自體富血小板血漿對(duì)骨關(guān)節(jié)炎模型兔軟骨細(xì)胞凋亡及NLRP3/IL-1β通路的影響*

屈一鳴，邵高海，張銘華，李 波，朱鳳臣，何 超，曹春風(fēng)，趙 波

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院骨科，重慶402160）

膝骨關(guān)節(jié)炎屬于常見骨關(guān)節(jié)疾病，伴隨炎癥、疼痛、骨組織病變、關(guān)節(jié)功能喪失，隨著老齡化的升高發(fā)病率逐漸升高，使膝關(guān)節(jié)功能降低，影響患者生活質(zhì)量[1]。目前臨床治療骨關(guān)節(jié)炎的方法較多，但關(guān)節(jié)自身再生能力較差，目前尚無理想治療方法，因此促進(jìn)損傷軟骨的修復(fù)及進(jìn)行干預(yù)、預(yù)防對(duì)于提高患者預(yù)后十分重要。富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）是自體血液中分離的血液制品，其含有的高濃度血小板可釋放出大量的生長(zhǎng)因子，促進(jìn)軟骨的修復(fù)，多項(xiàng)研究證實(shí)其能夠促進(jìn)軟骨組織再生及修復(fù)[2-3]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）在固有免疫中發(fā)揮重要作用，近期研究顯示NLRP3信號(hào)通路的異常激活與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生密切相關(guān)[4]，然而其是否參與PRP修復(fù)骨關(guān)節(jié)炎受損軟骨過程目前尚不清楚。本研究復(fù)制兔骨關(guān)節(jié)炎模型并給予PRP治療，旨在探究其對(duì)受損軟骨的修復(fù)作用及可能的作用機(jī)制。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性新西蘭大白兔27只，體重1.8～2.0 kg，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)及使用許可證號(hào)為SCXK（渝）2018-0003，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為2019012704，飼養(yǎng)溫度控制在22～25℃，濕度為50%，飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。

2 主要藥品、試劑與儀器

玻璃酸鈉（sodium hyaluronate，SH）注射液購于山東博士倫福瑞達(dá)制藥有限公司；蘇木素-伊紅染色試劑盒購于中杉金橋生物公司；免疫組化檢測(cè)試劑盒購于北京索萊寶有限公司；RIPA裂解液、BCA檢測(cè)試劑盒和TUNEL染色試劑盒購于碧云天生物技術(shù)有限公司；脫鈣液購于BOSTER；兔抗鼠NLRP3、caspase-1、含caspase募集結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC）和白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）抗體購于Abcam；兔抗鼠caspase-3、Bax、β-actin和Bcl-2抗體及HRP標(biāo)記的Ⅱ抗購于Sigma。NLRP3抑制劑MCC950和IL-1β抑制劑eucalyptol購自MCE；NLRP3和IL-1β ELISA試劑盒購自上海恒斐生物科技有限公司。

RM2135型石蠟切片機(jī)購于TKO；BX53型光學(xué)顯微鏡購于Olympus；Gel Doc XR型凝膠成像儀購于Bio-Rad；OmniPAGE Maxi型垂直電泳儀購于Cleave。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 PRP的制備 根據(jù)Freymiller等[5]的方法制備PRP：采集兔耳靜脈血10 mL，200×g離心10 min后，收集白層膜以上血漿，置于離心機(jī)中，800×g離心10 min，下層0.8 mL為PRP，吹打均勻，細(xì)胞數(shù)為（1.98±0.33）×109/L。

3.2 模型制備和分組 隨機(jī)選擇6只兔作為假手術(shù)（sham）組，剩余21只兔用于模型制備。采取改良Hulth法[6]制備左膝骨關(guān)節(jié)炎模型：于關(guān)節(jié)正中部位做一切口，長(zhǎng)為4 cm，將關(guān)節(jié)腔逐層打開后，探查關(guān)節(jié)腔內(nèi)是否存在病變，將前交叉部位韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶切斷，并切除內(nèi)側(cè)半月板，止血后用生理鹽水沖洗腔內(nèi)，逐層縫合切口。造模后第1天經(jīng)肌肉注射青霉素預(yù)防感染，注射量為3×105U/kg，連續(xù)注射1周，隔天換藥至傷口愈合，觀察到兔出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹、活動(dòng)度降低、皮溫升高的特征，則代表模型成功，6周后停止造模。假手術(shù)組僅切開膝關(guān)節(jié)皮膚，不做其他處理。造模成功18只，將造模成功的兔隨機(jī)分為模型（model）組、SH組和PRP組，每組6只。SH組于左膝關(guān)節(jié)腔注射0.5 mL SH注射液，每周1次；PRP組于左膝關(guān)節(jié)腔注射0.5 mL PRP，每次1次；sham組和model組均注射等量生理鹽水，連續(xù)5周。

