150 mm，4.6 × 250 mm)(沃特世公司)；BP211D電子天平(Sartorouius公司)；高速冷凍離心機(2K15型，德國Sigma公司)，酶標儀(美國BIOTEK公司)，Sephadex LH-20(三菱公司)；C18反相硅膠(日本 YMC 公司)；正相硅膠和薄層色譜板(青島海洋化工廠)；核磁用氘代試劑(美國CIL氘代試劑)；液相用水(娃哈哈純凈水20181109)；色譜級甲醇、乙腈(科密歐試劑公司)；化學實驗用溶劑為工業(yè)重蒸溶劑，顯色劑為8%的硫酸乙醇溶液。

供試毒源：TMV(U1)普通株系，購于中國科學院武漢病毒研究所。保存于-20 ℃，臨用時取出用0.01 M PB稀釋至50 μg/mL。供試寄主：心葉煙(Nicotianaglutinosa)，為TMV枯斑寄主，普通煙K326(NicotianatabacumK326)，溫室中繁育，種子均購于中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所。

樣品采自貴州省黔東南州，經(jīng)過貴陽中醫(yī)學院孫慶文老師鑒定為徐長卿Cynanchumpaniculatum，憑證標本(XCQ201809)保存于貴州醫(yī)科大學藥學實驗室。

2 實驗方法

2.1 化合物提取與分離

干燥徐長卿根莖50 kg，用90%的乙醇回流提取3次，提取溫度為每次時間為3 h，濃縮回收酒精得粗提物約10 kg，加水混溶成渾濁液體，分別用石油醚、乙酸乙酯等體積萃取3次，回收乙酸乙酯得浸膏2.130 kg。乙酸乙酯部分經(jīng)過硅膠柱層析，用石油醚/丙酮(30∶1→0∶1)快速梯度洗脫得到Fr1～Fr6 共6個部分，其中Fr2(56g)以石油醚醚/丙酮(10∶1～5∶1)梯度洗脫，分成3個亞部分Fr2-1～Fr2-3，F(xiàn)r2-1反復經(jīng)過通過凝膠柱層析(甲醇)得化合物11(51.7 mg)，F(xiàn)r2-2經(jīng)過凝膠柱層析(甲醇)后再通過硅膠柱層析以石油醚醚/丙酮(7∶1)洗脫得到化合物12(29.6 mg)和13(19.5 mg)；Fr3(130 g)再次以二氯甲烷/甲醇(30∶1～5∶1)梯度洗脫，分成4個亞部分，分別為Fr3-1～Fr3-4。其中 Fr3-2經(jīng)過反相柱層析洗脫(甲醇∶水= 75∶25)得化合物1(15mg)，再經(jīng)過硅膠柱層析(石油醚/丙酮=5∶1)及高效液相色譜色譜 HPLC分離(流動相為甲醇∶水= 80∶20，流速為3 mL/min)得化合物3(12.2 mg)和4(9.8 mg)；Fr3-3通過凝膠柱層析(氯仿∶甲醇= 1∶1)得化合物2(23.1 mg)，F(xiàn)r3-4經(jīng)過反相柱層析洗脫(甲醇∶水= 65∶35)，再經(jīng)過高效液相色譜色譜HPLC制備分離(流動相為甲醇∶水= 80%∶20%，流速為3 mL/min)得化合物7(15.3 mg)和8(7.2 mg)；Fr3-1通過凝膠柱層析(純甲醇)再經(jīng)過硅膠柱層析(石油醚/丙酮=8∶1)得化合物9(10.5 mg)；Fr4(310 g)經(jīng)過二氯甲烷/甲醇(30∶1→5∶1)梯度洗脫，再用反相硅膠柱層析(甲醇∶水= 60∶40)洗脫分成Fr4-1～Fr4-6部分，F(xiàn)r4-6再通過凝膠柱層析(純甲醇)及高效液相色譜(流動相為甲醇∶水=75∶25，流速為3 mL/min)制備分離純化，得到化合物5(11.9 mg)；Fr4-5再經(jīng)過高效液相色譜(流動相為甲醇∶水=75∶25，流速為3 mL/min)制備分離純化得到化合物6(6.8 mg)和10(16.7 mg)。

