桑寄生提取物聯(lián)合miR-375對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞活力和凋亡的影響*

卓澤銘，范忠誠(chéng)，郭 祥

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院骨科，海南?？?70208）

骨關(guān)節(jié)炎是一種以關(guān)節(jié)軟骨退化、滑膜炎癥、軟骨下骨增厚和骨贅形成為特征的慢性退行性關(guān)節(jié)疾病，是與關(guān)節(jié)創(chuàng)傷和衰老相關(guān)的最常見(jiàn)的關(guān)節(jié)疾病[1]。目前，骨關(guān)節(jié)炎藥物治療方案仍然有限，非藥物治療方案亦未得到充分利用[2]。因此，迫切需要擴(kuò)大研究，以便更充分地探索基于骨關(guān)節(jié)炎機(jī)制的疼痛管理策略。桑寄生（Herba Taxilli，Sangjisheng，SJS）是桑寄生科植物桑寄生[Taxillus chinensis（DC.）Danser]的干燥帶葉莖枝，具有祛風(fēng)濕、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、安胎元的功能，用于風(fēng)濕痹痛、腰膝酸軟、筋骨無(wú)力、崩漏經(jīng)多、妊娠漏血、胎動(dòng)不安、頭暈?zāi)垦５萚3]。研究發(fā)現(xiàn)，桑寄生水提物具有良好的抗炎活性[4]，桑寄生總黃酮對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠足趾腫脹程度及全身癥狀具有明顯改善作用，顯現(xiàn)出明顯的祛風(fēng)濕作用[5]。但桑寄生對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞生物行為的影響及其機(jī)制目前還少有研究。微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是一類高度保守的內(nèi)源性非編碼RNA，參與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展過(guò)程[6]。有研究對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨組織miRNA表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-375在骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織中高表達(dá)[7]，并發(fā)現(xiàn)miR-375在病變組軟骨祖細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)[8]。miR-375對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的影響目前尚不明確。基于此，本研究體外培養(yǎng)人原代骨性關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞RPOC，觀察桑寄生提取物對(duì)白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的影響，并結(jié)合miR-375對(duì)其潛在的作用機(jī)制進(jìn)行初步探索。

材料和方法

1 主要試劑

桑寄生購(gòu)自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院；IL-1β和MTT購(gòu)自Sigma-Aldrich；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco；RIPA裂解液購(gòu)自Solarbio；抗細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）抗體、抗P21抗體、抗Bcl-2抗體、抗Bax抗體、抗caspase-3抗體和抗GAPDH抗體購(gòu)自Cellular Signaling Technology；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記Ⅱ抗購(gòu)自北京中杉金橋公司；異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)素Ⅴ/碘化丙啶（annexinⅤ-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide，annexin Ⅴ-FITC/PI）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物公司；Trizol和Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qPCR）相關(guān)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自TaKaRa；anti-miR-375、miR-375及各自陰性對(duì)照購(gòu)自GenePharma。

2 方法

2.1 桑寄生提取物的制備 桑寄生提取物的制備參照管俊[9]的方法進(jìn)行，即桑寄生藥材粉末用70%的乙醇以1∶20的料液比，在80℃條件下提取1.5 h，重復(fù)2次。合并2次濾液，濃縮干燥即得桑寄生提取物。

2.2 細(xì)胞分離、培養(yǎng)與分組 收集本院因下肢損毀性創(chuàng)傷（無(wú)骨關(guān)節(jié)炎病史）而進(jìn)行全膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)的廢棄組織標(biāo)本，并經(jīng)患者或其家屬的知情同意，參照張慶等[10]的方法進(jìn)行人原代骨性關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞RPOC的分離。對(duì)RPOC鑒定后發(fā)現(xiàn)，與文獻(xiàn)[10]所述一致，即細(xì)胞形態(tài)多呈圓形、橢圓形或短梭形，含豐富的胞漿，圓形胞核，核仁1～3個(gè)，呈“笑臉狀”，散狀生長(zhǎng)，部分細(xì)胞融合生長(zhǎng)。將分離的RPOC置于含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將第2代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的RPOC分為對(duì)照組（control組，細(xì)胞不用IL-1β處理），模型組（IL-1β組，10 μg/L IL-1β處理細(xì)胞[11]），SJS低劑量給藥組（IL-1β+SJS-L組，10 μg/L IL-1β和0.09 g/L桑寄生提取物處理細(xì)胞），SJS中劑量給藥組（IL-1β+SJS-M組，10 μg/L IL-1β和0.18 g/L桑寄生提取物處理細(xì)胞），高劑量給藥組（IL-1β+SJSH組，10 μg/L IL-1β和0.36 g/L桑寄生提取物處理細(xì)胞）。

