甘肅各主產(chǎn)區(qū)當(dāng)歸UPLC多成分含量測(cè)定及評(píng)析

徐小瓊，陳 博，張小波，陳 娟，晉 玲,5*

1甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，蘭州 730000；2甘肅醫(yī)學(xué)院，平?jīng)?744000；3中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心 道地藥材國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，北京 100700；4蘭州大學(xué)藥學(xué)院；5甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中(藏)藥資源研究所，蘭州 73000

當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelicasinensis(Oliv.)Diels的干燥根，秋季采挖，除去須根和泥沙，捆成小把，晾干。當(dāng)歸味甘、辛，性溫，歸心、肝、脾經(jīng)，具有活血、調(diào)經(jīng)、止痛的功效[1,2]。甘肅自古為當(dāng)歸道地產(chǎn)區(qū)，年產(chǎn)量占全國(guó)當(dāng)歸總產(chǎn)量的80%以上，甘肅省作為全國(guó)當(dāng)歸藥材生產(chǎn)大省，80年代初至今，種植面積大幅增加，盲目引種栽培，導(dǎo)致當(dāng)歸產(chǎn)量供過于求，但藥材質(zhì)量參差不齊[3-7]。本課題組在甘肅省各縣區(qū)實(shí)地調(diào)查采樣，采樣點(diǎn)達(dá)22個(gè)，樣品均為栽培品，采用UPLC建立了當(dāng)歸指標(biāo)含量測(cè)定方法，結(jié)合主成分分析方法進(jìn)行分類分析，并測(cè)定其中8個(gè)指標(biāo)成分含量，以期為甘肅省當(dāng)歸質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與材料

Waters Acquity UPLC超高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)；CP114型電子分析天平(奧豪斯儀器(上海)有限公司)；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京市永光明醫(yī)療器械廠)；Option R7 utra AN超純水系統(tǒng)(英國(guó)Elga Lab Waters公司)；KQ 5200DV型數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；0.22 μm微孔濾膜(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)。

綠原酸(批號(hào)：L-007-181112)、阿魏酸(批號(hào)：A-002-181216)、洋川芎內(nèi)酯I(批號(hào)：Y-085-181011)、洋川芎內(nèi)酯H(批號(hào)：Y-084-190527)、洋川芎內(nèi)酯A(批號(hào)：Y-083-181011)、阿魏酸松柏酯(批號(hào)：A-001-181103)、藁本內(nèi)酯(批號(hào)：G-010-181230)、丁烯基苯酞(批號(hào)：D-057-190506)對(duì)照品(成都瑞芬思生物科技有限公司，純度均在98%以上)。甲醇色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。22批當(dāng)歸樣品均為本課題組自采，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)晉玲教授鑒定均為藥典正品。樣品陰干，打粉過3號(hào)篩(50目)備用，具體采樣信息見表1。

表1 當(dāng)歸藥材樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Waters ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相為甲醇(A)-1%乙酸水(B)，梯度洗脫(0～5 min，5%→30% A；5～6.5 min，30%→35% A；6.5～8.5 min，35%→50%A；8.5～14 min，50%→80%A；14～17 min，80% A；17～22 min，80%→100%A；22～27 min，100%→5%A)；流速0.3 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm；柱溫30 ℃；樣品溫度20 ℃，進(jìn)樣量3 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液制備

分別取綠原酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H、洋川芎內(nèi)酯A、阿魏酸松柏酯、藁本內(nèi)酯、丁烯基苯酞對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL分別含綠原酸0.061 0 mg、阿魏酸0.050 0 mg、洋川芎內(nèi)酯I 0.040 0 mg、洋川芎內(nèi)酯H 0.024 0 mg、洋川芎內(nèi)酯A 0.063 6 mg、阿魏酸松柏酯0.224 mg、藁本內(nèi)酯2.00 mg、丁烯基苯酞0.032 8 mg的各對(duì)照品儲(chǔ)備液。再精密吸取各對(duì)照品儲(chǔ)備液各1 mL，置10 mL棕色容量瓶中，以甲醇定容至刻度，作為混合對(duì)照品溶液，混標(biāo)色譜圖見圖1A。

2.2.2 供試品溶液制備

取樣品粉末約5.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入50%甲醇50 mL，稱定重量，超聲提取(60 kHz，250 W)45 min，放冷，稱重并用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，過濾，取續(xù)濾液，過0.22 μm微孔濾膜，即得，樣品色譜圖見圖1B。

2.2.3 線性范圍考察

分別精密吸取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液各1 mL，再逐級(jí)稀釋1、10、20、30、40倍，制成5個(gè)系列濃度的對(duì)照品溶液。分別精密吸取3 μL注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積，以峰面積(Y)對(duì)進(jìn)樣量(X)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表2。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn)

取1號(hào)樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得8個(gè)共有峰相對(duì)峰面積RSD分別為2.67%、1.91%、1.02%、0.96%、2.91%、1.72%，2.02%、1.32%，表明儀器精密度良好。