2.2 化合物活性篩選

2.2.1 化合物對TMV的鈍化作用實驗

挑選健康長勢一致的5～6葉期的心葉煙，暗室放置一夜。將供試化合物與50 μg/mL的TMV 1∶1(V∶V)混合至所需濃度，混勻放置0.5 h。每棵煙挑選大小相似的4～6片葉子，每片葉子的一半摩擦接種化合物與TMV的混合溶液100 μL作為處理；另一半摩擦接種50 μg/mL TMV100 μL作為陽性對照；摩擦接種相應濃度DMSO溶液的葉片作為空白。2 h后用無菌水將葉表面的金剛砂洗凈。放入無蟲溫室中，3～4天后按公式計算TMV抑制率=[1-(處理的平均枯斑數(shù)/陽性對照的平均枯斑數(shù))]×100%[7]，每個化合物重復三次。

2.2.2 化合物對煙草的保護作用實驗

挑選健康長勢一致的5～6葉期的心葉煙，暗室放置一夜。每棵煙挑選大小相似的4～6片葉子，供試化合物用無菌水稀釋為所需濃度，每片葉子的一半均勻施藥100 μL作為處理，24 h后每片葉子摩擦接種50 μg/mL TMV 200 μL，未施藥的一半作為陽性對照，未施藥且摩擦接種相應濃度DMSO溶液的葉片作為空白。2 h后用無菌水將葉表面的金剛砂洗凈。放入無蟲溫室中，3～4天后按公式計算TMV抑制率=[1-(處理的平均枯斑數(shù)/陽性對照的平均枯斑數(shù))]×100%，每個化合物重復三次。

2.2.3 化合物對煙草的治療作用實驗

挑選健康長勢一致的5～6葉期的心葉煙，暗室放置一夜。每棵煙挑選大小相似的4～6片葉子摩擦接種50 μg/mL TMV 200 μL，2h后每片葉子的一半均勻施藥100 μL作為處理；另一半作為陽性對照；未施藥且摩擦接種相應濃度DMSO溶液的葉片作為空白。2 h后用無菌水將葉表面的金剛砂洗凈。放入無蟲溫室中，3～4天后按公式計算TMV抑制率=[1-(處理的平均枯斑數(shù)/陽性對照的平均枯斑數(shù))]×100%，每個化合物重復三次。

2.2.4 離體葉圓片法

挑選健康合適的普通煙，暗室放置一夜。每棵煙挑選大小相似的3片葉子，每片葉子摩擦接種0.032 μg/μL TMV 200 μL，10 min后用無菌水沖洗干凈。6 h后將葉片切成直徑1 cm的圓片，取20片浸入供試化合物溶液中作為處理；另20片浸入25 μL/mL DMSO溶液中作為陽性對照；只摩擦未接種的20片浸入25 μL/mL DMSO溶液中作為空白。放入28 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后進行TAS-ELISA，測定OD405值，根據(jù)TMV病毒標準曲線計算TMV濃度，按公式計算TMV抑制率=[1-(處理的TMV濃度/陽性對照的TMV濃度)]×100%[8]，每個化合物重復三次。

3 實驗結(jié)果

3.1 結(jié)構鑒定

化合物1白色粉末；ESI-MS：m/z399[M +Na]+，確定分子質(zhì)量376；分子式C21H28O6；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.28(1H，s，H-18)，5.46(1H，d，J= 6.0 Hz，H-6)，5.33(1H，m，H-16)，4.17(1H，t，J= 6.0 Hz，H-15β)，3.86(1H，t，J= 6.0 Hz，H-15α)，3.71(1H，m，H-2)，3.45(1H，d，J= 6.0 Hz，H-17)，3.34(1H，m，H-3)，2.62(1H，m，H-11α)，2.59(2H，m，H-7)，2.44(1H，m，H-8)，2.28(1H，t，J= 11.2 Hz，H-1α)，2.12(2H，m，H-4)，2.06(1H，m，H-12α)，1.55(1H，s，H-21)，1.36(1H，m，H-11β)，1.27(1H，m，H-9)，1.25(1H，m，H-12β)，1.08(1H，t，J= 11.2Hz，H-1β)，0.97(1H，m，H-19)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：175.4(C-14)，143.4(C-18)，138.8(C-5)，121.0(C-6)，118.2(C-20)，113.8(C-13)，76.1(C-16)，75.1(C-2)，72.2(C-3)，67.3(C-15)，55.7(C-17)，52.5(C-9)，44.1(C-1)，39.9(C-8)，39.9(C-10)，38.8(C-4)，29.7(C-12)，27.9(C-7)，24.6(C-21)，23.6(C-11)，19.1(C-19)。以上數(shù)據(jù)與文獻[9]報道基本一致，故鑒定化合物1為glaucogenin A。

