茶皂素的美白功效及其抑菌和抗氧化活性研究

郭海陽(yáng) 莫林蘭 譚海生 楊勁松 鄭曉燕 盛占武

(海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1，海南 570228)

(海南大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院2，海南 570228)

(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院海口實(shí)驗(yàn)站3，海南 570102)

茶皂素(Tea saponin)是一種五環(huán)三萜類皂苷，又被稱作油茶皂苷，其基本結(jié)構(gòu)包括具有親水性的糖體、疏水性的配基及有機(jī)酸[1]。茶皂素具有多種理化性質(zhì)如乳化性、發(fā)泡性、潤(rùn)滑性等，常被用作一種多功能的非離子表面活性劑。同時(shí)，茶皂素具有的多種生物活性如抗病毒、抗氧化、抗過(guò)敏、抑菌、消炎等，在食品、醫(yī)藥、農(nóng)藥、日用化工以及材料加工等許多領(lǐng)域已被廣泛應(yīng)用[2-3]。

酪氨酸酶(Tyrosinase)是一種含銅的氧化還原酶，它與生物體合成色素直接相關(guān)，也被稱為多酚氧化酶、酚氧化酶、兒茶酚氧化酶[4]。酪氨酸酶是整個(gè)黑色素生成反應(yīng)的限速酶，其催化產(chǎn)生的黑色素被分泌并進(jìn)入到表皮和毛發(fā)的角質(zhì)形成細(xì)胞[5]，與色素障礙性疾病的發(fā)生和治療有關(guān)，被認(rèn)為是此疾病治療藥物開(kāi)發(fā)的重要靶點(diǎn)。紫外線引發(fā)黑色素生成，這是一種人體防御機(jī)制，黑色素可保護(hù)皮膚細(xì)胞免受有害紫外線的傷害。然而，黑色素的異常積累會(huì)導(dǎo)致皮膚疾病，包括里耳氏黑變病、黃褐斑和老年斑等[6]。為了減少黑色素的異常積累，人們嘗試了多種途徑，包括抑制酪氨酸酶的活性，抑制黑色素從黑素細(xì)胞向角質(zhì)形成細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，以及干預(yù)黑色素生成過(guò)程中的細(xì)胞信號(hào)傳遞。盡管包括天然和合成物質(zhì)在內(nèi)的許多不同的化學(xué)物質(zhì)在細(xì)胞基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中顯示出了有意義的抗黑素作用，但大多數(shù)化學(xué)物質(zhì)在體內(nèi)動(dòng)物模型或人體中都產(chǎn)生了一些副作用，如效力不足、致癌、永久性脫色和皮炎[7-9]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多的化合物如熊果苷[10]、維生素C衍生物[11]和一些中藥提取物[12]等對(duì)酪氨酸酶的活性有較為明顯的抑制效果。因此，尋找一種更為安全有效且對(duì)人體無(wú)副作用的天然來(lái)源酪氨酸酶抑制劑已成為藥學(xué)和化妝品行業(yè)的熱點(diǎn)研究的趨向。

本試驗(yàn)擬選用油茶副產(chǎn)物茶皂素，通過(guò)對(duì)茶皂素抑制酪氨酸酶活性及其動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)和茶皂素對(duì)常見(jiàn)致病菌的抑菌能力、體外抗氧化活性進(jìn)行研究，以期擴(kuò)大油茶副產(chǎn)物茶皂素的開(kāi)發(fā)利用，為更高的發(fā)揮茶皂素的經(jīng)濟(jì)價(jià)值提供新的試驗(yàn)依據(jù)，為預(yù)防和治療色素疾病以及在美白化妝品中的應(yīng)用提供新的思路和方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌(Escherichia coli)、沙門菌(Salmonella)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、黑曲霉(Aspergillus niger) 海南大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

茶皂素標(biāo)準(zhǔn)品、DPPH、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-17-D超凈工作臺(tái)、SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱、JYL-Y11高速破壁打漿機(jī)、SKP-01熱恒溫培養(yǎng)箱、MDF-382E(N)超低溫冰箱、Millipore純水儀、DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋、YM50FGN全自動(dòng)高壓滅菌鍋。

1.3 方法

1.3.1 茶皂素對(duì)酪氨酸酶活性抑制試驗(yàn)1.3.1.1 酪氨酸酶酶提取液的制備[13]

