16%二氰·吡唑酯水分散粒劑質(zhì)量檢測分析方法

劉德坤，吳夢琪，許柏林，陳英豪，夏柏玉，吳佳文

（1. 句容市后白鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務中心，江蘇句容 212444；2. 句容市后白鎮(zhèn)農(nóng)產(chǎn)品檢測監(jiān)督站 江蘇句容 212444；3. 江蘇省植物保護植物檢疫站，南京 210036）

吡唑醚菌酯（pyraclostrobin）是德國巴斯夫公司開發(fā)的一種新型甲氧基丙烯酸酯類廣譜殺菌劑，通過阻止細胞色素b和c1復合體的電子傳遞來抑制線粒體呼吸作用，導致病原菌衰亡。二氰蒽醌（dithianon）是德國默克公司開發(fā)的保護性殺菌劑，主要通過抑制孢子萌發(fā)達到保護效果，可防治多種真菌性病害。兩者復配使用保護性更好，持效期更長，藥效顯著。田間藥效試驗結(jié)果表明16%二氰·吡唑酯水分散粒劑對蘋果、香蕉、柑橘等多種作物的炭疽病防效較好[1-3]。但有關(guān)16%二氰·吡唑酯水分散粒劑的質(zhì)量檢測分析方法，目前尚未見公開報道。本文采用高效液相色譜法（HPLC），在同一液相色譜條件下，一次進樣同時定量分析制劑中兩種有效成分含量，并對懸浮率和熱貯穩(wěn)定性等多種質(zhì)量指標的測定方法進行探索，為企業(yè)生產(chǎn)16%二氰·吡唑酯水分散粒劑過程中的質(zhì)量控制和質(zhì)檢機構(gòu)的質(zhì)量檢測提供參考。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

甲醇、乙腈，色譜純；水，二次蒸餾水；磷酸，分析純；二氰蒽醌原藥（98%），河北興柏農(nóng)業(yè)科技有限公司；吡唑醚菌酯原藥（98%），德國巴斯夫公司；16%二氰·吡唑酯水分散粒劑，實驗室自制；Acme9000高效液相色譜（具可變波長紫外檢測器），韓國英麟機器有限公司；UV-1800紫外可見分光光度計，島津公司。

1.2 有效成分含量檢測方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Amethyst C18-H（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測器：紫外檢測器；流動相：乙腈＋0.02%磷酸水溶液（體積比80∶20）；檢測波長：300 nm；柱溫：23～27℃；流速：0.8 mL/min；進樣量：10 μL。保留時間：二氰蒽醌約5.3 min；吡唑醚菌酯約7.4 min。

1.2.2 溶液的配制

標樣：分別準確稱取約0.102 g二氰蒽醌標樣和吡唑醚菌酯標樣（精確至0.000 2 g），置于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，搖勻，可分別得到1.0g/L的二氰蒽醌、吡唑醚菌酯標準溶液。吸取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL上述溶液加入到10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，充分搖勻，分別得到0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g/L的二氰蒽醌、吡唑醚菌酯標準溶液。用0.22 μm濾膜過濾，備用。

試樣：準確稱量0.300 0 g 16%二氰·吡唑酯水分散粒劑（精確至0.000 2 g），放入50 mL容量瓶中，添加少許乙腈超聲振蕩5 min，使其溶解完全，冷卻至室溫后，乙腈定容至刻度，搖勻。量取10 mL上述溶液，置于25 mL容量瓶中，乙腈定容，搖勻后，過0.22 μm濾膜備用。

1.2.3 有效成分含量的測定

在上述色譜條件下，待儀器基線穩(wěn)定后，連續(xù)注入數(shù)針標樣溶液，直至相鄰2針中二氰蒽醌（吡唑醚菌酯）峰面積相對變化不大于1.0%，按照標樣、試樣、試樣、標樣順序進行測定。

將測得的試樣溶液和標樣溶液中二氰蒽醌和吡唑醚菌酯的峰面積分別平均后，按式（1）計算有效成分的質(zhì)量分數(shù)w。

式中：A1、A2為標樣、試樣溶液中二氰蒽醌（吡唑醚菌酯）峰面積的平均值；m1為試樣的質(zhì)量，g；m2為二氰蒽醌（吡唑醚菌酯）標樣的質(zhì)量，g；P為二氰蒽醌（吡唑醚菌酯）標樣中的質(zhì)量分數(shù)，%。

