蝗蟲微孢子蟲（Nosema locustae）對(duì)環(huán)境非靶標(biāo)有益生物的毒性效應(yīng)

袁善奎，蔣金花，張 龍，吳聲敢，柳新菊，安雪花，李 崗

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥檢定所，北京 100125；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，杭州 310021；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京 100193）

隨著化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境污染問題的日益凸顯，微生物農(nóng)藥以其選擇性強(qiáng)、來源廣泛、對(duì)人畜低毒、不易產(chǎn)生抗性、能兼顧生態(tài)平衡等優(yōu)勢(shì)受到了越來越多的關(guān)注。微生物農(nóng)藥主要是指用于防治危害農(nóng)作物的病、蟲、草、鼠害及促進(jìn)作物生長(zhǎng)的活體微生物[1]，主要包括細(xì)菌、真菌、病毒、線蟲及原生動(dòng)物等[2-3]。其中可利用的原生動(dòng)物類微生物農(nóng)藥主要為微孢子蟲，約有200種，常用的有蝗蟲微孢子蟲、玉米螟微孢子蟲和樅色卷葉蛾微孢子蟲等。此類農(nóng)藥在防治棉鈴蟲、蝗蟲、松毛蟲上均有應(yīng)用?；认x微孢子蟲（Nosema locustae）是蝗蟲等直翅目昆蟲的專性寄生的單細(xì)胞真核原生動(dòng)物，由Canning[4]于1953年從非洲飛蝗體內(nèi)分離鑒定并命名，并在長(zhǎng)期的劑型研究與蟲害防控中，其應(yīng)用技術(shù)逐漸得以成熟發(fā)展，在控制草地蝗蟲方面取得了良好的效果[5-9]。

由于微生物農(nóng)藥在應(yīng)用中可能通過直接在水體表面施用或土壤徑流、感染微生物的昆蟲的遷移等途徑進(jìn)入環(huán)境，不可避免地會(huì)與環(huán)境非靶標(biāo)有益生物暴露接觸。為更好地評(píng)估蝗蟲微孢子蟲的環(huán)境暴露風(fēng)險(xiǎn)，本研究按照NY/T 3152—2017《微生物農(nóng)藥環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》[10-14]要求，選取了5種典型的環(huán)境生物日本鵪鶉、意大利蜜蜂、家蠶、大型溞和斑馬魚為試驗(yàn)對(duì)象，以探究蝗蟲微孢子蟲對(duì)典型環(huán)境生物的毒性效應(yīng)和安全風(fēng)險(xiǎn)，為該產(chǎn)品的安全應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試生物

鳥類毒性試驗(yàn)：日本鵪鶉（Coturnix japonica），日本鵪鶉種蛋購自山東省日照市東港區(qū)老孟孵化場(chǎng)，于本單位實(shí)驗(yàn)室孵化后用于試驗(yàn)。

蜜蜂毒性試驗(yàn)：意大利蜜蜂（Apis mellifera），購自浙江省義烏市佛堂鎮(zhèn)王煥興蜂廠，在本單位空地上馴養(yǎng)后用于試驗(yàn)。

家蠶毒性試驗(yàn)：家蠶（Bombyx mori），品種為“皓月×菁松”，蠶種由浙江省蠶種質(zhì)量檢驗(yàn)檢疫站提供，催青孵化至二齡起蠶后用于試驗(yàn)。

溞類毒性試驗(yàn)：大型溞（Daphnia magna），其親溞由沈陽化工研究院有限公司安全評(píng)價(jià)中心提供，于本單位實(shí)驗(yàn)室繁殖后用于試驗(yàn)。

魚類毒性試驗(yàn)：斑馬魚（Brachydanio rerio），AB型品系，種魚購自武漢中科院水生生物研究所的國(guó)家斑馬魚資源中心，于本單位實(shí)驗(yàn)室繁殖后用于試驗(yàn)。

