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    龍眼HD-Zip 家族固有無(wú)序蛋白的預(yù)測(cè)與分析

    2020-07-07 08:42:18張春渝許小瓊張梓浩陳裕坤林玉玲賴鐘雄
    園藝與種苗 2020年5期
    關(guān)鍵詞:無(wú)序龍眼位點(diǎn)

    張春渝,許小瓊,張梓浩,陳裕坤,林玉玲,賴鐘雄

    (福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所,福建福州350002)

    長(zhǎng)期以來(lái),在人類的固有思維里都認(rèn)為蛋白質(zhì)需要折疊成一定的三維結(jié)構(gòu),才能發(fā)揮生物學(xué)功能。直到20世紀(jì)90 年代,這種固有思維被逐漸打破,人們發(fā)現(xiàn)有一類蛋白在天然孤立狀態(tài)下,沒(méi)有一個(gè)明確唯一的三維結(jié)構(gòu),局部或完全不折疊,但是也能發(fā)揮一定的生物學(xué)功能[1-2]。研究者們將這類蛋白稱之為固有無(wú)序蛋白質(zhì)(intrinsically disordered protein,IDPs)或天然無(wú)折疊蛋白質(zhì)(nativelyun folded protein,NUP)[3]。在發(fā)現(xiàn)的初期,人們?cè)鴮⑦@類蛋白稱為垃圾蛋白質(zhì)組(junk proteome)[4],認(rèn)為它不具有什么功能。但伴隨著人們對(duì)蛋白質(zhì)研究的深入,這類蛋白的生物學(xué)功能逐漸被挖掘,如多肽類激素(polypeptide hormones),是植物體內(nèi)一類重要的信號(hào)物質(zhì),在植物的防御、受精以及生長(zhǎng)和發(fā)育方面起著重要作用,據(jù)研究發(fā)現(xiàn)其在溶液狀態(tài)下是無(wú)序的[5-6]。值得注意的是,無(wú)序蛋白中存在著特殊的作用機(jī)制,當(dāng)無(wú)序蛋白和其他蛋白質(zhì)相結(jié)合時(shí),能夠折疊成有序結(jié)構(gòu),因而存在一系列快速互變的構(gòu)象[2]。目前,預(yù)測(cè)蛋白是否具有無(wú)序區(qū)已然成為當(dāng)下的一個(gè)熱點(diǎn)。據(jù)悉,在著名的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的比賽Critical Assessment of Structure Prediction 中[7],預(yù)測(cè)無(wú)序蛋白已經(jīng)成為一項(xiàng)比賽的內(nèi)容,可見(jiàn)固有無(wú)序蛋白在蛋白質(zhì)研究中的重要性。

    無(wú)患子科龍眼屬龍眼(Dimocarpus longan Lour.)是熱帶和亞熱帶的常綠果樹(shù)之一,具有豐富的營(yíng)養(yǎng)與藥用價(jià)值。HD-Zip 作為植物中特有的轉(zhuǎn)錄因子,在植物的應(yīng)激脅迫中發(fā)揮著重要作用[8-9]。同樣,有研究結(jié)果表明,固有無(wú)序蛋白因?yàn)樽陨斫Y(jié)構(gòu)的特點(diǎn),可在植物受到逆境脅迫時(shí)快速反應(yīng),從而減少逆境對(duì)植物的傷害[1]。如脫水蛋白(DHNs)可穩(wěn)定細(xì)胞膜從而減少擬南芥受到冷凍脅迫時(shí)的傷害[10];擬南芥的ANAC019 介導(dǎo)的ABA 超敏反應(yīng)與其無(wú)序C-端的TRD(transcription regulatory domain)有關(guān)[11]。故固有無(wú)序蛋白在植物應(yīng)答以及適應(yīng)逆境方面發(fā)揮著重要作用[12]。目前對(duì)于龍眼HD-Zip 無(wú)序蛋白的研究尚屬空白,因此有必要對(duì)龍眼HD-Zip 固有無(wú)序蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè),進(jìn)一步探究龍眼HD-Zip 參與植物應(yīng)激脅迫的分子機(jī)制。

