響應(yīng)面分析法和單因素分析法優(yōu)化艾草中黃酮類物質(zhì)的提取條件

劉羽暄，杜 慧，張換平，申艷紅

(1.四川大學(xué) 華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，成都 610041；2.安陽工學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，安陽 455000)

艾草是一種民間藥，“家有三年艾，郎中不用來”[1]這句俗語足以說明艾草的重要藥用價值?，F(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)，艾灸對多種疾病，如血脂異常、血糖異常[2]、失眠[3]、腹瀉[4]、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[5]，以及過敏性鼻炎[6]等均有良好療效。艾草的藥效主要來自于所含的黃酮類物質(zhì)。黃酮類物質(zhì)是一種天然的多酚類化合物，對人體產(chǎn)生的毒性及副作用很小[7]，且集多種藥理活性于一身，具有抗抑郁、降低血脂、擴張血管、抗腫瘤等藥理活性[8]。黃酮類物質(zhì)的提取條件一直是從事相關(guān)工作的研究者的研究熱點。

從艾草中提取黃酮類物質(zhì)的方法較多，其中，分子熒光光度法具有操作簡單方便、靈敏度高、樣品用量少、選擇性好等優(yōu)點[9]。由于黃酮類物質(zhì)在一定條件下能與鋁離子結(jié)合生成較穩(wěn)定且具有熒光特性的化合物，因此本工作采用分子熒光光度法測定艾草中黃酮類物質(zhì)的提取率。

響應(yīng)面分析法是采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過回歸方程的分析，取得最佳工藝參數(shù)的一種統(tǒng)計方法。該方法不僅能直觀地反映出各因素在單獨存在下對響應(yīng)值的影響，還可以反映出兩兩因素在交互作用下對響應(yīng)值的影響。

本工作采用響應(yīng)面分析法和單因素分析法優(yōu)化艾草中黃酮類物質(zhì)的提取條件，以期為艾草中黃酮類物質(zhì)的提取提供可參考的依據(jù)。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

T6新世型紀(jì)紫外可見分光光度計；F-7000 型分子熒光光度計；FA 10048型電子分析天平；KQ-250B型超聲清洗器。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液:稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.302 6 g，用50%乙醇溶液(體積分?jǐn)?shù)，下同)溶解并稀釋至100.0 mL，配制成3.026 g·L－1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線用溶液系列:在0.20，0.30，0.40，0.50，0.60 mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液中，分別依次加入5.3 g·L－1硝酸鋁溶液2.38 mL，乙酸-乙酸鈉緩沖溶液0.90 mL，最后用50%乙醇溶液定容至10.0 mL，待溶液熒光配位反應(yīng)完成后，即得到標(biāo)準(zhǔn)曲線用溶液系列。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的純度不小于98%；其他試劑均為分析純；乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(p H 5.61)；試驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

發(fā)射波長為398 nm；激發(fā)和發(fā)射光譜通帶寬度均為10 nm；熒光光譜掃描范圍為400～600 nm。

1.3 試驗方法

將艾葉粉末置于溫度為50℃的恒溫干燥箱中，干燥至恒重后密封于廣口瓶備用。取艾草粉末0.5 g于提取器中，并加入50%乙醇溶液15 mL，在30 ℃下超聲提取30 min，減壓過濾，濾液以2 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心30 min，取1 mL 的上清液，依次加入5.3 g·L－1硝酸鋁溶液2.38 mL 和pH 5.61乙酸-乙酸鈉緩沖溶液0.9 mL，用50%乙醇溶液定容至10.0 mL，振蕩20 min，使艾草中的黃酮類物質(zhì)與鋁離子的熒光配位反應(yīng)完全，在儀器工作條件下測定。黃酮類物質(zhì)的提取率公式為:

式中:w為黃銅類物質(zhì)提取率，%；ρ為待測液黃酮類物質(zhì)質(zhì)量濃度，g·L－1；D為稀釋倍數(shù)；V為提取液體積，mL；m為艾草粉末的質(zhì)量，mg。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在儀器工作條件下對標(biāo)準(zhǔn)曲線用標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進行測定，以蘆丁的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，其對應(yīng)的熒光強度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為y＝1.600×104x＋76.12，相關(guān)系數(shù)為0.995 4，線性范圍為0.006～0.018 g·L－1。