化合物2白色粉末；ESI-MS：m/z543[M +Na]+，確定分子質(zhì)量520；分子式C28H40O9；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.29(1H，s，H-18)，5.44(1H，d，J= 6.0 Hz，H-6)，5.34(1H，m，H-16)，4.57(1H，dd，J= 1.8，12.0 Hz，H-1′)，4.17(1H，t，J= 6.0 Hz，H-15β)，3.86(1H，t，J= 6.0 Hz，H-15α)，3.73(1H，m，H-2)，3.45(1H，m，H-4′)，3.42(1H，s，H-6′-OCH3)，3.40(1H，m，H-17)，3.30(1H，m，H-3)，3.23(1H，m，H-5′)，3.20(1H，m，H-3′)，2.53(1H，m，H-11α)，2.48(1H，m，H-8)，2.40(1H，m，H-7α)，2.34(1H，m，H-4β)，2.34(1H，m，H-2′α)，2.29(1H，m，H-4α)，2.27(1H，m，H-12α)，2.06(1H，m，H-7β)，2.04(1H，m，H-1α)，1.55(1H，s，H-21)，1.53(1H，m，H-2′β)，1.38(1H，d，J= 6.0 Hz，H-6′)，1.28(1H，m，H-11β)，1.26(1H，m，H-12β)，1.24(1H，t，J= 6.0 Hz，H-9)，1.03(1H，m，H-1β)，0.97(1H，m，H-19)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：175.4(C-14)，143.5(C-18)，139.0(C-5)，120.8(C-6)，118.1(C-20)，113.7(C-13)，99.9(C-1′)，86.8(C-3)，80.5(C-4′)，75.2(C-16)，75.2(C-3′)，71.9(C-2)，69.7(C-5′)，67.5(C-15)，56.4(C-17)，55.7(C-7′)，52.6(C-9)，43.8(C-1)，39.9(C-8)，39.2(C-10)，37.4(C-4)，35.5(C-2′)，29.7(C-12)，28.0(C-7)，24.6(C-21)，23.6(C-11)，18.9(C-6′)，17.7(C-19)。以上數(shù)據(jù)與文獻[10]報道基本一致，故鑒定化合物2為glaucogenin A 3-O-β-D-cymaropyranoside。

化合物3白色粉末；ESI-MS：m/z467[M +Na]+，確定分子質(zhì)量444；分子式C27H28N2O4；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：7.74(2H，d，J= 6.0 Hz，H-2′，H-6′)，7.56(1H，t，J= 7.2 Hz，H-4′)，7.47(2H，t，J= 7.6 Hz，H-3′，H-5′)，7.32～7.08(10H，m)，6.84(1H，d，J= 8.4 Hz，H-5)，6.12(1H，d，J= 9.6 Hz，H-5)，4.81(1H，m，H-7)，4.37(1H，m，H-4)，3.96(1H，dd，J= 12.0，4.8 Hz，H-3β)，3.84(1H，dd，J= 12.0，4.8 Hz，H-3α)，3.23(1H，dd，J= 12.0，6.0 Hz，H-10β)，3.08(1H，dd，J= 12.0，6.0 Hz，H-10α)，2.75(2H，m，H-11)，2.05(3H，s，1-H-OCH3)；13C NMR(600 MHz，CDCl3)δ：170.8(C-2)，170.3(C-6)，167.1(C-9)，136.7(C-1′′)，136.7(C-1′′′)，133.7(C-1′)，131.9(C-4′)，129.3(C-3′′)，129.3(C-5′′)，129.3(C-3′)，129.3(C-5′)，129.1(C-3′′′)，129.1(C-5′′′)，128.8(C-2′′)，128.8(C-6′′)，128.7(C-2′)，128.7(C-6′)，128.6(C-2′′′)，128.6(C-6′′′)，127.1(C-4′′)，126.8(C-4′′′)，64.6(C-3)，55.0(C-7)，49.4(C-4)，38.5(C-10)，37.4(C-10)，20.8(C-1)。以上數(shù)據(jù)與文獻[11]報道基本一致，故鑒定化合物3為N-(N-benzoyl-S-phenylalaninyl)-S-phenylalaninol acetate。