3.3 樣本采集及軟骨細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 末次給藥結(jié)束后，兔禁食、禁水12 h，采用空氣栓塞法處死兔，立刻用手術(shù)刀截取模型組兔約1 mm×1 mm×1 mm脛骨近端軟骨面，置于DMEM培養(yǎng)液中，除去血污，青、鏈霉素雙抗清洗3次，加入胰酶消化，消化完全后，離心，棄去上清液，隨后加入0.025%Ⅱ型膠原酶，37℃恒溫震蕩5 h，離心收集細(xì)胞，并用DMEM混懸，培養(yǎng)于含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中。獲取膝關(guān)節(jié)腔觀察關(guān)節(jié)大體情況；將一部分軟骨組織置于10%多聚甲醛中固定24 h，另一部分軟骨組織凍存于-80℃。

3.4 軟骨大體形態(tài)觀察 肉眼觀察膝關(guān)節(jié)軟骨表面，采取Pelletier評(píng)分[7]對(duì)軟骨大體形態(tài)進(jìn)行評(píng)定，根據(jù)軟骨表面缺損情況、光澤等來評(píng)定，評(píng)分為0～4分，評(píng)分越高表明軟骨損傷越嚴(yán)重。

3.5 HE染色評(píng)定軟骨病理形態(tài)學(xué)的變化 取出固定的軟骨組織，置于脫鈣液中處理10 d后，進(jìn)行石蠟包埋，制備石蠟切片，切片厚度為6 μm，HE染色，參照Mankin評(píng)分[8]對(duì)軟骨組織病理學(xué)變化進(jìn)行評(píng)定。

3.6 TUNEL染色觀察軟骨組織細(xì)胞凋亡情況 軟骨組織石蠟切片在二甲苯中脫蠟、乙醇中脫水后，添加不含DNase的蛋白酶，PBS洗滌3次后，在樣品上加50 μL TUNEL檢測(cè)液，37℃避光孵育60 min，PBS洗滌3次，采取抗熒光淬滅封片液封片，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。細(xì)胞凋亡率（%）=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

3.7 免疫組化檢測(cè)NLRP3/IL-1β通路蛋白的表達(dá)采用SP染色法染色軟骨組織切片，切片經(jīng)脫蠟脫水后置于0.3%過氧化氫中孵育10 min，微波修復(fù)后采用血清封閉抗原，采用Ⅰ抗（1∶200）孵育切片，4℃冷藏過夜后，清洗后添加Ⅱ抗室溫下孵育1 h，添加鏈卵白素Ⅱ抗稀釋液，經(jīng)DAB顯色、蘇木素復(fù)染、透明、脫水、封片后，在光鏡下觀察蛋白染色情況，NLRP3蛋白定位在細(xì)胞膜上，ASC、caspase-1和IL-1β定位在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞漿內(nèi)，用ImageJ軟件定量評(píng)估蛋白陽性表達(dá)率。

3.8 Western blot法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 軟骨組織脫鈣處理后，用RIPA裂解液提取組織蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度后，統(tǒng)一量取40 μg進(jìn)行SDSPAGE，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉溶液封閉膜后，采用抗caspase-3、Bax、Bcl-2抗體（1∶300）孵育，濃膜用HRP標(biāo)記的Ⅱ抗孵育，經(jīng)ECL發(fā)光顯影后用ImageJ軟件定量分析蛋白相對(duì)表達(dá)。

3.9 NLRP3和IL-1β調(diào)控關(guān)系的驗(yàn)證 取分離的軟骨細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為1×108/L，隨后接種到24孔板中，培養(yǎng)過夜。設(shè)置對(duì)照（control）組（不經(jīng)任何處理）、MCC950（125 μmol/L）組和eucalyptol（500 μmol/L）組，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。按照分組處理，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，用ELISA測(cè)定各組細(xì)胞NLRP3和IL-1β的水平。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）描述，多組間比較行單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 自體PRP對(duì)兔軟骨大體形態(tài)的影響

如圖1所示，假手術(shù)組的膝關(guān)節(jié)大體色澤明亮，關(guān)節(jié)表面平整，軟骨厚度正常，未發(fā)生退變；模型組的兔軟骨表面不平整，關(guān)節(jié)失去正常光澤，軟骨組織呈片狀剝落，見圖中虛線部位；經(jīng)SH或PRP治療后軟骨組織得到一定的修復(fù)，其中PRP組的改善優(yōu)于SH組。

Figure 1.General condition of the rabbit cartilage in each group.圖1 各組兔軟骨大體情況

與假手術(shù)組相比，模型組的Pelletier評(píng)分顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，SH組和PRP組的Pelletier評(píng)分顯著降低（P＜0.05），且PRP組的Pelletier評(píng)分低于SH組（P＜0.05），見表1。

