基于UPLC-ESI-IT-TOF-MS方法對(duì)血府逐瘀湯中8個(gè)成分同時(shí)含量測(cè)定

傅春燕，王惠余，劉永輝，王 楊

1中南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，長(zhǎng)沙 410083；2邵陽(yáng)學(xué)院藥學(xué)院和食品與化學(xué)工程學(xué)院；3邵陽(yáng)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，邵陽(yáng) 422000；4中南大學(xué)湘雅醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究所，長(zhǎng)沙 410008

血府逐瘀湯是著名的中藥方劑，源自清代王清任的《醫(yī)林改錯(cuò)》，由11味藥組成：紅花、桃仁、生地、當(dāng)歸、牛膝、枳殼、柴胡、赤芍、桔梗、甘草、川芎[1]，具有活血，祛瘀，止痛的功能，常用于氣滯血瘀、失眠、長(zhǎng)期頭痛、狂躁、內(nèi)熱等癥[2]。藥理研究表明，血府逐瘀湯具有抗氧化、抗炎[3]、抗血栓[2,4]、抗血小板活化[4]的作用，臨床上還用于顱腦損傷[5]等的治療。

《中國(guó)藥典》第一部(2015年版)對(duì)血府逐瘀制劑(血府逐瘀丸、血府逐瘀膠囊等)以芍藥苷、柚皮苷或苦杏仁苷等少數(shù)幾個(gè)活性成分含量作為質(zhì)量控制指標(biāo)，難以全面客觀反映中藥的整體作用[6]。對(duì)血府逐瘀湯化學(xué)成分研究，文獻(xiàn)報(bào)道常用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)定性[7]，用液相色譜技術(shù)[8]或薄層色譜技術(shù)[8]定量一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)成分，這些技術(shù)都難以實(shí)現(xiàn)中藥復(fù)雜成分的分離，且存在分析時(shí)間長(zhǎng)、檢測(cè)靈敏度低的現(xiàn)象。而UPLC-ESI-IT-TOF-MS分析技術(shù)，既具有超高效液相色譜的快速、靈敏地分離復(fù)雜成分的優(yōu)點(diǎn)，又能發(fā)揮IT-TOF-MS質(zhì)譜檢測(cè)器的保留時(shí)間穩(wěn)定、質(zhì)量數(shù)穩(wěn)定、分子量精確[9]的特點(diǎn)，除用于復(fù)雜成分精準(zhǔn)定性檢測(cè)外，還可用于質(zhì)譜定量分析。因此，采用質(zhì)譜法對(duì)化學(xué)成分進(jìn)行含量測(cè)定，不僅準(zhǔn)確可靠，還能解決目前血府逐瘀湯制劑分析中分析儀器和分析方法的局限性。

本研究選取血府逐瘀湯的主要活性成分苦杏仁苷、羥基紅花黃色素A、甘草苷、蘆丁、蕓香柚皮苷、柚皮苷、新橙皮苷和柴胡皂苷A，藥理研究表明，柚皮苷、新橙皮苷和蕓香柚皮苷有抗腫瘤、抗氧化、抗過(guò)敏和抗炎活性[10]；柴胡皂苷A有抗癌、抗病毒、抗炎和調(diào)節(jié)免疫作用[11]；甘草苷對(duì)神經(jīng)有保護(hù)作用[12]；蘆丁表現(xiàn)出抗氧化活性，阻止低密度脂蛋白氧化，阻斷血小板聚集[13]；苦杏仁苷有抗動(dòng)脈粥樣硬化、神經(jīng)保護(hù)和免疫調(diào)節(jié)作用[14]；羥基紅花黃色素A有擴(kuò)張血管、降血壓、抗血小板凝聚、改善心肌缺血[15]，還用于治療腦缺血[16]。中藥通過(guò)多種成分、多種途徑和多個(gè)靶點(diǎn)達(dá)到治療疾病的，是多種活性成分整體作用產(chǎn)生的結(jié)果[17]。因此，建立血府逐瘀湯多種有效成分同時(shí)測(cè)定方法，有利于整體評(píng)價(jià)中藥制劑的質(zhì)量，為血府逐瘀湯的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