2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 將RPOC密度調(diào)整為1×107/L，并接種于96孔板，培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后加入MTT溶液100 μL，37℃反應(yīng)4 h，加入二甲基亞砜200 μL，37℃劇烈振蕩培養(yǎng)10 min，于酶標(biāo)儀檢測(cè)RPOC 490 nm下的吸光度（A）值。

2.4 Western blot檢測(cè) cyclin D1、P21、Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白的表達(dá) 利用RIPA裂解液提取RPOC中總蛋白，進(jìn)行10%SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，室溫下用5%脫脂奶粉溶液封閉1 h，加入1∶1 000稀釋的抗cyclin D1、P21、Bcl-2、Bax和caspase-3抗體，4℃孵育過(guò)夜。次日，TBST充分洗滌，加入II抗，孵育2 h，化學(xué)發(fā)光液顯色顯影，以GAPDH作為內(nèi)參照，分析cyclin D1、P21、Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表達(dá)。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞凋亡的檢測(cè)參照Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行操作。收集RPOC 5×105個(gè)，懸浮后依次加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，混勻后室溫避光反應(yīng)15 min，進(jìn)行流式細(xì)胞儀的檢測(cè)。

2.6 qPCR檢測(cè)miR-375的表達(dá) 利用Trizol試劑提取RPOC總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行qPCR反應(yīng)。miR-375的正向引物序列為5'-GGCTCTAGAGGGGACGAAGC-3'，反向引物序列為 5'-GGCAAGCTTTTTCCACACCTCAGCCTTG-3'；內(nèi)參照U6的正向引物序列為5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，反向引物序列為5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。 通 過(guò) 2-ΔΔCt法計(jì)算miR-375表達(dá)。

2.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染前24 h，將RPOC接種于6孔板。待細(xì)胞密度達(dá)約70%，利用Lipofectamine 2000試劑在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染anti-miR-NC、anti-miR-375、miR-NC和miR-375。其中，轉(zhuǎn)染anti-miR-NC、antimiR-375的細(xì)胞使用10 μg/L IL-1β進(jìn)行處理，轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-375的細(xì)胞使用10 μg/L IL-1β和0.36 g/L桑寄生提取物處理。收集轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，按照上述方法檢測(cè)細(xì)胞活力、凋亡、miR-375、cyclin D1、P21、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）。兩組間數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析，組間多重比較使用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 桑寄生對(duì)IL-1β作用的RPOC活力的影響

MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，與control組比較，IL-1β組24 h、48 h和72 h的RPOC活力明顯降低（P＜0.05）；與IL-1β組比較，IL-1β+SJS-L組在24 h、48 h和72 h的RPOC細(xì)胞活力無(wú)顯著變化，IL-1β+SJS-M組和IL-1β+SJS-H組在24 h、48 h和72 h的RPOC細(xì)胞活力較IL-1β組顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)表1。因此選用作用較為明顯的桑寄生提取物濃度0.36 g/L即SJS-H做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Western blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與control組比較，IL-1β組RPOC中cyclin D1的表達(dá)量明顯減少，P21的表達(dá)量顯著增加（P＜0.05）；與IL-1β組比較，IL-1β+SJS-L組RPOC中cyclin D1和P21蛋白水平無(wú)明顯變化，IL-1β+SJS-M組和IL-1β+SJS-H組cyclin D1的表達(dá)量顯著增加，P21的蛋白水平明顯降低（P＜0.05），見(jiàn)圖1、表1。

Figure 1.The effect of SJS on the expression of proliferation related-proteins in RPOC treated with IL-1β.圖1 桑寄生對(duì)IL-1β作用的RPOC增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表1 桑寄生對(duì)IL-1β作用下的RPOC中cyclin D1和P21蛋白表達(dá)及細(xì)胞活力的影響Table 1.Effects of SJS on cyclin D1 and p21 protein expression and cell viability of RPOC stimulated with IL-1β（Mean±SD.n=9）

2 桑寄生對(duì)IL-1β作用的RPOC凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，與control組比較，IL-1β組RPOC的凋亡率明顯增加（P＜0.05）；與IL-1β組比較，IL-1β+SJS-H組RPOC的凋亡率顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖2A、表2。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與control組比較，IL-1β組RPOC的Bcl-2蛋白表達(dá)量明顯減少，Bax和caspase-3蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；與IL-1β組比較，IL-1β+SJS-H組RPOC的Bcl-2蛋白表達(dá)量明顯增加，Bax和caspase-3蛋白水平顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖2B、表2。