1.3 懸浮率的檢測方法

1.3.1 樣品懸浮率的檢測方法

參考GB/T 14825—2006《農(nóng)藥懸浮率測定方法》，準確稱取1.0 g試樣（精確至0.000 2 g），倒入含有100 mL標準硬水（30±2℃）的250 mL具塞量筒中，加入標準硬水定容至250 mL，擰緊塞子，在1 min內(nèi)上下顛倒30次。打開塞子，恒溫水浴30 min后，輕輕取出量筒，在10～15 s內(nèi)，利用虹吸原理移出225 mL的懸浮液，將量筒底部25 mL懸浮液移至培養(yǎng)皿，干燥至衡重，用50 mL乙腈分多次沖洗后定容，用1.2.3中方法測定殘余物有效成分含量。按式（2）計算懸浮率。

式中：M1為配制懸浮液所取樣品中有效成分質(zhì)量，g；M2為量筒底部25 mL懸浮液中有效成分的質(zhì)量，g；S為懸浮率，%。

1.3.2 懸浮率檢測方法的準確度和精密度

稱取0.4 g 16%二氰·吡唑酯水分散粒劑樣品（精確至0.000 2 g）至燒杯中，加入25 mL標準硬水，用玻璃棒攪拌均勻，（30±1）℃水浴中靜置4 min，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿，干燥至衡重，用100 mL乙腈分多次沖洗后定容，用1.2.3中方法測定殘余物及樣品中有效成分含量，計算回收率；據(jù)1.3.1中方法連續(xù)測定16%二氰·吡唑酯水分散粒劑樣品懸浮率，計算方法的相對標準偏差。

1.4 熱貯穩(wěn)定性的檢測方法

取16%二氰·吡唑酯水分散粒劑樣品10 g，密封于鋁箔袋中，在52～56℃的恒溫烘箱中貯存14 d后，取出樣品，冷卻至室溫后測定其有效成分含量及懸浮率。有效成分分解率不大于5%，樣品懸浮率不小于80%，視為熱貯合格。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 檢測波長的選擇

在250～350 nm波長范圍內(nèi)進行紫外掃描，得相應的吸收波長與響應值的紫外吸收光譜圖。結(jié)果顯示，300 nm作為檢測波長時，二氰蒽醌有最大吸收峰，吡唑醚菌酯也有較強吸收峰，且兩峰大小比例適當，雜質(zhì)響應值小，流動相無吸收，最終確定檢測波長為300 nm。

2.1.2 流動相的選擇

為確保二氰蒽醌和吡唑醚菌酯與雜質(zhì)完全分離，參考不同文獻[4-6]先后選用不同比例的甲醇-乙腈-水，甲醇-水，以及乙腈-水作為流動相對試樣進行分離檢測，結(jié)果表明當流動相為乙腈-水（體積比80∶20），含0.02%磷酸時，各組分均得到理想的分離，且峰形對稱，出峰時間短，基線平穩(wěn)。

2.2 有效成分含量的檢測結(jié)果

2.2.1 分析方法的線性關(guān)系

取1.2.2中配置的二氰蒽醌（吡唑醚菌酯）標樣溶液，按上述色譜操作條件，測定相應響應值，并以質(zhì)量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得到二氰蒽醌標準溶液質(zhì)量濃度與峰面積的線性回歸方程為y二氰蒽醌=14 881x＋9.663 6，其線性相關(guān)系數(shù)為R二氰蒽醌=0.999 9；吡唑醚菌酯標準溶液質(zhì)量濃度與峰面積的線性回歸方程為y吡唑醚菌酯=22 598x＋34.636，其線性相關(guān)系數(shù)為R吡唑醚菌酯=0.999 7，該結(jié)果表明二氰蒽醌和吡唑醚菌酯在0.05～0.6 g/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.2 分析方法的精密度

