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    Zebularine和Scriptaid對綿羊卵丘細胞重編程的影響

    2020-07-08 06:50:00劉夢蝶李志斌房曉歡聶雨欣石霖靜李俊杰
    黑龍江動物繁殖 2020年5期
    關鍵詞:卵丘體細胞乙?;?/a>

    劉夢蝶,李志斌,房曉歡,王 卓,聶雨欣,石霖靜,李俊杰,2*

    (1.河北農業(yè)大學 動物科技學院,河北 保定 071000;2.河北省牛羊胚胎技術創(chuàng)新中心,河北 保定 071000)

    體細胞核移植(SCNT)技術在加快品種改良、縮短家畜繁殖周期等方面有重要應用,但克隆效率低下,制約著該技術的發(fā)展,其中供體細胞不完全重編程是影響SCNT效率的關鍵因素[1]。DNA甲基化和組蛋白乙?;莾煞N重要的表觀遺傳修飾方式。研究表明,DNA甲基化水平偏高或組蛋白乙?;狡褪荢CNT胚胎發(fā)育能力低的重要原因[2-3]。Zebularine是DNA甲基轉移酶抑制劑,添加Zebularine可顯著提高豬[4]、水牛[5]SCNT囊胚發(fā)育率;Scriptaid是組蛋白去乙?;敢种苿幚碡i[6]和牛[7]SCNT重構胚,會使胚胎體外發(fā)育能力顯著提高。河北農業(yè)大學動物科技學院繁殖實驗室曾利用Zebularine和Scriptaid處理綿羊SCNT胚胎,均顯著提高了早期胚胎體外發(fā)育能力[8-10]。SCNT胚胎表觀遺傳修飾異常的根源與供體細胞的分化存在密切聯(lián)系,供體體細胞核移入去核卵母細胞后需經過表觀遺傳重編程過程,回到胚胎起始發(fā)育的全能狀態(tài)。為此,Zebularine和Scriptaid處理供體細胞后對SCNT胚胎發(fā)育的影響受到廣泛關注,Xiong X.等[11]利用Zebularine和Scriptaid處理牛成纖維細胞,增加了牛SCNT胚胎的體外發(fā)育潛力和質量。但用Zebularine和Scriptaid等表觀遺傳修飾試劑處理供體細胞后,對細胞增殖、發(fā)育潛能等的影響未見報道,為此,本試驗采用Zebularine和Scriptaid處理綿羊卵丘細胞,研究對細胞增殖、多潛能基因、轉化生長因子及甲基轉移酶等表達的影響,探討表觀遺傳修飾試劑提高綿羊SCNT胚胎發(fā)育能力的機制,現(xiàn)報道如下。

    1 材料與方法

    1.1 卵母細胞的采集和培養(yǎng)

    綿羊卵巢,采集于河北省保定市唐縣某屠宰場。綿羊屠宰后挑選新鮮的卵巢,于3 h內送回實驗室,將卵巢上直徑3~6 mm的卵泡切開,在預熱至37℃的培養(yǎng)液中濾出卵丘、卵母細胞復合物(COCs),在體式顯微鏡下選擇具有3層及以上卵丘細胞包被且胞漿均勻的COCs用于試驗。將獲得的復合物放置于成熟培養(yǎng)液中,在38.6℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中進行體外成熟。

    1.2 卵丘細胞的選取和培養(yǎng)

    將成熟后的COCs置于透明質酸酶中,用槍頭反復吹打使卵丘和卵母細胞分離,收集卵丘細胞并加入卵丘培養(yǎng)液,在38.6℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),當卵丘細胞生長匯合至80%~90%時開始傳代。本試驗使用的是第三代卵丘細胞。

    1.3 卵丘細胞的處理與分組

    根據(jù)前期試驗結果,Zebularine(Z4775 Sigma)和Scriptaid(S7817 Sigma)的最佳處理濃度和時間分別為5 nmol/L、12 h[8]和0.2μmol/L、12 h[9]。因此,本試驗設置3個試驗組,5 nmol/L Zebularine(Z組)和0.2μmol/L Scriptaid單獨處理(S組)及聯(lián)合處理(SZ組)卵丘細胞12 h,及1個不進行藥物處理的對照組。

    1.4 MTT法檢測細胞增殖情況

    將制成細胞懸液的卵丘細胞按每孔8 000個接種于96孔細胞培養(yǎng)板中,每孔終體積為200μL。每組設6個重復孔,于38.6℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后棄去上清液,每孔加入90μL培養(yǎng)基(康寧)和10μL碧云天(MTT)溶液,38.6℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸去培養(yǎng)基,每孔加入110μL Formazan放于水平搖床上低速振蕩10 min(另設6個調零孔和6個對照孔)。用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm處測量各孔吸光度,根據(jù)吸光度計算細胞增殖率。吸光度值越大細胞增殖率越高[12]。

    1.5 RNA的提取、反轉錄及引物條件的確定

    RNA提取步驟參照RNA Simple Toal RNA Kit總RNA提取試劑盒(TIANGEN)說明書進行,從各組卵丘細胞中提取總RNA;測定RNA的濃度及純度,符合試驗要求的RNA放于-80℃長期保存,防止降解。提取的綿羊卵丘細胞總RNA進行反轉錄,得到cDNA,保存于-20℃,用于后續(xù)試驗。