稱取土豆，去皮于-20 ℃冷凍過(guò)夜后迅速切碎。按1∶10，2∶10，3∶10，4∶10，5∶10，6∶10的料液比分別加入pH=6.8磷酸緩沖液，在冰浴條件下，分別用組織搗碎機(jī)搗碎，制成10%、20%、30%、40%、50%、60%勻漿，經(jīng)4層紗布過(guò)濾，取濾液在轉(zhuǎn)速4 000 r/min的離心機(jī)中離心10 min，離心后的上清液即酪氨酸酶提取液，冰浴保存，2 h內(nèi)用完。

1.3.1.2 酪氨酸酶活性的測(cè)定及酶抑制率計(jì)算[14]

酪氨酸酶活力以酪氨酸酶催化L-DOPA氧化形成多巴醌的二酚酶活性來(lái)衡量。在5 mL試管，加入L-DOPA(0.015 mol/L)0.5 mL，pH=6.8磷酸緩沖液2.0 mL，30 ℃水浴保溫10 min后，再加入0.5 mL酪氨酸酶提取液，混和均勻，待酪氨酸被酪氨酸酶完全催化，將L-多巴轉(zhuǎn)化為紅色產(chǎn)物多巴醌，經(jīng)過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)量，于475 nm處有最大吸收。以每分鐘多巴色素在A475增加0.001為1個(gè)酶活力單位，即1 U/min，以每分鐘A475增加值來(lái)表示酶促反應(yīng)過(guò)程的速度[15]。從混合均勻開(kāi)始測(cè)量，測(cè)量到第11 min。在475 nm波長(zhǎng)下，測(cè)定不同實(shí)驗(yàn)條件下樣品的的吸光度，作圖，求直線斜率可得酶活力。根據(jù)已知酶活定義，按公式計(jì)算酪氨酸的相對(duì)酶活力及茶皂素對(duì)酪氨酸酶的抑制率。

式中：A1=A底物+酶；A2=A酶；A3=A底+酶+樣；A4=A酶+樣。

1.3.1.3 不同時(shí)間對(duì)酪氨酸酶催化 L-DOPA 氧化吸光度的影響[16]

將0.015 mol/L的L-DOPA與定量抑制劑混合均勻，在30 ℃水浴中保溫10 min，加入一定量的酪氨酸酶，分別測(cè)定不同反應(yīng)時(shí)間內(nèi)樣品液的吸光度及有無(wú)抑制劑存在條件下反應(yīng)液的吸光度變化，并計(jì)算其抑制率。

1.3.1.4 不同L-DOPA濃度對(duì)酪氨酸酶活力的影響[17]

取定量抑制劑，分別加入0.005 mol/L，0.01 mol/L，0.015 mol/L，0.02 mol/L，0.025 mol/L的 L-DOPA，混勻后30 ℃水浴10 min，水浴結(jié)束后向每支試管中加入0. 5 mL酪氨酸酶提取液，反應(yīng)12 min。最后加入0. 2 mL(0. 5 mol/L)鹽酸，反應(yīng)終止后立即在A475nm處進(jìn)行吸光度值測(cè)定。

1.3.1.5 不同濃度茶皂素對(duì)酪氨酸酶活力的影響

按1.3.1.2方法，取0.015 mol/L底物溶液，加入不同量的抑制劑，將混合液置于試管中，30 ℃水浴加熱10 min，向每支試管中加入酪氨酸酶0.5 mL，混合均勻測(cè)定混合液在A475nm處的吸光度值，計(jì)算抑制率。

1.3.1.6 測(cè)定茶皂素對(duì)酪氨酸酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)及抑制作用類型

茶皂素抑制酪氨酸酶二酚酶抑制動(dòng)力學(xué)在3 mL測(cè)活體系中，加入定量的酪氨酸酶，改變L-DOPA的濃度，按1.3.1.2方法測(cè)定不同濃度茶皂素對(duì)酪氨酸酶活力的影響。茶皂素對(duì)酪氨酸酶的抑制類型由Lineweaver-Burk方程而得，采用雙倒數(shù)作圖法，由圖形判斷其抑制類型。茶皂素對(duì)酪氨酸酶的抑制常數(shù)Ki由不同直線的斜率分別對(duì)茶皂素質(zhì)量濃度作圖求得。

1.3.2 抑菌作用試驗(yàn)

1.3.2.1 菌種的活化和菌懸液的制備[18]

