銀杏果外種皮多糖的脫色工藝及抗氧化活性研究

趙浩晨 王婉婷 雷佳美 徐艷

摘要：以銀杏果肉質(zhì)外種皮為原料，采用水提醇沉法提取其水溶性多糖。以過(guò)氧化氫為脫色劑，多糖脫色率和保留率為指標(biāo)，脫色時(shí)間、脫色溫度、pH值和過(guò)氧化氫體積分?jǐn)?shù)為試驗(yàn)因素，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以確定影響脫色的因素及其水平，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）法、還原力測(cè)定法對(duì)多糖進(jìn)行抗氧化活性檢測(cè)。結(jié)果表明，脫色溫度為 60 ℃，脫色時(shí)間為1 h，pH值為8，過(guò)氧化氫加入量為8%時(shí)脫色效果最佳。抗氧化測(cè)定結(jié)果表明，銀杏外種皮多糖具有良好的抗氧化活性，脫色后抗氧化活性略有降低。

關(guān)鍵詞：銀杏果;外種皮;過(guò)氧化氫;脫色;多糖;抗氧化活性

中圖分類號(hào)： R284.2 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2020）10-0228-04

收稿日期：2019-04-09

基金項(xiàng)目：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目（編號(hào)：201810157338）。

作者簡(jiǎn)介：趙浩晨（1996—），男，遼寧撫順人，主要從事生物工程研究。E-mail：99644880@qq.com。

通信作者：徐 艷，博士，講師，主要從事天然產(chǎn)物活性研究。E-mail：1472105886@qq.com。

銀杏（Ginkgo biloba L.）果，俗稱白果，其營(yíng)養(yǎng)非常豐富，在許多國(guó)家和地區(qū)均有大量分布，自古以來(lái)被當(dāng)作營(yíng)養(yǎng)豐富的高級(jí)滋補(bǔ)品[1]。目前，對(duì)銀杏葉和果的研究已取得了很多進(jìn)展[2-4]，但對(duì)銀杏果果外種皮的研究還較少。銀杏果外種皮是銀杏種子硬殼外面的肉質(zhì)部分，長(zhǎng)期以來(lái)被作為廢物丟棄，既浪費(fèi)了資源，又污染了環(huán)境[5]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年約有3萬(wàn)t外種皮作為廢物被丟棄。近幾年的研究表明，銀杏外種皮具有多方面藥理活性，有較高的利用價(jià)值[6]。銀杏外種皮含有多種化合物，包括多糖、酚酸、黃酮、銀杏內(nèi)酯等[7-9]。其中，多糖含量最高，且具有抗氧化、抑菌、增強(qiáng)免疫力等多種生物活性[10-11]。

然而，銀杏外種皮經(jīng)過(guò)水提醇沉后得到的多糖呈現(xiàn)深褐色，色素屬于雜質(zhì)性物質(zhì)，會(huì)阻礙多糖的進(jìn)一步分離純化，并阻礙作用機(jī)制等方面的研究。因此，有必要對(duì)多糖進(jìn)行脫色。過(guò)氧化氫脫色法是利用過(guò)氧化氫在水溶液中可電離出過(guò)氧化氫根離子（HO-2）與發(fā)色基團(tuán)作用，使得發(fā)色基團(tuán)被破壞而起到脫色作用，該方法具有脫色后不易復(fù)色的特點(diǎn)，主要適用于色素多且含有不飽和雙鍵、羥基和芳香環(huán)的物質(zhì)[12-13]。但H2O2也可能造成多糖的氧化或破壞，因此結(jié)合多糖保留率指標(biāo)來(lái)篩選出H2O2的更優(yōu)水平。

本研究采用過(guò)氧化氫進(jìn)行氧化脫色，以多糖脫色率和保留率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用正交試驗(yàn)優(yōu)化脫色工藝，并研究脫色前后多糖的抗氧化活性。

1 材料、試劑與儀器

材料：銀杏果，2018年10月采自沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)校園，去核，于-70 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

試劑：1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，A Johnson Matthey Company）;體積分?jǐn)?shù)為30%的過(guò)氧化氫以及葡萄糖、濃硫酸、蒽酮等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

儀器：UV-2100型分光光度計(jì)[龍尼可（上海）儀器有限公司];HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司）;

2 試驗(yàn)方法

2.1 銀杏果外種皮多糖的提取

稱取銀杏果外種皮200 g，將其用勻漿機(jī)打成漿，采用乙醇回流法去除其中的脂溶性物質(zhì)，將剩余濾渣用水煎煮法提取水溶性多糖，提取2次，每次2 h，合并濾液。采用Sevage法對(duì)粗多糖水溶液進(jìn)行脫蛋白處理。用三氯甲烷 ∶ 正丁醇為4 ∶ 1的混合液反復(fù)萃取多糖水溶液，直至中間白色蛋白層消失為止。將脫蛋白后的多糖水溶液用3倍量乙醇進(jìn)行沉淀，靜止過(guò)夜，用乙醇抽洗至干。

2.2 過(guò)氧化氫對(duì)銀杏外種皮多糖進(jìn)行脫色的工藝研究[14]