    該文通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)室基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中提取出來(lái)的19 條龍眼HD-Zip 的蛋白序列進(jìn)行無(wú)序蛋白區(qū)域的預(yù)測(cè)、無(wú)序區(qū)域的特征以及無(wú)序區(qū)域與有序區(qū)域氨基酸序列偏好性的分析,以期為進(jìn)一步研究龍眼HD-Zip 的結(jié)構(gòu)與功能、蛋白互作奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的龍眼基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI 登錄號(hào):BioProject PRJNA305337)中提取的19 條HD-Zip 成員的蛋白序列。

    1.2 方法

    于 DISOPRED3[13](http://bioinf. cs. ucl. ac.uk/psipred/disopred=1)在線網(wǎng)站對(duì)19 條HD-Zip 成員的蛋白進(jìn)行無(wú)序區(qū)域預(yù)測(cè),并用WPS 以及Excel 對(duì)其蛋白質(zhì)的無(wú)序區(qū)以及有序區(qū)的氨基酸數(shù)目進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì),以便后續(xù)分析(其中由于Dlo-026005.1、Dlo-027079.2 的蛋白質(zhì)中含有部分未知氨基酸序列,故不進(jìn)行后續(xù)分析)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 無(wú)序區(qū)域的特征

    注:(Ala丙氨酸)Alanine、(半Cys胱氨酸)Cysteine、(Asp天冬氨酸)Aspartic acid、(Glu谷氨酸)Glutamic acid、 (Phe苯丙氨酸)Phenylalanine、(Gly甘氨酸)Glycine、(組His氨酸)、Histidine(Ile異亮氨酸)Isoleucine、(賴Lys氨酸)、Lysine(Leu亮氨酸)Leucine、(蛋Met氨酸)Methionine、(Asn天冬酰胺)Asparagine、(Pro脯氨酸)Proline、(Gln谷氨酰胺)、Glutamine(Arg精氨酸)Arginine、(絲Ser氨酸)Serine、(蘇Thr氨酸)Threonine、(纈Val氨酸)Valine、(Trp色氨酸)Tryptophan、(酪Tyr氨酸)Tyrosine。 下同。表1 龍眼HD-Zip 蛋白中無(wú)序區(qū)的氨基酸分布(Disordered)基因名[14]ID Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Ile Lys Leu Met Asn Pro Gln Arg Ser Thr Val Trp Tyr氨基酸數(shù)目總蛋白序列長(zhǎng)度占全部蛋白序列的比例∥%DLHB2-1 DLHB3-1 Dlo_032045.1 Dlo_032917.22 60 23 65 22 08 44 34 04 14 73 010 36 67 65 218 95 106 50 04 3100 7525686739.0625008.650519 DLHB3-3 DLHB3-4 Dlo_018995.1 Dlo_030526.17 31 15 22 20 05 63 20 21 15 33 22 36 44 32 29 98 54 20 00 067 528108218.2716056.333739 DLHB4-1 DLHB4-2 Dlo_016699.2 Dlo_022443.15 72 04 315 88 111 42 36 47 210 515 49 217 1010 36 219 65 67 00 03 1161 7184361919.09845811.470113 DLHB4-3 DLHB4-4 Dlo_022441.1 Dlo_005643.15 00 06 42 03 25 102 18 43 05 93 23 110 92 52 14 103 20 30 01 167 647147139.3837548.976157 DLHB4-7 DLHB4-8 Dlo_031302.1 Dlo_017332.18 210 26 135 75 415 324 34 64 47 125 48 144 134 57 1514 192 64 61 01 1108187744198714.5161299.411173 DLHB4-9 Dlo_009359.15179264304484631234018664513.333333 DLHB1-1 DLHB1-2 Dlo_027392.1 Dlo_002458.11 01 08 07 22 05 42 14 16 13 21 04 23 00 43 28 06 22 11 00 167 2320522532.68292710.222222