化合物4白色粉末；ESI-MS：m/z529[M +Na]+，確定分子質(zhì)量506；分子式C32H30N2O4；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：7.73(1H，d，J= 9.0 Hz，H-2′)，7.73(1H，d，J= 9.0 Hz，H-6′)，7.69(1H，d，J= 9.0 Hz，H-2′′′′)，7.69(1H，d，J= 9.0 Hz，H-6′′′′)，7.54(1H，t，J= 6.0 Hz，H-4′′′′)，7.46～7.23(15H，m)，6.69(1H，d，J= 9.6 Hz，H-4)，6.56(1H，d，J= 7.2 Hz，H-7)，4.96(1H，q，J= 7.2 Hz，H-6)，4.64(1H，m，H-3)，4.08(1H，dd，J= 1.8，9.6 Hz，H-2)，3.34(1H，dd，J= 9.0，14.4 Hz，H-10)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：171.9(C-5)，167.4(C-8)，167.2(C-1)，137.2(C-1′′′)，135.8(C-1′′)，134.2(C-1′)，133.3(C-1′′′′)，132.0(C-4′′′′)，131.4(C-4′)，129.3(C-3′′)，129.3(C-5′′)，129.2(C-3′′′)，129.2(C-5′′′)，128.9(C-2′′)，128.9(C-6′′)，128.7(C-2′′′′)，128.7(C-6′′′′)，128.7(C-2′′′)，128.7(C-6′′′)，128.4(C-2′)，128.4(C-6′)，127.4(C-4′′)，127.1(C-3′)，127.1(C-5′)，127.1(C-3′′′′)，127.1(C-5′′′′)，126.8(C-4′′′)，65.4(C-2)，54.5(C-6)，50.3(C-3)，37.5(C-9)，37.3(C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻[12]報道基本一致，故鑒定化合物4為N-(N-benzoyl-S-phenylalaninyl)-S-phenylalaninol benzoate。

化合物5白色粉末；ESI-MS：m/z307[M +Na]+，確定分子質(zhì)量284；分子式C19H24O2；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.20(1H，s，H-6)，6.20(1H，s，H-7)，5.71(1H，s，H-4)，2.48(1H，m，H-2β)，2.46(1H，m，H-16β)，2.38(1H，m，H-2α)，2.15(1H，m，H-12β)，2.12(1H，m，H-16α)，2.03(1H，m，H-1β)，2.02(1H，m，H-15α)，1.89(1H，m，H-8)，1.74(1H，m，H-12α)，1.72(1H，m，H-1α)，1.71(1H，m，H-15β)，1.70(1H，m，H-11α)，1.53(1H，m，H-14)，1.47(1H，m，H-11β)，1.33(1H，m，H-9)，1.16(1H，s，H-19)，0.98(1H，s，H-18)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：219.5(C-17)，199.4(C-3)，162.9(C-5)，138.4(C-7)，128.8(C-6)，124.2(C-4)，50.8(C-14)，48.7(C-9)，48.3(C-13)，37.0(C-10)，36.1(C-8)，35.6(C-16)，33.9(C-1)，33.9(C-1)，31.3(C-12)，21.4(C-15)，20.0(C-11)，16.3(C-19)，13.7(C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻[13]報道基本一致，故鑒定化合物5為androst-4,6-dien-3,17-dione。