選擇過(guò)氧化氫為脫色劑，以脫色時(shí)間、脫色溫度、pH值和過(guò)氧化氫體積分?jǐn)?shù)為試驗(yàn)因素，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以確定脫色影響因素及其水平，采用 L9（34） 正交設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，以多糖脫色率、保留率為考察最佳脫色工藝的指標(biāo)。多糖含量的測(cè)定采用硫酸-蒽酮法。

多糖脫色率=（D1-D2）/D1×100%;

（1）

多糖保留率=M后/M前×100%。

（2）

式中：D1、D2分別為多糖溶液在脫色前、后的吸光度;M前、M后分別為多糖溶液在脫色前、后的多糖含量。

2.2.1 脫色的影響因素及其水平的確定[15] 準(zhǔn)確移取多糖溶液，考察過(guò)氧化氫加入量（4%、6%、8%、10%、12%）、脫色時(shí)間（0.5、1、2、3 h）、pH值（8、9、10、11）、脫色溫度（40、50、60、70 ℃）4個(gè)因素對(duì)多糖脫色率的影響。

2.2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.2.2.1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)詳見(jiàn)表1。

2.2.2.2 正交試驗(yàn) 采用L9（34）正交設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)。

2.3 銀杏外種皮多糖的抗氧化活性測(cè)定

采取提取物與穩(wěn)定自由基DPPH反應(yīng)的分析方法考察多糖對(duì)DPPH自由基的清除率[16]，采用鐵離子還原法（FRAP）和鐵氰化鉀還原法來(lái)測(cè)定多糖的還原性[17]。

3 結(jié)果與分析

3.1 脫色的影響因素及其水平的確定

3.1.1 過(guò)氧化氫加入量對(duì)脫色的影響 由圖1可知，隨著H2O2加入量的增加，多糖脫色率提高。H2O2加入量由4%增加到6%時(shí)，脫色趨勢(shì)平緩，多糖脫色率增加3.0百分點(diǎn)。H2O2加入量由6%增加到10%時(shí)，多糖脫色率增加7.5百分點(diǎn)，超過(guò)10%，多糖脫色率變化不大。因此，考慮脫色效果及成本，選擇6%、8%、10% 3個(gè)水平的H2O2加入量進(jìn)行正交試驗(yàn)。

3.1.2 脫色時(shí)間對(duì)過(guò)氧化氫脫色的影響 由圖2可知，在脫色時(shí)間0.5～2.0 h內(nèi)，脫色率隨脫色時(shí)間的增加而上升，然后脫色趨勢(shì)平緩，因此，考慮選擇1、2、3 h共3個(gè)水平的脫色時(shí)間進(jìn)行正交試驗(yàn)。

3.1.3 pH值對(duì)過(guò)氧化氫脫色的影響 由圖3可知，當(dāng)pH值由8增加到9時(shí)，脫色率快速升高。但當(dāng)pH值超過(guò)10后，脫色率增幅不大。因此，選用pH值8、9、10共3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

3.1.4 脫色溫度對(duì)過(guò)氧化氫脫色的影響 由圖4可知，當(dāng)脫色溫度由40 ℃升到50 ℃時(shí)，脫色率略有提高。但當(dāng)脫色溫度超過(guò)50 ℃時(shí)，脫色率反而下降。因此，選用40、50、60 ℃ 3個(gè)水平的脫色溫度進(jìn)行正交試驗(yàn)。

3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，各因素對(duì)脫色率的影響程度依次為C>D>B>A，各因素對(duì)多糖保留率的影響程度依次為D>C>A>B。各因素對(duì)脫色率與保留率乘積的影響程度依次為C>D>B>A。k值顯示，各因素最優(yōu)水平為A3B1C1D2，即脫色溫度為60 ℃，脫色時(shí)間為1 h，pH值為8，過(guò)氧化氫加入量為8%。

3.3 脫色對(duì)銀杏外種皮多糖抗氧化活性的影響

3.3.1 對(duì)DPPH自由基清除活性的影響 由圖5可知，隨多糖濃度的增加，銀杏外種皮多糖對(duì)DPPH自由基清除活性增強(qiáng)。脫色后多糖清除DPPH自由基活性略有下降，但變化不大。

3.3.2 對(duì)多糖還原力的影響 由圖6可知，隨多糖質(zhì)量濃度的增加，銀杏外種皮多糖還原力增強(qiáng)。脫色后多糖還原力略有下降，但變化不大。

4 結(jié)論與討論

以過(guò)氧化氫為脫色劑，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)脫色條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳工藝條件為脫色溫度60 ℃，脫色時(shí)間1 h，pH值8，過(guò)氧化氫加入量8%。用過(guò)氧化氫對(duì)銀杏外種皮多糖脫色，工藝簡(jiǎn)單，多糖保留率高。多糖脫色后抗氧化活性略有下降，但變化不明顯。

目前常用的多糖脫色方法有活性碳脫色法、過(guò)氧化氫氧化脫色法。但活性炭吸附色素的同時(shí)，多糖損失也較多，而且后期過(guò)濾較為困難。過(guò)氧化氫脫色現(xiàn)象明顯，多糖保留率高，雖然過(guò)氧化氫脫色會(huì)使多糖部分氧化，活性略有降低，但仍不失為一種簡(jiǎn)單、可行的脫色方法。

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