1.1.2 供試微生物農(nóng)藥

供試微生物農(nóng)藥為0.2億孢子/mL蝗蟲微孢子蟲懸浮劑，由南通德益化工有限公司生產(chǎn)并提供。

1.2 試驗(yàn)條件

各環(huán)境生物毒性試驗(yàn)條件如表1所示。

表1 不同非靶標(biāo)生物的試驗(yàn)條件

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 鳥類毒性試驗(yàn)

根據(jù)中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 3152.1—2017《微生物農(nóng)藥環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則第1部分：鳥類毒性試驗(yàn)》[10]，試驗(yàn)按照最大危害暴露量要求設(shè)置1.0×108孢子/kg體重共1個(gè)試驗(yàn)劑量（被試物直接經(jīng)口暴露，即被試物所能配制的最大劑量），同時(shí)設(shè)置滅活對(duì)照組和空白對(duì)照組。

試驗(yàn)時(shí)，按照每100 g體重日本鵪鶉灌喂0.5 mL試驗(yàn)溶液進(jìn)行，連續(xù)經(jīng)口暴露5 d。每組用日本鵪鶉雌雄各10只，飼養(yǎng)空間不小于300 cm2/鳥，2 h中毒癥狀調(diào)查后按常規(guī)方法喂食。處理組、滅活對(duì)照組和空白對(duì)照組同時(shí)進(jìn)行。處理后，每天觀察并記錄受試日本鵪鶉中毒與死亡癥狀，同時(shí)記錄死亡數(shù)，死亡數(shù)累計(jì)計(jì)算。

1.3.2 蜜蜂毒性試驗(yàn)

根據(jù)中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 3152.2—2017《微生物農(nóng)藥環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則第2部分：蜜蜂毒性試驗(yàn)》[11]進(jìn)行最大危害暴露量試驗(yàn)（被試物所能配制的最大劑量），同時(shí)設(shè)置滅活對(duì)照組和空白對(duì)照組。

蜜蜂接觸毒性試驗(yàn)：取0.2億孢子/mL蝗蟲微孢子蟲懸浮劑10 mL，與100 μL杰效利混勻作為接觸試驗(yàn)的處理溶液（被試物所能配制的最大劑量）。采用“點(diǎn)滴法”進(jìn)行暴露。點(diǎn)滴前，先用CO2麻醉試驗(yàn)蜜蜂，然后用手動(dòng)微量點(diǎn)滴儀對(duì)準(zhǔn)蜜蜂中胸背板處點(diǎn)滴處理藥液或滅活對(duì)照藥液1 μL/蜂，待藥液揮發(fā)后將蜜蜂移入蜂籠中，用脫脂棉浸泡適量50%蔗糖水（W/W），通過網(wǎng)眼供蜜蜂攝食?？瞻讓?duì)照組直接飼喂50%蔗糖水，處理組和對(duì)照組均設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20只蜜蜂。處理后，每天觀察并記錄供試蜜蜂的中毒癥狀和死亡數(shù)。

蜜蜂經(jīng)口試驗(yàn)：取0.2億孢子/mL蝗蟲微孢子蟲懸浮劑2.0 g與2.0 g蔗糖混勻，作為經(jīng)口試驗(yàn)的處理溶液（被試物所能配制的最大劑量）。在飼喂器（一次性塑料滴管）中加入400 μL處理藥液或滅活對(duì)照藥液，對(duì)蜜蜂進(jìn)行飼喂。暴露4 h后，測(cè)定每組試驗(yàn)溶液的消耗量，并將飼喂器取出，換用不含被試物的50%蔗糖水進(jìn)行飼喂。處理組和對(duì)照組均設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20只蜜蜂。處理后，每天觀察并記錄供試蜜蜂的中毒癥狀和死亡數(shù)。

1.3.3 家蠶毒性試驗(yàn)

根據(jù)中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 3152.3—2017《微生物農(nóng)藥環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則第3部分：家蠶毒性試驗(yàn)》[12]進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)按照最大危害暴露量要求設(shè)置0.2億孢子/mL共1個(gè)試驗(yàn)劑量（被試物直接浸漬桑葉，即被試物所能配制的最大劑量），同時(shí)設(shè)置滅活對(duì)照組和空白對(duì)照組。