化合物6白色粉末；ESI-MS：m/z337[M +Na]+，確定分子質(zhì)量314；分子式C21H30O2；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.14(1H，dd，J= 9.8，2.6 Hz，H-6)，6.12(1H，d，J= 9.8 Hz，H-7)，5.69(1H，s，H-4)，3.77(1H，m，H-20)，2.45(1H，m，H-2β)，2.36(1H，m，H-2α)，2.25(1H，m，H-12β)，2.05(1H，m，H-1β)，2.03(1H，m，H-15α)，2.02(1H，m，H-16α)，1.76(1H，m，H-8)，1.74(1H，m，H-12α)，1.72(1H，m，H-11α)，1.70(1H，m，H-1α)，1.68(1H，m，H-15β)，1.67(1H，m，H-16β)，1.53(1H，m，H-14)，1.47(1H，m，H-11β)，1.32(1H，m，H-9)，1.27(1H，d，J= 6.0 Hz，H-20)，1.16(3H，s，H-19)，0.98(3H，s，H-18)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：199.6(C-3)，163.8(C-5)，141.2(C-7)，128.0(C-6)，123.6(C-4)，70.0(C-20)，58.1(C-14)，53.9(C-17)，50.7(C-9)，42.7(C-13)，38.6(C-12)，37.3(C-8)，36.1(C-10)，34.0(C-1)，33.9(C-2)，25.5(C-16)，23.6(C-15)，23.6(C-21)，20.4(C-11)，16.3(C-19)，12.5(C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻[14]報道基本一致，故鑒定化合物6為20-hydroxy-4,6-diene-gestrol-3-one。

化合物7黃色粉末；ESI-MS：m/z307[M +Na]+，確定分子質(zhì)量284；分子式C16H12O5；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：13.03(1H，s，5-OH)，7.92(2H，m，H-2′，6′)，7.58(3H，m，H-3′，4′，5′)，6.68(1H，s，H-8)，6.63(1H，s，H-3)，4.09(3H，s，OCH3-6)；13C NMR(CDCl3，150 MHz)δ：183.0(C-4)，164.1(C-2)，155.2(C-7)，153.3(C-5)，152.1(C-9)，131.9(C-4′)，130.4(C-1′)，130.4(C-6)，129.1(C-3′)，129.1(C-5′)，126.3(C-2′)，126.3(C-6′)，105.9(C-3)，105.3(C-10)，93.4(C-8)，60.9(OCH3-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻[15]報道基本一致，故鑒定化合物7為5,7-dihydroxy-6-methoxyflavone。

化合物8黃色粉末；ESI-MS：m/z307[M +Na]+，確定分子質(zhì)量284；分子式C16H12O5；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：12.52(1H，s，OH-5)，7.92(1H，m，H-2′，6′)，7.59(1H，m，H-3′，4′，5′)，6.72(1H，s，H-3)，6.48(1H，s，H-6)，4.07(1H，s，OCH3-6)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：182.5(C-4)，163.5(C-2)，157.8(C-7)，155.3(C-5)，148.9(C-9)，132.0(C-4′)，131.3(C-1′)，129.3(C-3′)，129.3(C-5′)，126.9(C-8)，126.2(C-2′)，126.2(C-6′)，105.3(C-3)，105.3(C-10)，98.9(C-6)，62.1(OCH3-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻[16]報道基本一致，故鑒定化合物8為5,7-dihydroxy-8-methoxyflavone。

化合物9無色粉末；ESI-MS：m/z218[M +Na]+，確定分子質(zhì)量195；分子式C11H17NO2；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：9.66(1H，s，H-2-CHO)，6.96(1H，d，J= 4.8 Hz，H-3)，6.26(1H，d，J= 4.8 Hz，H-4)，4.40(2H，m，H-1′)，3.67(3H，s，H-6)，1.61(2H，m，H-2′)，1.60(2H，m，H-3′)，1.36(3H，s，H-4′)，1.31(3H，s，H-5′)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：179.3(C-1)，135.2(C-2)，131.5(C-5)，125.0(C-3)，109.7(C-4)，51.7(C-6)，48.0(C-1′)，34.9(C-2′)，30.2(C-4′)，26.4(C-3′)，23.4(C-5′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[17]報道基本一致，故鑒定化合物31為5-(hydroxymethyl)-1-isopentyl-1H-pyrrole-2-carbaldehyde。

化合物10白色粉末；ESI-MS：m/z207[M +Na]+，確定分子質(zhì)量184；分子式C10H16O3；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.91(1H，t，J= 6.0 Hz，H-3)，5.91(1H，q，J= 6.0 Hz)，5.27(1H，d，J= 18.0 Hz，H-8α)，5.12(1H，d，J= 12.0 Hz，H-8β)，2.26(2H，m，H-4)，1.83(3H，s，H-9)，1.67(2H，m，H-5)，1.33(3H，s，H-10)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：173.1(C-1)，144.7(C-7)，144.3(C-8)，127.2(C-2)，112.4(C-3)，73.2(C-6)，40.4(C-5)，27.9(C-10)，23.7(C-4)，12.0(C-9)。以上數(shù)據(jù)與文獻[18]報道基本一致，故鑒定化合物10為mono-terpenes。