圖1 混合對(duì)照品(A)和當(dāng)歸樣品(B)UPLC圖

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取1號(hào)樣品6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得8個(gè)共有峰相對(duì)峰面積RSD分別為2.77%、2.58%、2.00%、1.96%、2.91%、2.42%、2.62%、2.02%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取1號(hào)樣品，按“2.2 2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、2、4、12、48 h按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定5次，測(cè)得8個(gè)共有峰相對(duì)峰面積RSD分別為2.81%、2.58%、2.31%、2.00%、2.88%、2.52%，2.69%、2.43%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.3.4 加樣回收率試驗(yàn)

取1號(hào)樣品6份，每份約5.0 g，精密稱定，分別精密加入綠原酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H、洋川芎內(nèi)酯A、阿魏酸松柏酯、藁本內(nèi)酯、丁烯基苯酞各對(duì)照品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，供試品溶液均稀釋50倍，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。計(jì)算加樣回收率及RSD%，結(jié)果見表3，均符合要求。

表3 加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表3(Continued Tab.3)

化合物Compound樣品中含量Originalamount(mg)加入量Addedamount(mg)測(cè)得量Detectedamount(mg)回收率Recovery(%)平均回收率Averagerecovery(%)RSD(%)洋川芎內(nèi)酯ISenkyunolideI0.02100.02100.04290.960393.303.000.02100.02100.04400.91430.02100.02100.04430.90260.02100.02100.04380.92240.02100.02100.04380.92240.02100.02100.04260.9736洋川芎內(nèi)酯HSenkyunolideH0.00430.00410.00841.000094.902.800.00410.00410.00860.92580.00410.00410.00850.95150.00420.00410.00860.93210.00420.00410.00860.93640.00410.00410.00850.9471洋川芎內(nèi)酯ASenkyunolideA0.00230.00240.00471.008598.602.700.00230.00240.00471.00510.00230.00240.00470.99500.00230.00240.00471.00300.00220.00240.00470.96000.00210.00240.00460.9440阿魏酸松柏酯Coniferylferulate0.02010.02620.04860.919692.702.700.02010.02620.04900.90690.01970.02620.04700.96010.01710.02620.04640.89450.01880.02620.04690.93270.01990.02620.04750.9496藁本內(nèi)酯Ligustilide0.80480.81391.62900.987598.002.300.78820.81391.63100.96570.79930.81391.64900.95790.80920.81391.60701.02020.80520.81391.63200.98440.80520.81391.64800.9657丁烯基苯酞Butenylphthalide0.01470.01800.03290.989698.002.300.01440.01800.03310.96460.01480.01800.03300.99170.01440.01800.03221.01350.01540.01800.03410.96360.01540.01800.03430.9534

2.4 含量測(cè)定

吸取“2.2.1”，“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液和22份樣品溶液各3 μL，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，用外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見表4。

表4 含量測(cè)定結(jié)果

圖2 不同產(chǎn)區(qū)樣品8種成分含量箱線圖

2.5 P值分析[8,9]

2.6 當(dāng)歸指標(biāo)成分主成分分析(PCA)[10]

用SPSS 19.0軟件對(duì)22份不同產(chǎn)區(qū)當(dāng)歸藥材中8個(gè)指標(biāo)成分含量的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，以主成分的特征值及貢獻(xiàn)率為依據(jù)，進(jìn)行主成分分析，計(jì)算相關(guān)系數(shù)矩陣，主成分特征值、累積貢獻(xiàn)率，并計(jì)算主成分綜合得分，對(duì)各產(chǎn)區(qū)當(dāng)歸藥材綜合質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。根據(jù)因子分析結(jié)果可得主成分特征值見表5，由表5可知，當(dāng)歸主成分分析中前2個(gè)主成分的特征值均大于1，第3個(gè)主成分特征值接近1，前3個(gè)主成分的連線較陡峭，累積方差貢獻(xiàn)率為75.358%，以因子的方差累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到70%以上作為主成分提取的標(biāo)準(zhǔn)，提取前3個(gè)主成分進(jìn)行分析較為合適，當(dāng)歸主成分矩陣見表6。

根據(jù)表5、6，以X1、X2、X3代表3個(gè)主成分，作為22份不同產(chǎn)區(qū)當(dāng)歸8個(gè)指標(biāo)成分所表達(dá)的信息，建立當(dāng)歸質(zhì)量的評(píng)價(jià)模型，得出如下線性關(guān)系表達(dá)式：