2.2 單因素分析法中黃酮類物質(zhì)提取條件的優(yōu)化

2.2.1 乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)

按照試驗方法考察了40%，50%，60%，70%，80%的乙醇溶液對艾草中黃酮類物質(zhì)提取率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)對艾草樣品中黃酮類物質(zhì)提取率的影響Fig.1 Effect of the volume fraction of ethanol solution on the rate of extraction of flavonoids from wormwood sample

由圖1可知，當(dāng)使用50%乙醇溶液提取時，艾草中黃酮類物質(zhì)的提取率較高，試驗選擇50%乙醇溶液。

2.2.2 超聲時間

按照試驗方法考察了超聲時間分別為10，20，30，40，50 min時對艾草中黃酮類物質(zhì)提取率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 超聲提取時間對艾草樣品中黃酮類物質(zhì)提取率的影響Fig.2 Effect of the time of ultrasonic extraction on the rate of extraction of flavonoids from wormwood sample

由圖2可知:隨著超聲時間的延長，艾草中黃酮類物質(zhì)的提取率一直增加；當(dāng)超聲時間為40 min時，提取率較大；當(dāng)超聲時間大于40 min時，提取率大幅度下降。因此，試驗選擇超聲時間為40 min。

2.2.3 艾草樣品質(zhì)量和乙醇溶液體積的比值

分別稱取艾草粉末0.300 8，0.501 4，1.001 0，1.501 1，2.015 g，移取50%乙醇溶液15 mL，對應(yīng)艾草樣品質(zhì)量和50%乙醇溶液體積的比值(料液比)分別為0.3∶15，0.5∶15，1.0∶15，1.5∶15，2.0∶15，按試驗方法進行測定，結(jié)果見圖3。

圖3 艾草樣品質(zhì)量和乙醇溶液體積比值對黃酮類物質(zhì)提取率的影響Fig.3 Effect of the ratio of mass of wormwood sample to volume of ethanol solution on the rate of extraction of flavonoids

由圖3可知:艾草中黃酮類物質(zhì)的提取率隨著料液比的增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，當(dāng)料液比為1.0 g∶15 mL的時候，提取率較高。在單因素最優(yōu)條件下，艾草中黃酮類物質(zhì)的提取率為1.07%。

2.3 響應(yīng)面分析法中黃酮類物質(zhì)提取條件的優(yōu)化

以乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時間、料液比三個因素為響應(yīng)面法優(yōu)化因素，利用Design Expert 8.0軟件進行三因素三水平設(shè)計，見表1。

表1 析因試驗中的因素與水平表Tab.1 Factors and levels in factorial design

2.3.1 回歸模型的建立與方差分析

按照試驗方法對響應(yīng)面法設(shè)計的17組方案進行測試，結(jié)果見表2。對表2中的數(shù)據(jù)采取二次多項式回歸模型進行擬合分析，得到的二次多項式回歸方程為Y＝1.02＋1.175×10－3A－0.026B－0.14C＋0.028AB－0.060AC＋0.12BC－0.093A2－0.011B2－0.31C2，方程中三因素系數(shù)的絕對值反映了這三個因素對黃酮類物質(zhì)熒光強度的影響程度。

表2 響應(yīng)面設(shè)計及提取率結(jié)果Tab.2 Response surface design and results of rate of extraction

為檢驗?zāi)Ｐ偷挠行?，對?中的數(shù)據(jù)進行響應(yīng)面回歸模型方差分析[10]，結(jié)果見表3，其中，“??”為差異性極顯著(P＜0.000 1)；“?”為差異性顯著(P＜0.05)。

表3 響應(yīng)面回歸模型方差分析結(jié)果Tab.3 Results of variance analysis of the response surface regression model

表3 (續(xù))

