中性紅褪色光度法測定白菜中過氧化氫酶活性

武 洋，董 娜，張愛菊，張小林

(甘肅醫(yī)學(xué)院，平?jīng)?744000)

植物體及植物果實在逆境或衰老時，會發(fā)生因過氧化氫(H2O2)累積導(dǎo)致的氫氧自由基(·OH)數(shù)量增加的現(xiàn)象?！H 具有強氧化性，會破壞細胞膜，加速細胞的衰老和解體，而過氧化氫酶(CAT)是最重要的酶促防御系統(tǒng)，可清除H2O2、保護細胞，因此CAT 活性是植物新鮮度的一個重要評價指標(biāo)[1-2]。目前過氧化氫酶活性的測定方法主要有滴定法[3-5]、紫外光度法[6-8]、熒光分析法[9]等，其中，化學(xué)動力學(xué)光度法[10-14]已成為一大亮點。文獻[14]以二苯胺磺酸鈉為底物采用CAT 顯色動力光度法檢測了CAT 的活性，但該方法顯色靈敏度較低，H2O2-二苯胺磺酸鈉體系的表觀摩爾吸光系數(shù)(ε)小于1.0×103L·mol－1·cm－1。中性紅(NR)是一種偶氮基有色染料，在硫酸介質(zhì)中能被底物H2O2氧化為無色，F(xiàn)e3＋可催化加速氧化反應(yīng)進程，H2O2-NR 體系的ε為1.16×105L·mol－1·cm－1。

本工作在H2O2-NR 體系中加入CAT，以期通過CAT 加入前后吸光度的變化來測定白菜中CAT活性(E)(單位為U·mL－1或U·g－1)。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

7230G 型可見分光光度計。

CAT 標(biāo)準(zhǔn)溶液:取適量CAT 標(biāo)準(zhǔn)品(活性為2 000～5 000 U·mg－1)，用磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)配制成1 g·L－1(5 000 U·mL－1)CAT 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，用0.020 mol·L－1高錳酸鉀溶液標(biāo)定其含量，然后用磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)逐級稀釋，配制成1 U·mL－1的CAT 標(biāo)準(zhǔn)溶液。

酸性Fe3＋溶液:0.01 mol·L－1，稱取5 g硫酸鐵銨于50 mL 燒杯中，加入1 mol·L－1硫酸溶液2 mL，待溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。

NR 溶液:5×10－4mol·L－1，用95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇稀釋制得。

H2O2基質(zhì)溶液:1 mmol·L－1，由30%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))H2O2溶液稀釋制得。

0.1 mol·L－1磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)；試劑均為分析純；試驗用水為二次蒸餾水。

1.2 試驗方法

稱取20 g本地大白菜樣品，研碎，用磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)定容至1 000.0 mL，取稀釋液1.00 mL(酶活小于15 U·mL－1)于50 mL 容量瓶中，再加入H2O2基質(zhì)溶液5.00 mL，在25 ℃下進行酶催化反應(yīng)15 min后，立即加入酸性Fe3＋溶液1.00 mL終止酶促反應(yīng)，再加入NR 溶液3.00 mL，搖勻，在80 ℃水浴中進行褪色反應(yīng)25 min后加水定容。取適量樣品溶液于1 cm 比色皿中，以水為參比，于波長528 nm 處測量其吸光度A。同時完成空白試驗吸光度A0測定，根據(jù)吸光度的變化ΔA(ΔA＝A0－A)確定CAT 的活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的選擇

在波長400～600 nm 處對3 種體系(NR、H2O2-NR、CAT-H2O2-NR)的吸光度進行掃描，結(jié)果見圖1。

圖1 吸收光譜圖Fig.1 Absorption spectra

由圖1可知:NR 在528 nm 處有最大吸收，其峰形尖銳，峰值較高；加入H2O2后，528 nm 處的吸光度降至最低，這是由于H2O2與NR 發(fā)生的褪色反應(yīng)引起的；加入CAT 后，528 nm 處的吸光度又增加至NR 體系的一半，褪色程度被抑制，說明引起褪色反應(yīng)的核心物質(zhì)是H2O2。試驗選擇檢測波長為528 nm。

2.2 褪色反應(yīng)催化劑的選擇

由于H2O2氧化NR 發(fā)生的褪色反應(yīng)不明顯，而Fe3＋、Fe2＋和Mn2＋對此反應(yīng)均有催化作用，因此試驗考察了Fe3＋、Fe2＋和Mn2＋等3種金屬離子的催化效果。結(jié)果表明:當(dāng)c(H2O2)＝0.2 mmol·L－1時，F(xiàn)e3＋、Fe2＋和Mn2＋對H2O2-NR 體系褪色反應(yīng)的催化程度不同，F(xiàn)e3＋作用更顯著，因此，試驗選擇的催化劑為Fe3＋。

2.3 NR用量及體系吸光度范圍的選擇

NR 溶液的吸光度值取決于溶液酸度和NR 用量，控制pH 不大于6，測定了不同用量的NR 溶液的吸光度。試驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)NR 溶液用量在5.00 mL內(nèi)時，其吸光度與用量的線性關(guān)系良好。但為了減少測量誤差，試驗控制體系的吸光度為0.2～0.7，選擇NR 溶液的用量為3.00 mL。