Figure 2.The effect of SJS on the apoptosis of RPOC treated with IL-1β.A：the images of flow cytometry for analyzing the effect of SJS on the apoptosis of RPOC treated with IL-1β；B：the images of Western blot for determining the effect of SJS on the expression of apoptotic proteins in the RPOC treated with IL-1β.圖2 桑寄生對(duì)IL-1β作用的RPOC凋亡的影響

表2 桑寄生對(duì)IL-1β作用的RPOC中miR-375表達(dá)水平和凋亡的影響Table 2.The effect of SJS on miR-375 expression and apoptosis of RPOC induced by IL-1β（Mean±SD.n=9）

3 桑寄生對(duì)IL-1β作用的RPOC中miR-375表達(dá)的影響

qPCR數(shù)據(jù)顯示，與control組比較，IL-1β組RPOC中miR-375的表達(dá)量明顯增加（P＜0.05）；與IL-1β組比較，IL-1β+SJS-H組RPOC內(nèi)miR-375的表達(dá)量顯著減少（P＜0.05），見(jiàn)表2。

4 抑制miR-375對(duì)IL-1β作用的RPOC活力、增殖相關(guān)蛋白表達(dá)和凋亡的影響

與IL-1β+anti-miR-NC組比較，IL-1β+anti-miR-375組RPOC中miR-375表達(dá)量明顯減少（P＜0.05），cyclin D1和Bcl-2蛋白水平顯著升高，而P21、Bax和caspase-3蛋白的水平明顯減少（P＜0.05），24 h、48 h和72 h的細(xì)胞活力明顯升高（P＜0.05），并且細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖3及表3～4。

Figure 3.The effect of miR-375 on the apoptosis of the RPOC and the expression of cyclin D1，P21 and apoptosis-related proteins in the RPOC.A：effect of anti-miR-375 on the apoptosis of RPOC treated with IL-1β；B：effect of anti-miR-375 on the protein levels of cyclin D1，P21 and apoptosis-related proteins in the RPOC treated with IL-1β.圖3 抑制miR-375對(duì)IL-1β作用的RPOC凋亡及其中cyclin D1、P21和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表3 抑制miR-375對(duì)IL-1β作用的RPOC活力及增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Table 3.The effect of anti-miR-375 on the viability and prroliferation-related protein expression of RPOC treated with IL-1β（Mean±SD.n=9）

表4 抑制miR-375對(duì)IL-1β作用的RPOC凋亡的影響Table 4.Inhibitory effect of anti-miR-375 on the apoptosis of RPOC induced by IL-1β（Mean±SD.n=9）

5 過(guò)表達(dá)miR-375能逆轉(zhuǎn)桑寄生對(duì)IL-1β作用的RPOC活力和增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與IL-1β組比較，IL-1β+SJS-H組RPOC中miR-375和P21的表達(dá)量明顯減少，cyclin D1蛋白水平及24 h、48 h和72 h的細(xì)胞活力顯著升高（P＜0.05）；與IL-1β+SJS-H+miR-NC組比較，IL-1β+SJS-H+miR-375組miR-375和P21的表達(dá)量明顯增加，cyclin D1蛋白水平及24 h、48 h和72 h的細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖4、表5。

6 過(guò)表達(dá)miR-375能逆轉(zhuǎn)桑寄生對(duì)IL-1β作用的RPOC凋亡的作用

與IL-1β組比較，IL-1β+SJS-H組RPOC中Bax和caspase-3的蛋白水平及凋亡率明顯減少，Bcl-2蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；與IL-1β+SJS-H+miR-NC組比較，IL-1β+SJS-H+miR-375組RPOC中Bax和cas

pase-3的蛋白水平及凋亡率明顯增加，Bcl-2蛋白水平顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖5、表6。

Figure 4.Over-expression of miR-375 reversed the effect of SJS on the expression of cyclin D1 and P21 in the RPOC treated with IL-1β.圖4 過(guò)表達(dá)miR-375能逆轉(zhuǎn)桑寄生對(duì)IL-1β作用的RPOC中cyclin D1和P21蛋白表達(dá)的影響

表5 過(guò)表達(dá)miR-375能逆轉(zhuǎn)桑寄生對(duì)IL-1β作用的RPOC活力的作用Table 5.Over-expression of miR-375 reversed the effect of SJS on the viability of RPOC induced by IL-1β（Mean±SD.n=9）

討 論

Figure 5.Over-expression of miR-375 reversed the effect of SJS on the apoptosis of and the protein levels of apoptotic molecules in RPOC stimulated with IL-1β.圖5 過(guò)表達(dá)miR-375能逆轉(zhuǎn)桑寄生對(duì)IL-1β作用的RPOC凋亡及凋亡蛋白水平的影響