將-85 ℃保藏的菌株取出，置于低溫下解凍60 min，采用平板劃線法接種復(fù)活。細(xì)菌在37 ℃下培養(yǎng)24 h，真菌在28 ℃下培養(yǎng)48 h 后，挑選出典型菌落接種于液體培養(yǎng)基中，在適宜溫度下(細(xì)菌37 ℃、真菌28 ℃)，恒溫培養(yǎng)至液體培養(yǎng)基變渾濁后，最后將渾濁液用無(wú)菌生理鹽水配制成含菌量為106～107 CFU/mL的菌懸液，備用。

1.3.2.2 茶皂素抑菌活性測(cè)定[19]

抑菌實(shí)驗(yàn)采用牛津杯法。配制質(zhì)量濃度分別為50.0、40.0、20.0、10.0、5.0、2.5 mg/mL的茶皂素溶液各10 mL。用移液槍吸取100 μL制備好的菌懸液，用滅菌涂布器均勻涂布于固體培養(yǎng)基上，每種指示菌設(shè)3個(gè)重復(fù)。然后用鑷子夾取3個(gè)滅菌牛津杯，在培養(yǎng)基表面垂直等距放置，并使其穩(wěn)定，再在牛津杯中加入不同質(zhì)量濃度的的茶皂素溶液，在第3個(gè)牛津杯中滴注無(wú)菌生理鹽水作空白對(duì)照，于冰箱中放置3～4 h，讓其充分?jǐn)U散。細(xì)菌37 ℃培養(yǎng)24 h，真菌28 ℃培養(yǎng)48 h 后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈，計(jì)算其平均值，并進(jìn)行對(duì)比研究。

1.3.3 體外抗氧化試驗(yàn)1.3.3.1 清除DPPH自由基能力[20]

將DPPH與無(wú)水甲醇混合，配制成0.01 mg/mL的DPPH甲醇溶液，配制濃度為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%的樣品溶液，用蒸餾水做空白組。分別吸取0.5 mL樣液與3 mLDPPH甲醇溶液于5 mL離心管中，震蕩均勻，在黑暗條件下靜置30 min。用紫外分光光度計(jì)測(cè)波長(zhǎng)為517時(shí)測(cè)定樣品液的吸光度A0(若有不溶物，離心去除)，得抑制率對(duì)于濃度的趨勢(shì)曲線，并按公式計(jì)算清除率。

式中：A0為DPPH溶液的吸光度；A1為樣品與DPPH溶液混合的吸光度；A2為樣品組的吸光度。

1.3.3.2 清除·OH能力的測(cè)定

根據(jù)Fenton法反應(yīng)產(chǎn)生·OH模型[21]，由于·OH能被水楊酸捕捉而氧化生成有色物質(zhì)，且該物質(zhì)能在510 nm處有很強(qiáng)的吸收值。當(dāng)有清除·OH的物質(zhì)加入時(shí)，該物質(zhì)會(huì)與水楊酸競(jìng)爭(zhēng)·OH，減少有色物質(zhì)的生成，從而導(dǎo)致吸光度降低。具體操作如下：取若干支 25 mL的比色管，按順序加入9 mmol/L FeSO4溶液1mL，9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液2 mL，不同質(zhì)量濃度的茶皂素溶液2 mL，8.8 mmol/L H2O2溶液2 mL，于37 ℃下反應(yīng)0.5 h。蒸餾水作空白調(diào)零，測(cè)定樣品在510 nm波長(zhǎng)下的吸光度A1，并按公式計(jì)算其清除率。

式中：A0為空白對(duì)照的吸光度；A1為加入樣品后的吸光度；A2為樣品溶液本身的吸光度，用蒸餾水替代顯色劑的吸光度。

1.3.3.3 總還原力的測(cè)定

總還原力的測(cè)定按文獻(xiàn)[22]進(jìn)行，取不同濃度的茶皂素溶液和VC溶液(2、4、6、8、10 mg/mL)1 mL添加到2.5 mL(pH 6.6)的磷酸鹽緩沖液及2.5 mL 1% K3Fe (CN)6溶液中，50 ℃下保溫20 min， 冷卻后再加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液混勻，3 000r/min條件下離心，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%的FeCl3溶液, 靜置后于700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，平行3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶皂素抑制酪氨酸酶活性試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酪氨酸酶催化 L-DOPA氧化反應(yīng)吸光度隨時(shí)間的變化