    通過(guò)DISOPRED3 對(duì)龍眼HD-Zip 成員的蛋白進(jìn)行無(wú)序區(qū)域的預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)19 個(gè)龍眼HD-Zip 成員中共有15 個(gè)成員的蛋白具有無(wú)序區(qū)域,并且這些蛋白的無(wú)序區(qū)域都是由連續(xù)30 個(gè)以上的氨基酸組成。按照固有無(wú)序蛋白的分類,此類蛋白質(zhì)應(yīng)屬于部分無(wú)序的固有無(wú)序蛋白[15]。其中,預(yù)測(cè)結(jié)果中龍眼HD-Zip 蛋白的無(wú)序區(qū)又根據(jù)是否具有蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)分為Disordered 與Disordered,portein binding。對(duì)其中13 個(gè)成員(除Dlo-026005.1、Dlo-027079.2)無(wú)序區(qū)的這2 種情況的氨基酸分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(表1~2)。結(jié)果表明:首先,龍眼HD-Zip 蛋白的Disordered 的氨基酸總數(shù)大于Disordered,portein binding,其中Disordered 的氨基酸總數(shù)為1128,Disordered,portein binding 的氨基酸總數(shù)為593,可見(jiàn)無(wú)序區(qū)域中存在參與蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的區(qū)域約為全部無(wú)序區(qū)域的1/3;其次,13 個(gè)龍眼HD-Zip 在Disordered區(qū)域各成員具有的氨基酸種類為12-19,在Disordered,portein binding 各成員具有的氨基酸種類也為12-19,但從整體氨基酸分布的情況上來(lái)看,Disordered 區(qū)域相較于Disordered,portein binding 氨基酸的種類在分布上更加豐富;通過(guò)計(jì)算每個(gè)成員蛋白中Disordered 與Disordered,portein binding 區(qū)域序列所占的比例發(fā)現(xiàn),同一亞家族的含量相近(除DLHB1-1 與DLHB1-2 存有一定的差異),猜測(cè)無(wú)序區(qū)域的形成以及無(wú)序區(qū)域的大小可能與蛋白的結(jié)構(gòu)域有著一定的聯(lián)系。

    %白∥蛋例部比全的占列9.75609832.00000021.8750004.1522494.6913587.3081614.6263357.9159947.8431377.1528756.3172041.6104685.736434序白度蛋長(zhǎng)205225256867810821843619714713744645總列序1987酸基目 207256 36 38603949 56 51473237氨數(shù)Tyr 031 0 1100 1 1110 Trp 010 0 0000 0 0000),portein binding Val 061 1 1141 0 1123 Thr 367 2 1632 1 4210 Ser 2107 5 61059 9 11321(Disordered Arg 122 1 3115 3 5211 Gln 120 4 0310 1 1201布Pro 141 3 0320 0 0310分酸65 2 3565 5 2534 Asn 13基氨的Met 33 3 2201 2 1131區(qū)序43 2 3610 2 0212無(wú)Leu 0中白Lys 040 1 2312 4 2002蛋HD-Zip Ile 221 2 0023 2 01161 His 001 1 132 3 4102眼龍Gly 110 5 54454426 8 1210表Phe 033 0 1100 1 1111 Glu 155 1 1153 5 1763 Asp 223 1 3414 3 4334 Cys 001 0 1111 1 0100 Ala 242 2 4515 5 1122 ID Dlo_027392.1 Dlo_002458.1 Dlo_032045.1 Dlo_032917.2 Dlo_018995.1 Dlo_030526.1 Dlo_016699.2 Dlo_022443.1 Dlo_022441.1 Dlo_005643.1 Dlo_031302.1 Dlo_017332.1 Dlo_009359.1名因基DLHB1-1 DLHB1-2 DLHB2-1 DLHB3-1 DLHB3-3 DLHB3-4 DLHB4-1 DLHB4-2 DLHB4-3 DLHB4-4 DLHB4-7 DLHB4-8 DLHB4-9

    為分析在龍眼HD-Zip 蛋白無(wú)序區(qū)域中哪些氨基酸種類有促進(jìn)無(wú)序區(qū)域中蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū)域的組成,對(duì)20 種氨基酸在無(wú)序區(qū)域的含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。從氨基酸的傾向性來(lái)分析(表3)可以發(fā)現(xiàn):Cys、Asp、Glu、Gly、His、Lys、Met、Asn、Arg、Ser、Thr、Tyr 這12 種氨基酸在Disordered,portein binding 區(qū)域的含量較高,其中Gly 表現(xiàn)出最強(qiáng)的傾向性。說(shuō)明這12 種氨基酸較傾向于無(wú)序區(qū)中蛋白結(jié)合位點(diǎn)的序列組成。