試驗(yàn)時(shí)，將2 cm×2 cm左右的桑葉約5.0 g放入保鮮袋中，加入濃度為0.2億孢子/mL的試驗(yàn)藥液5.0 mL，桑葉充分浸潤(rùn)藥液后取出自然晾干后，分成4等份轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中。將二齡起蠶挑入培養(yǎng)皿中，每皿20頭，并蓋上蓋子，于植物培養(yǎng)箱內(nèi)飼養(yǎng)，各處理設(shè)4個(gè)重復(fù)，每一培養(yǎng)皿為一重復(fù)。試驗(yàn)組和對(duì)照組同時(shí)進(jìn)行。喂食染毒桑葉24 h后，轉(zhuǎn)入干凈的培養(yǎng)盒內(nèi)每天用不含被試物的桑葉正常飼喂。給藥后，每天觀察并記錄家蠶的中毒癥狀和死亡情況。上簇第8天采繭調(diào)查幼蟲死亡數(shù)、死籠數(shù)、結(jié)繭數(shù)、全繭量和繭層量等。計(jì)算家蠶幼蟲死亡率、結(jié)繭率、繭層率及化蛹率。

1.3.4 溞類毒性試驗(yàn)

根據(jù)中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 3152.5—2017《微生物農(nóng)藥環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則第5部分：溞類毒性試驗(yàn)》[13]進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)按照最大危害暴露量要求設(shè)計(jì)1.0×106孢子/mL共1個(gè)試驗(yàn)濃度，同時(shí)設(shè)置滅活對(duì)照組和空白對(duì)照組。

試驗(yàn)時(shí)，將50 mL試驗(yàn)溶液加入到結(jié)晶皿（直徑60 mm）中，然后用滴管加入試驗(yàn)用溞，每皿5只，蓋上結(jié)晶皿蓋后放入光照培養(yǎng)箱。處理組和對(duì)照組均設(shè)4個(gè)平行，每皿為1個(gè)平行。試驗(yàn)組和對(duì)照組同時(shí)進(jìn)行。試驗(yàn)期間，每天喂新鮮濃縮的羊角月芽藻藻液，每隔3 d更換試驗(yàn)溶液。試驗(yàn)持續(xù)21 d，每天觀察并記錄大型溞受抑制數(shù)和中毒癥狀。

1.3.5 魚類毒性試驗(yàn)

根據(jù)中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 3152.4—2017《微生物農(nóng)藥環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則第4部分：魚類毒性試驗(yàn)》[14]進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)按照最大危害暴露量要求設(shè)計(jì)1.0×106孢子/mL共1個(gè)試驗(yàn)濃度，同時(shí)設(shè)置滅活對(duì)照組和空白對(duì)照組。

試驗(yàn)時(shí)，將斑馬魚加入到濃度為1.0×106孢子/mL蝗蟲微孢子蟲的試驗(yàn)溶液中，每燒杯10尾魚，各處理設(shè)4個(gè)重復(fù)，每杯為1重復(fù)。試驗(yàn)組和對(duì)照組同時(shí)進(jìn)行。試驗(yàn)期間，每天飼喂2次豐年蝦，每隔3 d更換試驗(yàn)溶液。試驗(yàn)持續(xù)30 d，每天觀察并記錄斑馬魚的飼料食用情況、中毒癥狀和死亡情況。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用DPS軟件對(duì)試驗(yàn)溶液處理組、滅活對(duì)照組和空白對(duì)照組進(jìn)行差異顯著性分析，并以此評(píng)估最大危害暴露量下0.2億孢子/mL蝗蟲微孢子蟲懸浮劑對(duì)不同生物的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 鳥類毒性試驗(yàn)

試驗(yàn)期間，0.2億孢子/mL蝗蟲微孢子蟲懸浮劑處理組、滅活對(duì)照組和空白對(duì)照組的日本鵪鶉均未出現(xiàn)死亡，且各處理日本鵪鶉均表現(xiàn)正常。表明0.2億孢子/mL蝗蟲微孢子蟲懸浮劑在最大危害暴露量下對(duì)日本鵪鶉無致死毒性。