酪氨酸酶催化L-多巴反應(yīng)產(chǎn)生紅色物質(zhì)多巴醌，反應(yīng)液中顏色隨產(chǎn)物的濃度的增加而加深。圖1為不同加酶量時(shí)吸光度隨反應(yīng)時(shí)間的變化，從圖中可以看出，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，反應(yīng)體系的吸光度增大，即多巴醌的濃度增加，但曲線的斜率的逐漸減小，意味著反應(yīng)速度降低。12 min時(shí)，曲線斜率接近零，反應(yīng)不再進(jìn)行，因此試驗(yàn)選擇測(cè)定時(shí)間為12 min。

圖1酪氨酸酶催化L-多巴氧化反應(yīng)的進(jìn)程曲線

2.1.2 不同L-DOPA濃度對(duì)酪氨酸酶活力的影響

不同底物濃度對(duì)酪氨酸酶催化反應(yīng)影響很大，本試驗(yàn)在其他條件一定的基礎(chǔ)上，分別測(cè)定了不同底物濃度下對(duì)酶活力，如圖2可知，酶活力隨底物濃度的增加而升高。當(dāng)?shù)孜餄舛瘸^(guò)0.015 mol/L，酶活力基本趨于平穩(wěn)。故本試驗(yàn)選擇0.015 mol/L為最佳底物反應(yīng)濃度。

圖2不同底物濃度對(duì)酶活力的影響

2.1.3 不同濃度抑制劑對(duì)酪氨酸抑制率的影響

反應(yīng)體系中底物質(zhì)量濃度不變，加入不同量的抑制劑，補(bǔ)充pH=6.8磷酸緩沖液保持反應(yīng)液體積為3.0 mL，測(cè)定各反應(yīng)在不同時(shí)間下的吸光度變化，進(jìn)而得出不同濃度的抑制劑對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率變化見(jiàn)圖3。

圖3不同濃度抑制劑對(duì)酶活力影響

由圖3可知茶皂素對(duì)酪氨酸酶有抑制作用，反應(yīng)時(shí)間相同時(shí)，抑制劑濃度增大，抑制率增加且隨濃度的增加對(duì)酶活性的抑制作用顯著增強(qiáng)，表明茶皂素對(duì)酪氨酸酶的抑制率與濃度呈線性變化關(guān)系，當(dāng)茶皂素溶液質(zhì)量濃度為8.0 mg/mL時(shí)，抑制率可達(dá)81.76%。

2.1.4 茶皂素對(duì)酪氨酸酶酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)及抑制作用類型

在反應(yīng)體系中，固定酪氨酸酶質(zhì)量濃度，改變底物濃度，測(cè)定不同茶皂素對(duì)酪氨酸酶活力的影響，得到相應(yīng)的反應(yīng)速率，以底物濃度對(duì)反應(yīng)速率做圖，結(jié)果如圖4所示。

圖4底物濃度對(duì)反應(yīng)速率的影響

酪氨酸酶催化氧化是遵行Michealis-Menten動(dòng)力學(xué)方程[23]。以底物濃度的倒數(shù)和反應(yīng)速度的倒數(shù)作雙倒數(shù)圖，得到如圖5所示的對(duì)應(yīng)的Lineweaver-Burk圖。

由圖5的雙倒數(shù)圖示：兩條直線相交于X軸的副軸，坐標(biāo)交點(diǎn)(-0.42，0)。由圖5可知，未加茶皂素溶液的試驗(yàn)組動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km=2.38 mg/mL，vmax= 0.014 ΔA/min，加入抑制劑的試驗(yàn)組動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km=2.38 mg/mL，vmax=0.009 ΔA/min。結(jié)果顯示加入茶皂素的試驗(yàn)組的Km值不變，而vmax隨抑制劑濃度增加而減小，表明茶皂素溶液對(duì)酪氨酸酶的抑制作用類型符合非競(jìng)爭(zhēng)性抑制的特征。酪氨酸酶多亞基的含銅酶，結(jié)構(gòu)復(fù)雜。酪氨酸酶在活性位點(diǎn)攜帶兩個(gè)銅原子，當(dāng)抑制劑和底物相互競(jìng)爭(zhēng)去結(jié)合酪氨酸酶所攜帶的銅離子時(shí)，能夠抑制酪氨酸酶活性[24]。有研究發(fā)現(xiàn)茶皂素能夠與銅離子絡(luò)合生成絡(luò)合物[25]，因此推測(cè)可能是由于茶皂素在酪氨酸的酶促反應(yīng)過(guò)程中競(jìng)爭(zhēng)到了銅離子而形成了絡(luò)合物，從而抑制了酶活性。