本文基于前期對(duì)血府逐瘀湯化學(xué)成分定性研究的基礎(chǔ)上，采用UPLC-ESI-IT-TOF-MS技術(shù)對(duì)血府逐瘀湯中的8個(gè)成分同時(shí)定量研究，建立一種簡(jiǎn)便、快速、高效、高分辨、高選擇性、高靈敏度檢測(cè)血府逐瘀湯中的化合物的方法，采用準(zhǔn)分子離子外標(biāo)法測(cè)定化合物的含量，以期對(duì)血府逐瘀湯的化學(xué)成分進(jìn)行有效的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

超高效液相色譜-電噴霧-離子肼-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(UPLC-ESI-IT-TOF-MS)(Shimadzu，Japan)，包括二元梯度泵(LC-30AD)、自動(dòng)進(jìn)樣器(SIL-30AC)、脫氣機(jī)(DGU-30A3)、光電二極管陣列檢測(cè)器(SPD-M20A)、控制器(CBM-20A)、柱溫箱(CTO-30AC)、ESI離子源和IT-TOF高分辨質(zhì)譜儀(Shimadzu，Japan)。對(duì)照品苦杏仁苷(amygdalin，批號(hào)13011801)、羥基紅花黃色素A(hydroxysafflor yellow A，HSYA，批號(hào)12081605)、甘草苷(liquiritin，批號(hào)13020901)、蘆丁(rutin，批號(hào)13020911)、蕓香柚皮苷(narirutin，批號(hào)14060310)、柚皮苷(niringin，批號(hào)14101208)、新橙皮苷(neohesperidin，批號(hào)14122405)、和柴胡皂苷A(saikosaponin A，批號(hào)12052402)都為HPLC級(jí)(純度≥98%，成都曼思特公司)。甲酸為HPLC級(jí)(Sigma-Aldrich，上海)，甲醇和乙腈都為HPLC級(jí)(Merck Darmstadt，德國(guó))，水為純凈水(娃哈哈集團(tuán)，杭州)，其他試劑均為分析純。

8個(gè)不同批次血府逐瘀湯處方所用飲片，分別購(gòu)自同仁堂藥房(湖南長(zhǎng)沙)4批，懷仁大藥房(湖南長(zhǎng)沙)4批，由中南大學(xué)湘雅醫(yī)院中藥學(xué)專家胡隨瑜教授鑒定為本藥劑的中藥飲片，樣本保存于本實(shí)驗(yàn)室(編號(hào)：CSU-20181001-20181008)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

參考文獻(xiàn)[18]，Shim-Pack XR-ODS C18色譜柱(2.0 mm ×75 mm，1.6 μm)，以水/甲酸(0.1%)(A)-乙腈(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫：0～1 min，10% B；1～3 min，10%→13% B；3～7 min，13%→17% B；7～11 min，17%→21% B；11～16 min，21%→25% B；16～21 min，25%→35% B；21～28 min，35%→44% B；28～30 min，44%→60% B；30～31 min，60%→70% B；31～32 min，70%→90% B；32～35 min，90% B；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣體積：5 μL；柱溫：40 ℃。

2.2 質(zhì)譜條件

參考文獻(xiàn)[18]，質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置為：電噴霧離子化模式為ESI(+)和ESI(-)同時(shí)采集；干燥氣壓力為100 KPa；離子噴霧接口電壓：ESI(+)為4.5 kV，ESI(-)為3.5 kV；檢測(cè)電壓為1.56 kV；霧化氣流速為液氮1.5 L/min；CDL和加熱模塊溫度均為200 ℃，儀器溫度為40 ℃；脈沖式碰撞氣為高純Ar氣，碰撞頻率為45 kHz。一級(jí)MS1質(zhì)譜全掃描和多級(jí)MSn全自動(dòng)掃描，m/z范圍為50～1 500 Da，離子積累時(shí)間設(shè)置為30 ms(MS1)和50 ms(MS2)。數(shù)據(jù)采集用LCMS solution 3.8軟件(Shimadzu，Tokyo，Japan)，借助精確分子量計(jì)算軟件和分子式預(yù)測(cè)軟件處理數(shù)據(jù)。