    2.2 氨基酸偏好性特征

    表3 龍眼HD-Zip 蛋白無(wú)序區(qū)域氨基酸含量

    對(duì)上述13 個(gè)龍眼HD-Zip 成員蛋白質(zhì)的無(wú)序區(qū)以及有序區(qū)的氨基酸統(tǒng)計(jì)表明,無(wú)序區(qū)氨基酸的總數(shù)為1721,約占蛋白質(zhì)全部序列的18.2%,因此有序區(qū)的氨基酸總數(shù)約為無(wú)序區(qū)的4.5 倍??梢?jiàn),龍眼HD-Zip 蛋白的有序區(qū)氨基酸總數(shù)要大大高于無(wú)序區(qū)域,龍眼HD-Zip 蛋白質(zhì)主要還是以有序區(qū)為主。

    為分析氨基酸在龍眼HD-Zip 蛋白中的偏好性,對(duì)無(wú)序區(qū)以及有序區(qū)的不同氨基酸含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì),并且計(jì)算有序區(qū)與無(wú)序區(qū)之間各類氨基酸的含量(表4),可以看出,在龍眼HD-Zip 蛋白中Asp、Gly、His、Met、Asn、Pro、Ser、Thr這幾種氨基酸在無(wú)序區(qū)的含量高于有序區(qū),表明這8 種氨基酸有利于無(wú)序區(qū)的組成;而Ala、Cys、Glu、Phe、Ile、Lys、Leu、Gln、Arg、Val、Trp、Tyr 則在有序區(qū)的含量高于無(wú)序區(qū),表明這12 種氨基酸在一定程度上比較有利于有序區(qū)域的組成。在20 種氨基酸中,Gly 最有利于龍眼HD-Zip 蛋白中無(wú)序區(qū)域的組成,其在無(wú)序區(qū)域的含量與有序區(qū)域大約相差5.637288 個(gè)百分點(diǎn);而Leu 則最有利于龍眼HD-Zip蛋白中有序區(qū)域的組成,其在有序區(qū)的含量比無(wú)序區(qū)高出了4.114621 個(gè)百分點(diǎn)??梢?jiàn)在龍眼HD-Zip 中,20 種氨基酸對(duì)無(wú)序區(qū)域以及有序區(qū)域的形成各有所偏向。

    表4 龍眼HD-Zip 蛋白有序區(qū)及無(wú)序區(qū)的氨基酸含量對(duì)比

    3 討論

    3.1 龍眼HD-Zip 固有無(wú)序蛋白可能通過(guò)分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與應(yīng)激反應(yīng)

    通過(guò)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),19 個(gè)龍眼HD-Zip 成員中15 個(gè)成員為固有無(wú)序蛋白。據(jù)悉,固有無(wú)序蛋白通過(guò)分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與植物對(duì)逆境的脅迫和適應(yīng)。同時(shí),HD-Zip 轉(zhuǎn)錄因子在植物的應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[9,16]。因此猜測(cè)龍眼HD-Zip 固有無(wú)序蛋白可能參與應(yīng)激反應(yīng)并且存在分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)以往的研究報(bào)道[12],固有無(wú)序蛋白的分子調(diào)控具有多種模式。其中,與完全無(wú)序的蛋白質(zhì)相比,部分無(wú)序蛋白中的有序區(qū)域可能起到了結(jié)合特定的DNA 序列,啟動(dòng)光信號(hào)等作用。同時(shí)部分無(wú)序蛋白又根據(jù)無(wú)序區(qū)與有序區(qū)是否存在分子內(nèi)的相互作用分為兩類。分子間不存在明顯相互作用的蛋白,其無(wú)序區(qū)可能與其他的蛋白質(zhì)相互作用,有序區(qū)在此過(guò)程中起協(xié)作作用。分子間存在明顯相互作用時(shí),又存在3 種情況:其一,無(wú)序域可在有序域釋放活性位點(diǎn);其二,無(wú)序域可從有序區(qū)域中釋放出來(lái)從而與其他蛋白相互作用;其三,無(wú)序區(qū)域在有序區(qū)域與無(wú)序區(qū)域同時(shí)釋放活性位點(diǎn),進(jìn)而與其他蛋白相互作用。這些分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在植物的非生物脅迫、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等方面發(fā)揮著重要作用。據(jù)報(bào)道,轉(zhuǎn)錄因子NAC[17]、HY5[18]存在第一類分子調(diào)控模式;GRAS[19]、CRY[20]存在第二類分子調(diào)控模式。至于龍眼HD-Zip 中固有無(wú)序蛋白通過(guò)哪種分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與應(yīng)激反應(yīng),還需后續(xù)進(jìn)一步探究。