    利用引物合成軟件Primer premier,得到目的基因和內參基因的引物序列,序列見表1。

    表1 目的基因引物序列

    1.6 實時熒光定量PCR

    分別以4組卵丘細胞cDNA為模板,以βactin為內參進行實時熒光定量PCR檢測,讀取目的基因、內參基因的Ct值,用△Ct法(Qr=2-△△Ct)計算各基因在綿羊卵丘細胞中的相對表達量。

    1.7 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

    每組試驗重復3次,數(shù)據(jù)結果使用SPSS軟件進行單因素方差分析、鄧肯氏多重檢驗,從而得到差異性檢驗結果。P>0.05表示差異不顯著,P<0.05表示差異顯著。

    2 結果與分析

    2.1 MTT法檢測各處理組細胞的增殖情況

    見圖1。

    由圖1可知,與對照組相比,Zebularine、Scriptaid聯(lián)合處理及單獨處理后卵丘細胞吸光度差異 不 顯 著(P >0.05),證明Zebularine與Scriptaid處理后不會對卵丘細胞增殖產生不良影響。

    2.2 熒光定量PCR檢測基因表達情況數(shù)據(jù)分析

    采用2-△△Ct方法計算基因相對表達量,結果見圖2~6。

    由圖2~6可知:與對照組相比,單獨使用5 nmol/L Zebularine或0.2μmol/L Scriptaid處理卵丘細胞,多潛能基因Oct4相對表達量顯著增加(P<0.05);BMP15和Sox2相對表達量增加但與對照組差異不顯著(P>0.05);Zebularine處理后卵丘細胞GDF9基因相對表達量顯著提高(P<0.05);單獨及聯(lián)合使用兩種試劑處理后DNMT1相對表達量均顯著降低(P<0.05)。

    3 討論

    自體細胞克隆羊多利降生以來,SCNT技術取得了重要進展,但供體細胞DNA甲基化水平過高或者組蛋白乙?;竭^低仍然是影響SCNT效率提高的重要問題[4,9]。Zebularine和Scriptaid分別是近年來常用的DNA甲基轉移酶抑制劑和組蛋白去乙?;敢种苿哂卸拘缘?、效率高的特點。本試驗利用Zebularine、Scriptaid單獨處理和聯(lián)合處理后,對卵丘細胞的增殖率沒有顯著影響,證明兩種藥物處理對卵丘細胞的增殖無不良影響。這與阮秋燕等[13]用Scriptaid處理水牛胎兒成纖維細胞的結果相一致。

    Oct4是多能性調控網絡中的關鍵因子,Sox2是一種編碼轉錄因子的基因,二者與細胞的發(fā)育潛能存在著密切聯(lián)系。在本試驗中,Zebularine或Scriptaid單獨處理卵丘細胞,多潛能基因Oct4相對表達量與對照組相比差異顯著,聯(lián)合處理對表達無影響。Xiong X.等[11]報道,Zebularine或Zebularine+Scriptaid聯(lián)合處理牦牛成纖維細胞可使Oct4和Sox2相對表達量增加,進而提高SCNT胚胎發(fā)育能力,本試驗結果與其相似;盧富春等[14]在豬上也得到了相似的結果。

    BMP15和GDF9是由卵母細胞分泌的兩個生長因子,屬TGFβ超家族成員。BMP15和GDF9能與卵丘細胞上的受體結合,引起下游基因的級聯(lián)反應,影響卵丘細胞的增殖和凋亡,從而調節(jié)卵泡發(fā)育與卵母細胞成熟[15]。Du M.等[16]檢測了GDF9在組蛋白去乙?;敢种苿═SA)處理后樣品中的表達水平,結果TSA對GDF9的表達無顯著影響(P>0.05)。在卵母細胞來源的因子中,BMP15可促進卵泡生長并被認為具有表觀遺傳效應。

    DNMT1是重要的DNA甲基轉移酶,其主要作用是維持甲基化[17]。研究表明,Zebularine可以使DNMT1表達降低或完全缺失[9],推測其主要是通過抑制DNMT1的表達來降低供體細胞的DNA甲基化水平。在本試驗中,使用 Zebularine和Scriptaid單獨或聯(lián)合處理卵丘細胞,均使DNMT1表達量顯著降低。

    值得注意的是,Zebularine和Scriptaid聯(lián)合處理綿羊卵丘細胞后,Oct4、Sox2、BMP15和GDF9表達量雖然均高于對照組,但均低于Zebularine或Scriptaid單獨處理,這可能與這兩種藥物仍具有一定的化學毒性有關;或是如果聯(lián)用兩種藥物處理供體體細胞,其最佳劑量和作用時間有待深入研究。 總之,Zebularine和Scriptaid單獨及聯(lián)合處理綿羊卵丘細胞,對細胞增殖無顯著影響,但可提高多潛能基因(Oct4、Sox2)、細胞分化相關基因(BMP15、GDF9)表達量,降低DNA甲基化相關基因(DNMT1)表達,表明Zebularine和Scriptaid對綿羊卵丘細胞重編程研究具有重要意義。

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