2.3 對(duì)照品溶液的制備與標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精確稱取一定質(zhì)量的上述8個(gè)對(duì)照品，分別溶于甲醇后配制成一定濃度的溶液，8個(gè)對(duì)照品溶液的濃度分別為：苦杏仁苷3.50 mg/mL，羥基紅花黃色素A 6.70 mg/mL，甘草苷4.70 mg/mL，蘆丁2.10 mg/mL，蕓香柚皮苷4.80 mg/mL，柚皮苷 3.60 mg/mL，新橙皮苷5.10 mg/mL和柴胡皂苷A 1.07 mg/mL，精確取上述對(duì)照品溶液適量，混合后加甲醇稀釋得貯備液，逐級(jí)2倍稀釋貯備液制得6個(gè)濃度梯度的對(duì)照品混合溶液，按上述“色譜條件”和“質(zhì)譜條件”分別進(jìn)樣3次，以進(jìn)樣濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，得到各成分的回歸方程、線性關(guān)系、檢測(cè)限(LOD)及定量限(LOQ)。

2.4 血府逐瘀湯供試品溶液的制備

按處方取血府逐瘀湯各飲片共78 g，粉碎(100目)，加水1 L浸泡30 min，煎煮15 min，八層紗布過(guò)濾，濾液備用。藥渣繼續(xù)加水煎煮兩次，每次15分鐘，合并三次濾液，在70 ℃以下真空濃縮至粗提物濃度為1.0 g生藥/mL，使用前用去離子水稀釋100倍，0.22 μm濾膜過(guò)濾，制得的待測(cè)溶液儲(chǔ)存在4 ℃下備用。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度實(shí)驗(yàn)

分別精密吸取低、中、高3個(gè)濃度梯度的對(duì)照品混合溶液，1天之內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，連續(xù)3天分別進(jìn)樣，計(jì)算各成分濃度的RSD，進(jìn)行日內(nèi)精密度和日間精密度考察[19]。

2.5.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：

取批號(hào)為20181001血府逐瘀湯處方飲片，按2.4項(xiàng)下方法制得樣品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12、24 h連續(xù)進(jìn)樣3次，測(cè)定各成分的保留時(shí)間和峰面積，計(jì)算RSD。

2.5.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取批號(hào)為20181001血府逐瘀湯處方飲片共6份，按“2.4”項(xiàng)下分別平行制備樣品溶液6份，各進(jìn)樣3次，記錄峰面積，計(jì)算各成分濃度的RSD。

2.5.4 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精確吸取已制備的6份已知濃度血府逐瘀湯溶液適量，分別加入等體積對(duì)照品混合溶液(含苦杏仁苷13.13 μg/mL、羥基紅花黃色素A 670.00 μg/mL、甘草苷5.34 μg/mL、蘆丁0.164 μg/mL、蕓香柚皮苷9.00 μg/mL、柚皮苷13.50 μg/mL、新橙皮苷12.75 μg/mL和柴胡皂苷A 0.0672 μg/mL)，每個(gè)樣品進(jìn)樣3次，按“(測(cè)得量-原始量)/加入量×100”計(jì)算各成分平均加樣回收率和RSD。

2.6 樣品含量測(cè)定

按“2.4”項(xiàng)下方法制備8個(gè)不同批次的血府逐瘀湯制備液，每份進(jìn)樣3次，測(cè)定8個(gè)成分的含量。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 線性關(guān)系、檢測(cè)限及定量限