X1=0.209H1-0.016H2-0.165H3+0.26H4+0.136H5-0.143H6-0.247H7+0.281H8

X2=-0.109H1+0.458H2+0.401H3+0.244H4-0.073H5-0.25H6+0.078H7+0.094H8

X3=0.425H1+0.334H2-0.191H3+0.119H4-0.598H5+0.525H6+0.159H7+0.176H8

表達(dá)式中各變量不是原始變量，而是標(biāo)準(zhǔn)化變量，將上述表達(dá)式，與所對(duì)應(yīng)的3個(gè)主成分的方差貢獻(xiàn)率結(jié)合，得到當(dāng)歸質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)函數(shù)的表達(dá)式X綜合得分=(39.418X1+23.828X2+12.112X3)/75.358，根據(jù)以上表達(dá)式得到不同產(chǎn)區(qū)當(dāng)歸綜合得分及排序見表7。綜合得分越高，表明當(dāng)歸質(zhì)量越好。甘肅省各產(chǎn)區(qū)當(dāng)歸的綜合得分為：定西岷縣>定西漳縣>定西臨洮縣>定西渭源縣>隴南宕昌縣>隴南文縣>隴南禮縣>隴南武都縣>天水清水縣>天水武山縣>臨夏康樂縣>臨夏積石山縣>臨夏臨夏縣>武威古浪縣>甘南卓尼縣>甘南臨潭縣>甘南舟曲縣>甘南迭部縣>武威天柱縣>張掖肅南縣>張掖民樂縣>蘭州永登縣。

表5 主成分特征值

續(xù)表6(Continued Tab.6)

化合物Compound主成分1Component1主成分2Component2主成分3Component3洋川芎內(nèi)酯ASenkyunolideA0.136-0.073-0.598阿魏酸松柏酯Coniferylferulate-0.143-0.250.525藁本內(nèi)酯Ligustilide-0.2470.0780.159丁烯基苯酞Butenylphthalide0.2810.0940.176

表7 當(dāng)歸主成分得分及綜合得分排名

3 討論

揮發(fā)油是當(dāng)歸藥材的重要有效成分之一，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明藁本內(nèi)酯含量最高，除此之外還有丁烯基酞內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯、亞丁基苯酞以及當(dāng)歸酮等[11-12]，Song等[11]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸中的揮發(fā)油能穩(wěn)定心肌細(xì)胞膜，保護(hù)線粒體和溶酸體的正常功能，增強(qiáng)心肌細(xì)胞抗缺氧能力，從而減輕缺氧對(duì)心肌細(xì)胞的損傷程度。Chang等[12]研究發(fā)現(xiàn)阿魏酸能抑制膽固醇的合成，降低血脂，還具有一定的抗氧化和自由基清除作用，抑制脂質(zhì)在血管壁的沉積，從而保護(hù)血管內(nèi)膜不受損傷，阿魏酸、藁本內(nèi)酯、丁烯基酞酞能增強(qiáng)血漿纖維蛋白的溶解活性，促進(jìn)血漿纖維蛋白的溶解過程，延長(zhǎng)血栓形成時(shí)間，發(fā)揮明顯的抗血栓作用。故本研究選擇綠原酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H、洋川芎內(nèi)酯A、阿魏酸松柏酯、藁本內(nèi)酯、丁烯基苯酞作為當(dāng)歸藥材的指標(biāo)成分進(jìn)行研究。

當(dāng)歸為2015年版《中國(guó)藥典》收載品種，藥典以HPLC測(cè)定的阿魏酸含量作為當(dāng)歸藥材的考察指標(biāo)，專屬性不強(qiáng)，指標(biāo)成分單一。故本研究采用UPLC技術(shù)同時(shí)測(cè)定當(dāng)歸藥材中8個(gè)指標(biāo)成分含量，該方法簡(jiǎn)便、快捷，重復(fù)性好，可以更全面評(píng)價(jià)當(dāng)歸藥材質(zhì)量。在實(shí)驗(yàn)過程中通過全波長(zhǎng)掃描(200～500 nm)確定指標(biāo)成分在270 nm處均有最大吸收，在最大吸收波長(zhǎng)測(cè)定，提高了檢測(cè)的靈敏度。

主成分分析是一種多指標(biāo)的綜合評(píng)價(jià)方法，本研究以22份當(dāng)歸的8個(gè)指標(biāo)成分檢測(cè)結(jié)果為基礎(chǔ)，采用主成分分析得到了3個(gè)主成分因子，主成分分析結(jié)果中，定西岷縣當(dāng)歸藥材的綜合得分最高，且定西市、隴南市、天水市各產(chǎn)地當(dāng)歸藥材綜合得分排名靠前，蘭州市當(dāng)歸綜合得分最低。因此，定西市當(dāng)歸總體質(zhì)量?jī)?yōu)于甘肅省其它產(chǎn)區(qū)。

為進(jìn)一步了解不同產(chǎn)地當(dāng)歸藥材中指標(biāo)成分含量差異的來源，對(duì)當(dāng)歸樣品多指標(biāo)成分進(jìn)行定量分析，并結(jié)合1個(gè)易于計(jì)算和可見的參數(shù)P值進(jìn)行分析，得到綠原酸、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯在各個(gè)樣品中含量存在較大波動(dòng)，對(duì)當(dāng)歸藥材的質(zhì)量有較大影響。