骨關(guān)節(jié)炎是一種慢性退行性疾病[12]，與年齡、性別和遺傳因素相關(guān)的代謝和炎癥因子通過(guò)破壞關(guān)節(jié)軟骨，進(jìn)而導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎。目前已確定多種導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展的因素，包括參與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制的蛋白水解酶和炎性細(xì)胞因子[13]。在骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展中，促炎細(xì)胞因子IL-1β通過(guò)刺激軟骨退化和觸發(fā)滑膜炎癥發(fā)揮關(guān)鍵的作用[14]。IL-1β作用于軟骨細(xì)胞后，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞活力的降低和細(xì)胞凋亡的增加[15]。本研究采用IL-1β處理人原代骨性關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞RPOC，構(gòu)建骨關(guān)節(jié)炎模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組的RPOC比較，IL-1β處理明顯降低24 h、48 h和72 h的細(xì)胞活力及cyclin D1、Bcl-2蛋白表達(dá)，并提高細(xì)胞凋亡率及P21、Bax和caspase-3的蛋白水平，與前人結(jié)果相符。本研究還對(duì)桑寄生作用于IL-1β處理的RPOC影響上述指標(biāo)的機(jī)制進(jìn)行了探索。

桑寄生是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，含有黃酮類、揮發(fā)油類、維生素等化學(xué)成分，現(xiàn)代藥理研究表明，桑寄生具有抗炎、抗腫瘤、降血壓、降血脂、降血糖和抗氧化等活性[16]。研究表明，桑寄生浸膏對(duì)二甲苯刺激的小鼠耳腫脹具有明顯的緩解作用，并加速消退，效果與阿司匹林相當(dāng)[17]。由桑寄生、熟地等藥材制成的熟地寄生壯骨方具有顯著的抗炎作用，可以有效改善大鼠膝關(guān)節(jié)腫脹度，并抑制IL-1和IL-6水平[18]。本研究中，IL-1β抑制RPOC增殖并誘導(dǎo)凋亡，而使用桑寄生提取物后，IL-1β作用的軟骨細(xì)胞RPOC的活力和凋亡情況與IL-1β組相反，即桑寄生提取物顯著提高細(xì)胞活力、cyclin D1、Bcl-2蛋白表達(dá)，降低細(xì)胞凋亡率、P21、Bax、caspase-3蛋白的水平（P＜0.05），顯示出對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)的qPCR數(shù)據(jù)顯示，IL-1β使RPOC中miR-375表達(dá)量明顯增加，而加入桑寄生提取物后，miR-375表達(dá)量顯著減少，提示桑寄生保護(hù)IL-1β刺激的軟骨細(xì)胞與可能調(diào)控miR-375表達(dá)有關(guān)。miRNA是一類由22～25個(gè)核苷酸組成的非編碼RNA分子，它通過(guò)促進(jìn)降解、抑制翻譯或其它機(jī)制，成為基因表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子[19]。已有證據(jù)表明，miRNA，如miR-34a和miR-181a[20]參與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。miR-375作為一種潛在的腫瘤抑制基因，已被證實(shí)在多種人類惡性腫瘤包括乳腺癌[21]、肺腺癌[22]和骨肉瘤[23]中下調(diào)。miR-375-3p及其靶點(diǎn)可能作為骨質(zhì)疏松癥診斷的生物標(biāo)志物，也可能作為骨質(zhì)疏松癥治療的新型藥物[24]。但miR-375對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的影響尚未明確。本研究發(fā)現(xiàn)抑制miR-375顯著減少IL-1β作用的RPOC中miR-375和P21、Bax、caspase-3蛋白的水平及細(xì)胞凋亡率，明顯提高cyclin D1、Bcl-2蛋白水平、細(xì)胞活力。過(guò)表達(dá)miR-375能逆轉(zhuǎn)桑寄生對(duì)IL-1β作用的RPOC活力的促進(jìn)作用和對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用，提示桑寄生促進(jìn)IL-1β誘導(dǎo)的RPOC生長(zhǎng)并抑制其凋亡可能與調(diào)控miR-375表達(dá)有關(guān)。

表6 過(guò)表達(dá)miR-375能逆轉(zhuǎn)桑寄生對(duì)IL-1β作用的RPOC凋亡的作用Table 6.Over-expression of miR-375 reversed the effect of SJS on the apoptosis of RPOC treated with IL-1β（Mean±SD.n=9）

總之，桑寄生提取物可以促進(jìn)IL-1β作用的人原代骨性關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的活力，并抑制細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制與調(diào)控miR-375表達(dá)有關(guān)。這一結(jié)果為骨關(guān)節(jié)炎的治療提供了新的線索和潛在的靶點(diǎn)。