8個(gè)成分的回歸方程、線性關(guān)系、LOD和LOQ如表1，8個(gè)對(duì)照品提取離子流(extraction ion current，EIC)如圖1，保留時(shí)間和質(zhì)譜信息如表2。結(jié)果表明，各成分在其相應(yīng)線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r>0.99)。

表1 8個(gè)成分的回歸方程、線性范圍、檢測(cè)限和定量限

注：aY表示峰面積，X表示標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度；bLOD是指檢測(cè)限，S/N=3；cLOQ是指定量限，S/N=10。

Note:aY is the peak area,X is the concentration of standard solutions;bLOD refers to the limits of detection,S/N=3;cLOQ refers to the limits of quantitation,S/N=10.

表2 8個(gè)對(duì)照品的保留時(shí)間和質(zhì)譜信息

圖1 8個(gè)成分的提取離子流圖

3.2 精密度

以低、中、高3個(gè)濃度梯度的對(duì)照品混合溶液進(jìn)行日內(nèi)精密度和日間精密度考察，如表3，結(jié)果表明，日內(nèi)和日間精密度RSD均小于5%，說(shuō)明方法的精密度良好。

3.3 穩(wěn)定性

血府逐瘀湯處方飲片的制備液在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好，8個(gè)成分的RSD均小于5%，各成分在負(fù)離子模式總離子流圖(TIC)中的歸屬如圖2A，在正離子模式TIC中的歸屬如圖2B，提取離子流圖如圖2C。

圖2 血府逐瘀湯中8個(gè)成分的歸屬圖

表3 日內(nèi)精密度和日間精密度

續(xù)表3(Continued Tab.3)

No.成分Compound濃度Concentration(μg/mL)日內(nèi)精密度Intra-day(n=6)RSD(%)日間精密度Inter-day(n=3)RSD(%)6柚皮苷Naringin1.694.954.0513.504.034.9354.003.603.937新橙皮苷Neohesperidin1.594.164.6712.751.633.7951.004.612.968柴胡皂苷ASaikosaponinA0.0183.894.090.672.033.652.681.522.03

3.4 重復(fù)性

取血府逐瘀湯處方飲片6份進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，8個(gè)成分濃度的RSD分別為：苦杏仁苷3.53%、羥基紅花黃色素A 3.20%、甘草苷3.45%、蘆丁2.67%、蕓香柚皮苷2.35%、柚皮苷3.07%、新橙皮苷3.40%和柴胡皂苷A 4.26%，RSD均小于5%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.5 加樣回收率

8個(gè)成分平均加樣回收率和RSD如表4，結(jié)果表明，各成分的加樣回收率都在89.8%～108.1%范圍內(nèi)，3次進(jìn)樣的RSD均小于5%。

3.6 樣品含量測(cè)定

8個(gè)不同批次的血府逐瘀湯中所含8個(gè)成分在原溶液中的含量如表5。

4 討論

4.1 血府逐瘀湯提取方法的選擇

本實(shí)驗(yàn)考慮到后續(xù)將進(jìn)行血府逐瘀湯的藥代動(dòng)力學(xué)研究需要?jiǎng)游飳?shí)驗(yàn)，故需排除有機(jī)溶劑提取時(shí)溶劑的殘留對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生毒性的影響，因此采取水煎煮法提取血府逐瘀湯的制備溶液，既簡(jiǎn)單方便，又避免了有機(jī)溶劑的使用，符合動(dòng)物口服溶液的要求，同時(shí)有利于實(shí)現(xiàn)綠色環(huán)保化學(xué)。

4.2 流動(dòng)相的選擇

實(shí)驗(yàn)比較了水/甲酸(0.05%)-乙腈、水/甲酸(0.1%)-乙腈、水/甲酸(0.05%)-乙腈/甲酸(0.05%)、水/甲酸(0.1%)-乙腈/甲酸(0.1%)等流動(dòng)相系統(tǒng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，水/甲酸(0.1%)-乙腈流動(dòng)相系統(tǒng)分離效果較好，色譜峰的峰形較好，達(dá)到了被分析物均已基線分離。