    3.2 龍眼HD-Zip 固有無(wú)序蛋白具有氨基酸偏好性

    對(duì)具有完整氨基酸序列的13 個(gè)成員進(jìn)行無(wú)序區(qū)域特征的分析發(fā)現(xiàn),龍眼HD-Zip 存在固有無(wú)序區(qū)域,且在這些無(wú)序區(qū)域中存在蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。此前有研究者對(duì)IDPs與其他蛋白的結(jié)合位點(diǎn)殘基做了分析,其認(rèn)為疏水性、側(cè)鏈凈電荷量較少、極性較小、溶劑可及性表面積較大、側(cè)鏈體積較大、極化率較大的氨基酸殘基比較有利于IDPs 與蛋白質(zhì)作用位點(diǎn)的形成[3]。而該研究未對(duì)此做深入分析,龍眼HD-Zip 固有無(wú)序蛋白的作用位點(diǎn)殘基是否也具有這些特點(diǎn),值得后續(xù)更加深入地分析。

    對(duì)龍眼HD-Zip 蛋白的有序區(qū)域以及無(wú)序區(qū)域的氨基酸含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì),結(jié)果表明在龍眼HD-Zip 蛋白的氨基酸序列中,Asp、Gly、His、Met、Asn、Pro、Ser、Thr 促進(jìn)無(wú)序區(qū)域的 形 成,Ala、Cys、Glu、Phe、Ile、Lys、Leu、Gln、Arg、Val、Trp、Tyr 促進(jìn)有序區(qū)域的形成。早前,Radivojac 對(duì)固有蛋白的氨基酸偏好性做了分析,他認(rèn)為Phe、Val、Leu、His、Thr、Cys、Trp、Tyr、Ile、Asn 這幾種氨基酸相對(duì)促進(jìn)有序結(jié)構(gòu)的形成;Asp、Met、Lys、Arg、Ser、Gln、Pro、Glu 則促進(jìn)無(wú)序區(qū)域的形成;Ala 和Gly 則表現(xiàn)中性[21]。通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn),該研究和Radivojac 都認(rèn)為Cys、Trp、Tyr、Ile、Phe、Val、Leu 促進(jìn)有序區(qū)域的形成;Asp、Met、Ser、Pro 促進(jìn)無(wú)序區(qū)域的形成。但仍存在一些不同,筆者認(rèn)為His、Thr、Asn 促進(jìn)無(wú)序區(qū)域的形成,而Radivojac 認(rèn)為其促進(jìn)有序區(qū)域的形成;筆者認(rèn)為L(zhǎng)ys、Arg、Glu、Gln 促進(jìn)有序區(qū)域的形成,而Radivojac 認(rèn)為是促進(jìn)無(wú)序區(qū)域的形成。猜測(cè)形成這種差異的原因可能是:其一,該研究選取的范圍較小,僅為龍眼HD-Zip 成員;其二,對(duì)固有無(wú)序蛋白的預(yù)測(cè)方法有所不同。

    4 展望

    本次預(yù)測(cè)固有無(wú)序蛋白的工具為DISOPRED3,其相較于上一代DISOPRED2 更加準(zhǔn)確[13]。除此之外,還有PONDR VL3[22]、POODLE-L[23]等一些計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)軟件。通過(guò)試驗(yàn)的方法預(yù)測(cè)無(wú)序蛋白的結(jié)構(gòu)存在諸多困難,比如費(fèi)用高昂、需要花費(fèi)大量時(shí)間,因此預(yù)測(cè)軟件的發(fā)展在固有無(wú)序蛋白的研究上顯得尤為重要。但目前固有無(wú)序蛋白的預(yù)測(cè)還存在許多局限之處,如預(yù)測(cè)的精確和準(zhǔn)確程度。據(jù)日前報(bào)道[24],人們已經(jīng)利用AI 技術(shù),進(jìn)行了蛋白3D 結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè):谷歌“深度思維”(DeepMind)公司將人工智能“阿法狗”轉(zhuǎn)型,研究出一種“阿法折疊”(AlphaFold)的程序,成功根據(jù)基因序列預(yù)測(cè)出蛋白質(zhì)的3D 結(jié)構(gòu)。以此趨勢(shì),未來(lái)人工智能必定在蛋白的研究與發(fā)展中起到更加重要的作用,無(wú)序蛋白的精準(zhǔn)預(yù)測(cè)也將指日可待。

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