2.2 蜜蜂毒性試驗(yàn)

蜜蜂接觸試驗(yàn)中空白對(duì)照組和滅活對(duì)照組的蜜蜂平均死亡率分別為1.67%和0，蜜蜂經(jīng)口試驗(yàn)中空白對(duì)照組和滅活對(duì)照組的蜜蜂平均死亡率均為1.67%（表2和表3），符合NY/T 3152.2—2017《微生物農(nóng)藥環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則第2部分：蜜蜂毒性試驗(yàn)》中的質(zhì)量控制要求，即空白對(duì)照組受試蜜蜂死亡率不得超過20%，表明本試驗(yàn)有效。

蜜蜂接觸試驗(yàn)中，空白對(duì)照組、滅活對(duì)照組和被試物處理組蜜蜂的平均存活率分別為98.3%、100%和100%。在蜜蜂經(jīng)口試驗(yàn)中，空白對(duì)照組、滅活對(duì)照組和被試物處理組蜜蜂的平均存活率分別為98.3%、98.3%和91.7%。t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，蜜蜂接觸試驗(yàn)中t=-1，P＞0.05。蜜蜂經(jīng)口試驗(yàn)中t=-2.16，P＞0.05（表2和表3），表明蜜蜂接觸試驗(yàn)和經(jīng)口試驗(yàn)的被試物處理組與其對(duì)應(yīng)的對(duì)照組之間無顯著性差異。因此，0.2億孢子/mL蝗蟲微孢子蟲懸浮劑在最大危害暴露量下對(duì)蜜蜂無致死毒性。

2.3 家蠶毒性試驗(yàn)

經(jīng)0.2億孢子/mL蝗蟲微孢子蟲懸浮劑處理后，各處理對(duì)家蠶的影響如下：

對(duì)家蠶幼蟲的影響：處理組、滅活對(duì)照組和空白對(duì)照組的家蠶幼蟲均表現(xiàn)正常，且均未出現(xiàn)死亡，即受試家蠶的死亡率均為0，表明0.2億孢子/mL蝗蟲微孢子蟲懸浮劑在最大危害暴露量下對(duì)家蠶無致死毒性。

表2 0.2億孢子/mL蝗蟲微孢子蟲懸浮劑對(duì)蜜蜂接觸毒性試驗(yàn)結(jié)果

表3 0.2億孢子/mL蝗蟲微孢子蟲懸浮劑對(duì)蜜蜂經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)家蠶化蛹率的影響：空白對(duì)照組、滅活對(duì)照組和處理組的家蠶化蛹率分別為97.5%、96.2%和93.8%。差異顯著性分析表明，處理組家蠶化蛹率與空白對(duì)照組、滅活對(duì)照組之間均無顯著性差異（表4）。

對(duì)家蠶產(chǎn)繭量的影響：空白對(duì)照組、滅活對(duì)照組和處理組的家蠶全繭量平均值分別為1.836 9 g、1.846 6 g和1.878 8 g；繭層量平均值分別為0.380 3 g、0.374 3 g和0.379 7 g；繭層率平均值分別為20.85%、20.44%和20.41%。差異顯著性分析表明，處理組家蠶全繭量、繭層量和繭層率與空白對(duì)照組、滅活對(duì)照組之間相比均無顯著性差異（見表5）。

表4 0.2億孢子/mL蝗蟲微孢子蟲懸浮劑對(duì)家蠶生長(zhǎng)發(fā)育、結(jié)繭率及化蛹率的影響

表5 0.2億孢子/毫升蝗蟲微孢子蟲懸浮劑對(duì)家蠶產(chǎn)繭量的影響

2.4 溞類毒性試驗(yàn)

試驗(yàn)期間，0.2億孢子/mL蝗蟲微孢子蟲懸浮劑處理組、滅活對(duì)照組和空白對(duì)照組的大型溞均未出現(xiàn)中毒癥狀。處理組、滅活對(duì)照組和空白對(duì)照組的大型溞活動(dòng)抑制率均為0，表明0.2億孢子/mL蝗蟲微孢子蟲懸浮劑在最大危害暴露量下對(duì)大型溞無致死毒性。