2.4 褪色反應(yīng)水浴溫度及底物H2 O2 用量的選擇

試驗考察了不同水浴溫度和不同底物用量對H2O2-NR 體系吸光度的影響，見圖2。

圖2 不同溫度下底物H2 O2 用量對H2 O2-NR體系吸光度的影響Fig.2 Effect of the amount of substrate H2 O2 on the absorbance of H2 O2-NR system at different temperatures

由圖2可知:在2種水浴溫度下，H2O2的用量與吸光度均在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，但80℃時的線性范圍更寬(5.00 mL內(nèi))，吸光度變化幅度更大。因此，試驗選擇水浴溫度為80 ℃，H2O2的用量為5.00 mL。

2.5 褪色反應(yīng)時間的選擇

試驗考察了反應(yīng)時間對H2O2-NR 體系吸光度的影響，見圖3。

由圖3可知:隨著反應(yīng)時間的增加，體系的吸光度逐漸降低；在15 min 內(nèi)，褪色現(xiàn)象明顯，15 min后褪色反應(yīng)速度變緩；25 min時吸光度趨于穩(wěn)定。為了確保H2O2反應(yīng)完全和提高測量體系的穩(wěn)定性，試驗選擇褪色反應(yīng)時間為25 min。

2.6 硫酸用量的選擇

圖3 褪色反應(yīng)時間對H2 O2-NR 體系吸光度的影響Fig.3 Effect of the discoloration reaction time on absorbance of H2 O2-NR system

酶促反應(yīng)的終結(jié)和褪色反應(yīng)的發(fā)生均需要硫酸，除此之外，硫酸介質(zhì)還能有效克服Fe3＋水解。取CAT 標(biāo)準(zhǔn)溶液5.00 mL，試驗考察了硫酸用量對CAT-H2O2-NR 體系和H2O2-NR 體系吸光度差值(ΔA)的影響。結(jié)果表明:ΔA隨酸度的增加而降低，當(dāng)不添加硫酸時，ΔA最大，這說明酸性Fe3＋溶液中所含的硫酸完全滿足褪色反應(yīng)的要求，因此，試驗不需要額外加硫酸。

2.7 酶催化反應(yīng)時間影響

取CAT 標(biāo)準(zhǔn)溶液5.00 mL，試驗考察了不同酶催化反應(yīng)時間對CAT-H2O2-NR 體系吸光度的影響，見圖4。

圖4 酶催化反應(yīng)時間對CAT-H2 O2-NR體系吸光度的影響Fig.4 Effect of the enzymatic reaction time on the absorbance of CAT-H2 O2-NR system

由圖4可知:在1～8 min內(nèi)，吸光度隨著酶催化反應(yīng)時間的延長而增加，且單位時間內(nèi)吸光度變化量一致，符合酶催化一級反應(yīng)特征。12 min后，吸光度趨于穩(wěn)定。綜合考慮，試驗選擇酶催化反應(yīng)時間為15 min。

2.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

按照試驗條件對0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06，0.08，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 U·mL－1的CAT 標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進行測試，以CAT 的活性為橫坐標(biāo)，其對應(yīng)的吸光度變化值ΔA為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。CAT 的活性在0.3 U·mL－1內(nèi)與ΔA呈線性關(guān)系，線性回歸方程為ΔA＝0.201 1＋1.133E，相關(guān)系數(shù)為0.998 1。

按照試驗條件測定空白11次，以3倍信噪比計算檢出限(3S/N)為0.006 8 U·mL－1。

2.9 精密度和回收試驗

取大白菜的葉、莖、根等3個部位，按照試驗方法進行加標(biāo)回收試驗，計算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表1。

表1 精密度和回收試驗結(jié)果(n＝6)Tab.1 Results of test for precision and recovery(n＝6)

由表1 可知:CAT 的回收率為104%，說明樣品中的共存物質(zhì)不影響酶活性的測定。大白菜葉、莖、根中CAT 活性依次為6.25，9.00，8.00 U·g－1，莖部和根部的CAT 活性更高。

2.10 干擾試驗

按照試驗方法考察白菜樣品中的共存還原性物質(zhì)(葡萄糖、果糖、維生素C、乳糖、半乳糖)對0.50 mL CAT 標(biāo)準(zhǔn)溶液的干擾情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，濃度小于1/2基質(zhì)溶液濃度的葡萄糖、果糖、維生素C、乳糖、半乳糖不影響ΔA的測定，測量誤差小于3%，滿足儀器分析的要求。

2.11 自然放置過程中的CAT活性變化

按照試驗方法測試了大白菜莖部樣品中CAT活性，考察了其隨自然放置時間的變化，結(jié)果見表2。

表2 自然放置過程中白菜莖部CAT活性的變化(n＝3)Tab.2 Changes of the activity of CAT in the stem of Chinese cabbage during natural placement(n＝3)

由表2可知:CAT 活性隨自然放置時間延長而快速下降，4 d后降低至原來的30%。這是由于植物在衰老時，糖類等高分子物質(zhì)逐漸發(fā)生降解，導(dǎo)致H2O2累積、CAT 減少，蔬菜的新鮮度降低。

本工作構(gòu)建了中性紅褪色光度法測定大白菜不同部位CAT 活性的方法，結(jié)果令人滿意。