2 自體PRP對(duì)兔軟骨組織形態(tài)的影響

假手術(shù)組的軟骨細(xì)胞排列整齊、潮線完整清晰，基質(zhì)染色均勻；模型組的軟骨組織不清晰，軟骨層變薄，細(xì)胞紊亂排列，數(shù)量減少，潮線模糊；經(jīng)SH或PRP治療后軟骨細(xì)胞數(shù)量增多，軟骨組織、細(xì)胞形態(tài)接近正常，見圖2。

與假手術(shù)組相比，模型組的Mankin評(píng)分顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，SH 組和 PRP組的Mankin評(píng)分顯著降低（P＜0.05），且PRP組的Mankin評(píng)分低于SH組（P＜0.05），見表1。

3 自體PRP對(duì)骨關(guān)節(jié)炎模型兔軟骨細(xì)胞凋亡的影響

與假手術(shù)組相比，模型組的細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，SH組和PRP組的細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），且PRP組的細(xì)胞凋亡率低于SH組（P＜0.05），見圖3、表1。

4 自體PRP對(duì)兔軟骨組織NLRP3/IL-1β通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Figure 2.HE staining was used to observe the pathomorphological changes of cartilage in rabbits（×200）.圖2 HE染色觀察兔軟骨組織病理形態(tài)學(xué)變化

與假手術(shù)組相比，模型組NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β的蛋白陽性表達(dá)率顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，SH和PRP組的NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β蛋白陽性表達(dá)率顯著降低（P＜0.05），且PRP組NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β的蛋白陽性表達(dá)率低于SH組（P＜0.05），見圖4、表2。

Figure 3.The apoptosis of rabbit chondrocytes observed by TUNEL staining（×200）.圖3 TUNEL染色觀察兔軟骨細(xì)胞凋亡情況

表1 各組兔軟骨Pelletier評(píng)分、Mankin評(píng)分和軟骨細(xì)胞凋亡率的比較Table 1.Comparison of Pelletier scores，Mankin scores and chondrocyte apoptotic rates in the rabbits with different treatments（Mean±SD.n=6）

5 自體PRP對(duì)兔軟骨組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

以陰性對(duì)照組為參考，定量描述各組蛋白表達(dá)水平，與假手術(shù)組相比，模型組的caspase-3和Bax蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，SH和PRP組的caspase-3和Bax蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著升高（P＜0.05），且PRP組的 caspase-3和Bax蛋白表達(dá)低于SH組（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)高于SH組（P＜0.05），見圖5、表3。

6 NLRP3調(diào)控IL-1β的水平

Figure 4.The protein expression of NLRP3，ASC，caspase-1 and IL-1β in the cartilage tissues detected by immunohistochemical staining（×200）.圖4 免疫組化法檢測(cè)軟骨組織中NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β蛋白表達(dá)

表2 各組NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β蛋白的表達(dá)Table 2.The protein expression of NLRP3，ASC，caspase-1 and IL-1β in each group（Mean±SD.n=6）

Figure 5.The protein expression of caspase-3，Bax and Bcl-2 in cartilage tissues detected by Western blot.圖5 Western blot法檢測(cè)軟骨組織中caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，MCC950組NLRP3和 IL-1β的水平顯著降低（P＜0.05），eucalyptol組NLRP3的水平無明顯變化（P＞0.05），IL-1β的水平則顯著降低（P＜0.05），見表4。

討 論

骨關(guān)節(jié)炎屬于慢性退行關(guān)節(jié)疾病，病理特征主要為關(guān)節(jié)軟骨變性、軟骨下骨硬化等，臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、活動(dòng)受限等，病情嚴(yán)重者造成殘疾[9-10]。本研究采取改良Hulth法切除兔膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶、內(nèi)側(cè)半月板等造成關(guān)節(jié)力學(xué)失穩(wěn)，引發(fā)膝骨關(guān)節(jié)炎，這一過程與臨床骨關(guān)節(jié)炎機(jī)理相似，結(jié)果顯示模型組兔軟骨表面不平整，關(guān)節(jié)失去正常光澤，軟骨組織呈片狀剝落，Pelletier評(píng)分顯著高于假手術(shù)組，病理檢測(cè)發(fā)現(xiàn)軟骨層變薄，細(xì)胞紊亂排列，數(shù)量減少，潮線模糊，Mankin評(píng)分顯著高于假手術(shù)組，表明兔軟骨組織受到損傷，與以往膝關(guān)節(jié)動(dòng)物模型制備結(jié)果相似[11]，提示兔骨關(guān)節(jié)炎模型制備成功。