表4 8個(gè)成分的加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表5 8個(gè)不同批次血府逐瘀湯中8個(gè)成分的含量

4.3 分析方法的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)

本實(shí)驗(yàn)是基于UPLC-ESI-IT-TOF-MS的方法對(duì)血府逐瘀湯進(jìn)行定性、定量研究，有著其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)：(1)充分利用IT-TOF-MS實(shí)現(xiàn)瞬時(shí)正負(fù)離子模式轉(zhuǎn)換，能提供更多的離子碎片信息，有利于中藥成分的定性鑒定。例如，蘆丁和柴胡皂苷A在負(fù)離子模式下離子化效果不好而檢測(cè)不到離子碎片，采用正離子模式卻能實(shí)現(xiàn)定性定量檢測(cè)，其他6個(gè)成分在負(fù)離子模式下離子化效果更佳，從而優(yōu)先選擇負(fù)離子模式進(jìn)行分析。相對(duì)于其他技術(shù)，IT-TOF-MS技術(shù)擴(kuò)大了分析檢測(cè)的范圍，更有利于復(fù)雜中藥成分的定性定量研究。(2)IT-TOF-MS具有高質(zhì)量精度、高分辨率、質(zhì)量數(shù)精確和穩(wěn)定的特點(diǎn)，可以從質(zhì)譜中提取特征離子峰，以避免的其他離子的干擾，采用外標(biāo)法定量特征準(zhǔn)分子離子峰，從這點(diǎn)上該方法有著其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，且結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

4.4 雜質(zhì)干擾較大

由于血府逐瘀湯的制備是采用水提方法，提取物中雜質(zhì)較多，造成部分成分受雜質(zhì)干擾大，離子化效果降低，因而化學(xué)成分含量降低，如柴胡皂苷A和蘆丁的平均含量分別為0.022 3和0.003 0 mg/mL。但是羥基紅花黃色素A在血府逐瘀湯中含量相對(duì)較高，平均含量達(dá)到40.466 9 mg/mL，主要原因可能由于羥基紅花黃色素A屬于單查爾酮苷類化合物，是紅花中的主要水溶性成分[20]，水提取法有利于HSYA的溶出。

4.5 合理選擇中藥方劑中的定量指標(biāo)

血府逐瘀湯由11味藥組成，桃仁、紅花為君藥；赤芍、川芎、牛膝共為臣藥；生地、當(dāng)歸、桔梗、枳殼為佐藥；桔梗、甘草調(diào)和諸藥，為使藥。實(shí)驗(yàn)選用的8種活性成分中，苦杏仁苷來(lái)自桃仁，羥基紅花黃色素A來(lái)自紅花，甘草苷來(lái)自甘草，蘆丁來(lái)自紅花、甘草和柴胡，蕓香柚皮苷、新橙皮苷、柚皮苷均來(lái)自枳實(shí)，柴胡皂苷A來(lái)自柴胡和川芎，篩選的指標(biāo)符合“君、臣、佐、使”理論，有利于全面評(píng)價(jià)血府逐瘀湯的質(zhì)量。

本研究基于高質(zhì)量精度IT-TOF-MS方法同時(shí)對(duì)8個(gè)批次血府逐瘀湯中的8個(gè)成分(包括1個(gè)氰苷、6個(gè)黃酮苷和1個(gè)三萜皂苷化合物)進(jìn)行了定量研究，結(jié)果表明，各個(gè)不同批次成分含量除了新橙皮苷和柴胡皂苷A比較穩(wěn)定外，其它6種成分的含量有波動(dòng)，其中羥基紅花黃色素A波動(dòng)較大。該研究為血府逐瘀湯的質(zhì)量控制提供參考，為后續(xù)的應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。