由表3可以看出:模型的F值為13.72，且P值小于0.01，說明此模型的顯著性極高。失擬項的F值為2.83，P值大于0.05，說明失擬項不顯著，表明此模型模擬性較好[11]。在回歸模型中，F(xiàn)值越大，該因素對響應(yīng)面的影響就越大，乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時間、料液比對提取率的影響順序按從小到大排列依次是乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時間、料液比。方程的一次項C，交互項BC，二次項A2、C2的P值均小于0.05，說明這些因素對提取率的影響都較顯著。模型R2為0.975 4，說明該模型的擬合度較好，乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時間、料液比和艾草中黃酮類物質(zhì)提取率的非線性關(guān)系比較顯著。

該模型的顯著性強，可靠程度高，可以對試驗結(jié)果進行預(yù)測和分析。

2.3.2 不同因素下的響應(yīng)面分析

對上述試驗結(jié)果進行分析，能夠得到不同因素下的響應(yīng)面圖及等高線圖，而等高線圖的形狀能夠反映出兩個因素交互作用的強弱和顯著程度[12]，等高線是圓形表示兩個變量之間的交互作用不明顯，是橢圓形表示兩個變量之間交互作用明顯[13-14]；響應(yīng)面圖是響應(yīng)值對各試驗因素所構(gòu)成的三維空間曲線圖，響應(yīng)曲面越陡峭，說明該因素對試驗結(jié)果的影響越大[15]。

固定料液比，乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲時間對艾草中黃酮類物質(zhì)提取率影響的響應(yīng)面圖(a)和等高線圖(b)見圖4。

圖4 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)和超聲時間對艾草中黃酮類物質(zhì)提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.4 Response surface and contour maps showing effect of the volume fraction of ethanol solution and time of ultrasonic extraction on the rate of extraction of flavonoids from wormwood

由圖4可以看出:響應(yīng)面圖比較平緩，等高線圖的形狀接近橢圓，由此可知，當(dāng)固定料液比時，乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲時間之間的交互作用不太顯著。

固定超聲時間，乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比對艾草中黃酮類物質(zhì)提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖見圖5。

由圖5可以看出:響應(yīng)面圖比較陡峭，等高線圖的形狀是橢圓，由此可知，當(dāng)固定超聲時間時，乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比對試驗結(jié)果的影響較大，兩者之間的交互作用非常顯著。

固定乙醇體積分?jǐn)?shù)，料液比和超聲時間對艾草中黃酮類物質(zhì)提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖見圖6。

由圖6可以看出:響應(yīng)面圖比較陡峭，等高線圖的形狀接近橢圓，由此可知，當(dāng)固定乙醇體積分?jǐn)?shù)時，超聲時間與料液比之間的交互作用比較顯著。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比對艾草中黃酮類物質(zhì)提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour maps showing effect of volume fraction of ethanol solution and ratio of mass of wormwood sample to volume of ethanol solution on rate of extraction of flavonoids from wormwood

圖6 超聲時間和料液比對艾草中黃酮類物質(zhì)提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour maps showing effect of time of ultrasonic extraction and ratio of mass of wormwood sample to volume of ethanol solution on rate of extraction of flavonoids from wormwood

以上分析可以進一步優(yōu)化得到最佳提取條件:乙醇體積分?jǐn)?shù)為49.96%，超聲時間為30 min，料液比為0.79 g:15 mL，在此條件下提取率可達1.09%。

2.3.3 驗證試驗

在優(yōu)化出的最佳試驗條件下做平行試驗進行驗證。分別稱取0.790 4，0.790 2，0.789 7 g艾草粉末，各加入49.96%乙醇溶液15 mL，按照試驗方法進行測定并計算艾草中黃酮類物質(zhì)的提取率，得到的平均提取率為1.08%，與理論值的相對誤差為－0.92%，說明此模型準(zhǔn)確可靠，可以用于預(yù)測不同的提取條件下艾草中黃酮類物質(zhì)的提取率。

本工作基于熒光光度法測定的艾葉中的黃酮類物質(zhì)提取率的數(shù)據(jù)進行了單因素分析和方差分析，建立了響應(yīng)值與乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時間、料液比等三因素的二次多項式模型，優(yōu)化得到了艾葉中黃銅類物質(zhì)的最佳提取條件，試驗驗證結(jié)果滿意。該模型可靠性高，可用于預(yù)測艾葉中黃酮類物質(zhì)的提取率。