PRP是從自身血液中分離的含高濃度血小板的血液制品，其能夠促進(jìn)損傷軟骨修復(fù)，在臨床上的應(yīng)用逐漸開展起來。研究發(fā)現(xiàn)膝骨關(guān)節(jié)炎患者經(jīng)PRP治療能夠明顯改善膝關(guān)節(jié)功能，減輕患者疼痛，其治療有效率明顯優(yōu)于SH[12]。動(dòng)物研究顯示骨關(guān)節(jié)炎兔經(jīng)關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射PRP能夠明顯提高軟骨細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)軟骨修復(fù)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎兔經(jīng)SH和PRP治療后軟骨組織得到一定的修復(fù)，且Pelletier評(píng)分和Mankin評(píng)分明顯降低，PRP組Pelletier評(píng)分和Mankin評(píng)分顯著低于SH組，提示PRP能夠緩解骨關(guān)節(jié)炎軟骨損傷，促進(jìn)軟骨修復(fù)，效果優(yōu)于SH，然而其具體機(jī)制尚不清楚。

表3 各組caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白的水平Table 3.The protein levels of caspase-3，Bax and Bcl-2 in each group determined by Western blot（Mean±SD.n=6）

表4 各組NLRP3和IL-1β水平的變化Table 4.The protein levels of NLRP3 and IL-1β in each group（μg/L.Mean±SD.n=6）

NLPR3屬于NLRs家族重要成員，當(dāng)受到危險(xiǎn)信號(hào)刺激后能夠激活NLRP3蛋白，進(jìn)而招募ASC和caspase-1組裝為NLRP3炎性小體，活化IL-1β前體，使其成為成熟IL-1β，分泌至胞外，發(fā)揮炎癥效應(yīng)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，MCC950組NLRP3和IL-1β表達(dá)降低，eucalyptol組NLRP3表達(dá)無明顯變化，IL-1β表達(dá)顯著降低，提示NLPR3調(diào)控IL-1β表達(dá)，參與炎癥反應(yīng)。過往研究顯示NLPR3炎性小體的活化與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生密切相關(guān)[15]。Fioravanti等[16]研究發(fā)現(xiàn)在骨關(guān)節(jié)炎患者血清檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)NLPR3和IL-1β水平明顯升高，且與關(guān)節(jié)腫脹度呈正相關(guān)。Zhao等[17]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中NLPR3、IL-1β蛋白表達(dá)明顯升高，推測(cè)NLPR3炎癥小體可能是骨關(guān)節(jié)炎新的治療靶點(diǎn)。Sun等[18]研究證明姜黃素通過抑制炎癥通路NLRP3激活降低炎癥細(xì)胞因子表達(dá)從而發(fā)揮對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β蛋白陽性表達(dá)率顯著升高；給予SH或PRP治療后，通路蛋白陽性表達(dá)率均降低，且PRP組蛋白陽性表達(dá)率低于SH組，推測(cè)NLRP3信號(hào)通路參與兔骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程，且富血小板可能通過抑制NLRP3信號(hào)通路的活化，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)關(guān)節(jié)炎模型兔關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)作用。

細(xì)胞凋亡在骨關(guān)節(jié)炎軟骨損傷中起著支配性作用。細(xì)胞凋亡處于正常生理進(jìn)程，然而過度凋亡屬于病理性。軟骨細(xì)胞凋亡過程受到凋亡相關(guān)蛋白的控制，例如：Bcl-2屬于抗凋亡蛋白，能夠抵抗多種因素引發(fā)的細(xì)胞凋亡；Bax為凋亡誘導(dǎo)因子，與Bcl-2呈拮抗作用，參與細(xì)胞凋亡[19]；caspase-3為細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，在接收到細(xì)胞凋亡信號(hào)刺激后，使其發(fā)生裂解活化，進(jìn)而使細(xì)胞程序性凋亡[20]。本研究發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組相比，模型組軟骨組織細(xì)胞凋亡率明顯升高，而給予PRP干預(yù)后細(xì)胞凋亡率明顯降低；進(jìn)一步對(duì)凋亡相關(guān)蛋白檢測(cè)發(fā)現(xiàn)模型組caspase-3、Bax蛋白表達(dá)明顯升高，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低，PRP干預(yù)后，細(xì)胞caspase-3、Bax蛋白表達(dá)明顯降低，Bcl-2蛋白表達(dá)升高，提示PRP可通過抑制軟骨組織細(xì)胞凋亡進(jìn)而緩解軟骨組織損傷，發(fā)揮對(duì)節(jié)炎模型兔骨關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)作用。

綜上所述，PRP能夠促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎兔受損軟骨的修復(fù)，其機(jī)制可能與抑制NLPR3/IL-1β信號(hào)通路并減少軟骨細(xì)胞凋亡有關(guān)。然而PRP僅能緩解軟骨組織損傷而不能完全逆轉(zhuǎn)，這可能與作用劑量有關(guān)，后續(xù)仍需完善設(shè)計(jì)方案，進(jìn)一步充分論證PRP對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的修復(fù)作用。