在上述色譜操作條件下，對同一16%二氰·吡唑酯水分散粒劑有效成分含量平行測定5次。二氰蒽醌、吡唑醚菌酯的標準偏差分別為0.095和0.085，變異系數(shù)分別為0.77%和2.00%。測定結(jié)果見表1。

表1 有效成分分析方法的精確度測定

2.2.3 分析方法的準確度

為了驗證16%二氰·吡唑酯水分散粒劑有效成分含量分析方法的準確性，制備了不含原藥的空白水分散粒劑樣品。稱取100 mg空白水分散粒劑樣品15份，分為3組，分別向每組5份樣品中加入已知質(zhì)量分數(shù)的二氰蒽醌和吡唑醚菌酯，按照1.3.2的樣品溶液配制方法處理后進行分析，測定添加回收率。由表2可知，二氰蒽醌添加回收率在99.27%～100.88%，平均回收率為100.05%；吡唑醚菌酯添加回收率為98.83%～101.66%，平均回收率為99.90%。該方法準確度較高，可準確定量。

表2 有效成分分析方法的準確度測定

2.2.4 樣品有效成分含量的測定

在上述選定的HPLC分析條件下，對樣品中二氰蒽醌和吡唑醚菌酯有效成分含量進行測定，圖1表明，兩種有效成分與雜質(zhì)峰分離完全，無相互干擾。經(jīng)測定二氰蒽醌、吡唑醚菌酯保留時間分別為5.282 min、7.332 min。對16%二氰·吡唑酯水分散粒劑樣品中有效成分含量進行計算，得出二氰蒽醌含量為12.24%，吡唑醚菌酯含量為4.13%。

圖1 16%二氰·吡唑酯水分散粒劑HPLC 譜圖

2.3 懸浮率測定方法的分析

懸浮率決定了水分散粒劑制劑在水中崩解、分散后能否形成穩(wěn)定、均一的懸浮體系，是水分散粒劑中有效成分發(fā)揮藥效的重要保障[7-8]。表3、4的結(jié)果表明：按照懸浮率測定方法，二氰蒽醌回收率為99.27%～100.65%，標準偏差為0.776，變異系數(shù)為0.807%；吡唑醚菌酯回收率為98.08%～101.18%，標準偏差為0.536，變異系數(shù)為0.578%。按照1.3.1中方法對16%二氰·吡唑酯水分散粒劑樣品進行測定，二氰蒽醌的懸浮率為96.36%，吡唑醚菌酯懸浮率為93.04%。制劑懸浮率符合水分散粒劑標準。

表3 懸浮率分析方法準確度測定

表4 懸浮率分析方法的精密度測定

2.4 熱貯穩(wěn)定性測定結(jié)果

熱貯穩(wěn)定性是水分散粒劑的一個重要指標，也是產(chǎn)品能否長期穩(wěn)定保存的重要指標[6-7]。16%二氰·吡唑酯水分散粒劑熱貯穩(wěn)定性測定結(jié)果見表5。

表5 16%二氰·吡唑酯水分散粒劑熱貯穩(wěn)定性測定

從表5中可以看出：16%二氰·吡唑酯水分散粒劑中兩種有效成分化學穩(wěn)定性較好，在52～56℃熱貯14 d后，二氰蒽醌的平均分解率僅為0.31%，吡唑醚菌酯的平均分解率僅為1.59%。熱貯前后，樣品的懸浮率均大于等于90%，符合相關(guān)指標，說明該配方中助劑配伍合理，制劑性能穩(wěn)定。

3 結(jié) 論

本試驗采用高效液相色譜法檢測16%二氰·吡唑酯水分散粒劑有效成分，并測定制劑懸浮率、熱貯穩(wěn)定性等主要指標。同時定量分析二氰蒽醌、吡唑醚菌酯2種有效成分，簡便、快速，分離充分，條件穩(wěn)定，是一種較為理想的液相色譜分析條件；懸浮率測定方法的研究表明，此方法準確度高，重現(xiàn)性好，是一種簡便可行、較為理想的分析方法。測定分析結(jié)果表明，16%二氰·吡唑酯水分散粒劑樣品懸浮率高、有效成分含量達標、熱貯穩(wěn)定性好，均能達到國家標準，適用于此制劑質(zhì)量控制的檢測。