2.5 魚類毒性試驗(yàn)

試驗(yàn)期間，0.2億孢子/mL蝗蟲微孢子蟲懸浮劑處理組、滅活對(duì)照組和空白對(duì)照組斑馬魚的死亡率均為0，并且斑馬魚取食正常，無中毒癥狀，表明0.2億孢子/mL蝗蟲微孢子蟲懸浮劑在最大危害暴露量下對(duì)斑馬魚無致死毒性。

3 結(jié)論與討論

本研究選取了5種典型的環(huán)境生物鳥、蜜蜂、家蠶、溞、魚，通過最大危害劑量試驗(yàn)探究了0.2億孢子/mL蝗蟲微孢子蟲懸浮劑對(duì)環(huán)境生物的毒性和安全風(fēng)險(xiǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，0.2億孢子/mL蝗蟲微孢子蟲懸浮劑在最大危害暴露量條件下對(duì)鳥、蜜蜂、家蠶、溞、魚均無致死毒性，并且對(duì)家蠶結(jié)繭數(shù)、化蛹率、全繭量、繭層量、繭層率等指標(biāo)均無顯著性差異影響，表明0.2億孢子/mL蝗蟲微孢子蟲懸浮劑對(duì)供試環(huán)境有益生物安全。

蝗蟲微孢子蟲主要通過感染寄主脂肪細(xì)胞，釋放出孢原質(zhì)裂殖增殖，產(chǎn)生新一代孢子，嚴(yán)重受感染的脂肪體可完全被孢子取代。寄主由于喪失脂肪體，以致取食和活動(dòng)減少，發(fā)育延滯，蛻皮困難，產(chǎn)卵減少，最后死亡?；认x微孢子蟲作為疾病可以通過健蟲與病蟲的相互殘食、取食孢子污染的食物等自然水平傳播方式，也可通過母帶直接將該病傳播給子代的垂直傳播方式，在蝗蟲種群中傳播、流行[14-15]。故研究蝗蟲微孢子蟲對(duì)環(huán)境生物脂肪體的影響，有利于更好地探究蝗蟲微孢子蟲對(duì)環(huán)境生物的毒性及其致毒機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，微生物農(nóng)藥在環(huán)境和有機(jī)體內(nèi)存在一個(gè)增值的過程，除了對(duì)生物體的致死毒性，更多表現(xiàn)在致病性和對(duì)后代的影響。因此，進(jìn)一步深入開展蝗蟲微孢子蟲等微生物農(nóng)藥在環(huán)境生物親代和子代中的繁殖毒性，比如鳥類繁殖毒性、蜜蜂幼蟲毒性、大型溞和魚類繁殖毒性等有利于更好地評(píng)估微生物農(nóng)藥的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。

目前，我國(guó)已發(fā)布實(shí)施了微生物農(nóng)藥對(duì)魚類、鳥類、蜜蜂、家蠶、藻類、溞類等6項(xiàng)毒性試驗(yàn)的農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，以及微生物農(nóng)藥環(huán)境增殖試驗(yàn)準(zhǔn)則3項(xiàng)（水、土壤、葉面），尚缺乏微生物農(nóng)藥環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估程序類的標(biāo)準(zhǔn)[16]。由于微生物農(nóng)藥是活的生物體，通常采用發(fā)酵或培養(yǎng)的技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)，因此給產(chǎn)品質(zhì)量控制帶來困難，不同批次的產(chǎn)品質(zhì)量差異較大，并且微生物菌種經(jīng)過長(zhǎng)期培養(yǎng)后還存在退化和變異的問題。因此，應(yīng)對(duì)微生物農(nóng)藥進(jìn)行深一步的環(huán)境毒理學(xué)研究，關(guān)注長(zhǎng)期生產(chǎn)鏈和應(yīng)用鏈，以及完善后期風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估程序，推進(jìn)微生物農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。