化合物11白色粉末；ESI-MS：m/z247[M +Na]+，確定分子質(zhì)量224；分子式C11H12O5；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：12.12(1H，s，H-3′-COOH)，8.86(1H，s，3-OH)，7.51(1H，d，J= 18.0 Hz，H-1′)，6.99(2H，s，H-1)，6.99(2H，s，H-5)，6.43(1H，d，J= 18.0 Hz，H-2′)，3.82(3H，s，H-2-OCH3)，3.82(3H，s，H-4-OCH3)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：168.0(C-3′)，148.0(C-2)，148.0(C-4)，144.8(C-1′)，138.0(C-3)，124.6(C-6)，116.1(C-2′)，106.1(C-1)，106.1(C-5)，56.1(OCH3-2)，56.1(OCH3-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻[19]報道基本一致，故鑒定化合物11為4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoic acid。

化合物12白色粉末；ESI-MS：m/z265[M +Na]+，確定分子質(zhì)量242；分子式C12H18O5；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：6.51(2H，s，H-2，6)，3.91(6H，s，H-3，5-OCH3)，3.80(1H，m，H-8)，3.75(1H，d，J= 8.4 Hz，H-7)，3.24(3H，s，7-H-OCH3)，0.97(d，J= 6.6 Hz，H-9)；13C-NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：147.1(C-3，5)，134.6(C-4)，129.5(C-1)，104.3(C-2)，104.3(C-6)，89.3(C-7)，71.5(C-8)，56.6(OCH3-7)，56.3(OCH3-3)，56.3(OCH3-5)，18.1(C-9)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[20]報道基本一致，故可鑒定化合物12為pavonisol。

化合物13白色粉末；ESI-MS：m/z221[M+Na]+，確定分子質(zhì)量198；分子式C9H10O5；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：7.40(2H，s，H-2，6)，3.97(6H，s，H-3，5-OCH3)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：170.6(C=O)，146.7(C-3)，146.7(C-5)，140.0(C-1)，120.0(C-4)，107.4(C-2)，107.4(C-6)，56.5(OCH3-3)，56.5(OCH3-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻[21]報道基本一致，故鑒定化合物13為4-hydroxy-3,5-dimethoxy-benzoic acid。

3.2 抗煙草花葉病毒活性結(jié)果

采用2.2的三種半葉枯斑法和離體葉圓片法對分離得到的化合物1～10進行抗TMV活性測試，以寧南霉素作為陽性對照藥物。測試結(jié)果見表1。從活性結(jié)果來看，化合物1～4和9均有鈍化的抗TMV活性，但是化合物1～3均不具有保護活性，說明化合物1～3的抗TMV活性不是由植物系統(tǒng)獲得抗性產(chǎn)生?；衔?具有保護活性，說明其抗TMV活性除了作用于TMV病毒外，還由植物系統(tǒng)獲得抗性產(chǎn)生。以上化合物活性均與離體葉圓片法活性相同，并首次發(fā)現(xiàn)化合物3、4、9具有抗TMV活性。

表1 化合物1～10的抗TMV活性結(jié)果

注：寧南霉素為陽性對照藥物，a50 μg/mL，b50 μg/mL，c200 μg/mL，d200 μg/mL。

Note:Ningnanmycin was used as positive control drug,a50 μg/mL,b50 μg/mL,c200μg/mL,d200 μg/mL.

4 結(jié)論

通過應用多種色譜方法從蘿藦科植物徐長卿根莖的乙醇提取物中分離得到 13個單體化合物，化合物2～5和7～10為首次從該植物中分離得到。對化合物1～10進行抗TMV活性測試，從活性結(jié)果來看，化合物1～4和9均有鈍化的抗TMV活性，且化合物4具有保護活性，說明化合物4抗TMV活性除了作用于TMV病毒外，還由植物系統(tǒng)獲得抗性產(chǎn)生。除了seco-pregnane類C21甾體化合物外，首次發(fā)現(xiàn)化合物3、4、9具有抗TMV活性，豐富抗TMV化合物結(jié)構的多樣性。本研究成果豐富了徐長卿根莖中的化學成分及生物活性內(nèi)容，為其進一步的研究開發(fā)提供參考資料。