圖5抑制作用Lineweaver-Burk圖

2.2 茶皂素抑菌試驗(yàn)結(jié)果

牛津杯法得到茶皂素的抑菌試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可以看出，茶皂素對(duì)不同微生物的抑菌效果表現(xiàn)均不相同，抑制效果對(duì)濃度表現(xiàn)出較明顯依賴性，并且抑菌圈大小隨茶皂素濃度變化呈現(xiàn)出隨濃度升高而增大的規(guī)律。試驗(yàn)表明，茶皂素溶液對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌均表現(xiàn)出較明顯的抑制作用，對(duì)黑曲霉的抑菌效果較弱，對(duì)沙門氏菌無(wú)抑制作用。其中大腸桿菌對(duì)茶皂素最為敏感，當(dāng)質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL時(shí)，就表現(xiàn)出一定的抑菌效果。當(dāng)茶皂素質(zhì)量濃度大于10.0 mg/mL時(shí)，對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用增大且明顯高于大腸桿菌，當(dāng)質(zhì)量濃度增大至50.0 mg/mL時(shí)，枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑達(dá)到23.83 mm，有較強(qiáng)的抑菌作用?？梢?jiàn)茶皂素抑菌作用廣譜，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)茶皂素抑菌相關(guān)產(chǎn)品提供參考。

表1 不同質(zhì)量濃度茶皂素抑菌作用

注：同列平均數(shù)標(biāo)注不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 茶皂素抗氧化試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 清除DPPH自由基能力

DPPH是一種穩(wěn)定存在的自由基，通過(guò)檢測(cè)在517 nm附近的光吸收程度可以判斷抗氧化劑對(duì)DPPH的清除能力。不同濃度的VC和茶皂素對(duì)DPPH清除率的影響如圖6所示，茶皂素對(duì)DPPH自由基有一定的清除能力。隨著茶皂素質(zhì)量濃度的增加，其對(duì)DPPH自由基的清除效果增強(qiáng)，當(dāng)茶皂素質(zhì)量濃度為6 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率達(dá)到57.33%。

圖6清除DPPH自由基能力

2.3.2 對(duì)·OH 清除率的測(cè)定

羥基自由基(·OH)是生物活體內(nèi)毒性大且最活波的自由基，圖7為不同濃度下的茶皂素和VC對(duì)羥基自由基的清除能力，從圖中可知，茶皂素對(duì)羥基自由基具有一定的清除能力。低濃度時(shí)茶皂素對(duì)·OH自由基的清除率與VC比相差較大，隨濃度的上升，樣品的清除率增大，當(dāng)樣品質(zhì)量濃度達(dá)到10 mg/mL時(shí)，樣品對(duì)羥基自由基的清除率達(dá)到69.89%。

圖7清除·OH自由基能力

2.3.3 茶皂素及VC的總還原力

通過(guò)測(cè)定樣品還原Fe3+能力可以反應(yīng)其抗氧化能力強(qiáng)弱, 樣品的還原力越強(qiáng)其抗氧化能力就越強(qiáng)。圖8為700 nm處測(cè)得的吸光度值，由圖可知，吸光度值隨著茶皂素質(zhì)量濃度增加而增加，其還原能力增強(qiáng)。通過(guò)茶皂素與VC標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相同濃度的茶皂素與VC比還原力差異較大。

圖8茶皂素及VC的總還原力

3 結(jié)論

本研究選取油茶副產(chǎn)物茶皂素為研究對(duì)象，采用酪氨酸酶多巴速率氧化法測(cè)定茶皂對(duì)體外酪氨酸酶活性的抑制作用，推斷其抑制類型；利用DPPH自由基清除法、羥基自由基清除法及總還原力法對(duì)茶皂素的抗氧化能力進(jìn)行研究；利用茶皂素對(duì)大腸桿菌(Escherichiacoli)、沙門菌(Salmonella)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和黑曲霉(Aspergillusniger)等常見(jiàn)的致病菌和真菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示茶皂素能顯著地抑制酪氨酸酶活性，當(dāng)茶皂素溶液濃度為 8.0 mg/mL 時(shí)，抑制率可達(dá)到 81.76%，茶皂素對(duì)酪氨酸酶的抑制作用類型屬于非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，茶皂素同時(shí)也表現(xiàn)出較好的抑菌抗氧化效果。本研究發(fā)現(xiàn)茶皂素能夠抑制酪氨酸酶活性，茶皂素不僅具有天然抗氧化成分且還具有天然抑菌成分。