高壓氧通過激活CREB/BDNF信號通路減輕阿爾茨海默病小鼠海馬神經元突觸損傷*

尹傳紅，閆宇輝

（1大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院高壓氧科，2遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，遼寧大連116600）

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）是發(fā)生在老年期或老年前期的一種中樞神經系統(tǒng)退行性疾病，以神經細胞內神經纖維纏結（nerve fiber tangles，NFT）、細胞外老年斑（senile plaques，SP）以及大量神經元丟失、突觸損傷為主要病理特征[1]，患者臨床癥狀主要表現為學習與記憶能力障礙等[2]。隨著我國老年人口化速度加快，導致AD的發(fā)病率也逐年增加，嚴重影響患者及其家人的生活質量。國內外現有治療AD的藥物雖能部分緩解癥狀，但無法補充腦內丟失的神經元，改善突觸功能。因此，尋找并建立能促進腦內神經元功能重建的新方法，對治療AD等神經退行性疾病具有重要意義。

環(huán)磷酸腺苷反應元件結合蛋白（CAMP response element binding protein，CREB）/腦源性神經營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）信號通路在神經元保護與再生、突觸形成及學習記憶改善等方面都發(fā)揮著重要的調節(jié)作用，通過激活CREB/BDNF信號通路能夠抑制AD病理微環(huán)境對小鼠海馬神經元的損傷，發(fā)揮神經保護作用[3]。

高壓氧（hyperbaric oxygen，HBO）是指在超過一個大氣壓的環(huán)境下，呼吸的氧分壓大于1.0絕對大氣壓。HBO具有改善腦組織功能的作用，目前受到越來越多的關注[4]。HBO能夠增加機體含氧量，進而有效提高腦組織氧分壓和微循環(huán)血流動力，改善神經細胞缺氧缺血狀態(tài)和血液供應，從而促進神經組織功能恢復[5]。研究表明，HBO能夠通過提高機體抗自由基損傷能力來改善AD小鼠的學習記憶功能，但是其對AD小鼠海馬神經元突觸功能的影響未進行研究[6]，并且CREB/BDNF信號通路與HBO改善AD小鼠學習記憶能力的相關性尚未見文獻報道。因此，本項工作應用APP/PS1轉基因（trangenic，TG）小鼠作為AD模型小鼠，重點探討HBO對其學習記憶能力和海馬區(qū)神經元突觸功能的改善作用與CREB/BDNF信號通路的關系。

材料和方法

1 動物、試劑與設備

1.1 動物 SPF級6月齡雄性野生型（wild-type，WT）C57BL/6小鼠10只，體重（28.0±2.0）g，購自遼寧長生生物有限公司，動物合格證號為SCXK（遼）2015-0001。SPF級6月齡雄性APP/PS1TG小鼠30只，體重（27.0±2.5）g，購自北京中科澤晟生物技術有限公司，動物合格證號為SCXK（京）2013-0001。小鼠分籠飼養(yǎng)，室溫維持在20～25℃，每日12 h光照維持晝夜循環(huán)。

1.2 試劑 CREB抑制劑H89購自Sigma；尼氏染色試劑盒購自碧云天生物有限公司；兔抗β-actin抗體購自北京博奧森生物有限公司；CREB、BDNF和GAPDH引物購自上海生工生物技術有限公司；PCR逆轉錄試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；兔抗突觸素（synapsin，SYN）、突觸后致密區(qū)蛋白95（postsynaptic density protein 95，PSD95）、生長相關蛋白 43（growth-associated protein 43，GAP43）、CREB、p-CREB和BDNF抗體購自Abcam；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物有限公司；DAB顯色試劑盒購自大連美侖生物有限公司；其余試劑均為國產分析純。

1.3 儀器設備 實驗動物高壓氧艙購自煙臺宏遠氧業(yè)集團公司；Ti-S型倒置熒光顯微鏡購自Nikon；Morris水迷宮儀購自成都儀器廠；石蠟切片機購自Lecia；real-time PCR儀購自ABI；水平核酸電泳儀和濕電蛋白轉膜儀購自Bio-Rad。

2 實驗方法

2.1 動物分組及治療方法 小鼠在適應性飼養(yǎng)1周后，APP/PS1TG小鼠按照隨機數字表法隨機分為TG組、HBO組及H89組，另取同齡WT C57BL/6小鼠作為陰性對照組（WT組），每組10只小鼠。HBO及H89組小鼠進行高壓氧治療。每日上午將小鼠放入動物高壓氧艙，高壓氧艙事先利用純氧洗艙3次后，加壓到0.25 MPa（2.5 ATA），進行純氧治療，每次持續(xù)1 h，隨后緩慢減壓，動物出艙，每天1次，5 d為一個療程，暫停2 d進入下一個療程，小鼠共進行6個療程的治療[7]。H89組小鼠于HBO治療前1 h給予H89（2 μg/L）側腦室注射，每次 5 μL，隔天注射 1次[8]。WT及TG組小鼠放入動物高壓氧艙但是不予以治療。

2.2 Morris水迷宮 水迷宮設備為一個圓形游泳池（直徑1.6 m，高60 cm）和浸沒式平臺（直徑10 cm，距離表面2 cm）位于游泳池的固定位置。水溫設定在（23±1）℃。前5 d進行逃避潛伏期實驗，連續(xù)5 d每天4個象限，每個象限1次。設備自動記錄小鼠找到隱匿平臺的時間，上平臺后保持15 s后從平臺上取出小鼠。若60 s小鼠未找到平臺，引導小鼠上平臺，并保持15 s。記錄到達隱藏平臺時間和到達平臺前的游泳距離和速度。5 d訓練后取出平臺，讓小鼠自由游泳90 s記錄游過平臺的次數及小鼠處在原平臺象限的時間，根據所得到數據來比較各組小鼠的空間記憶能力。

2.3 筑巢實驗 將小鼠單籠飼養(yǎng)，并在鼠籠內部放入墊料。每個鼠籠內放入8張5 cm×5 cm的棉花墊，每個鼠籠放置的位置一致并做好記錄。第3天早上觀察各組小鼠的筑巢情況并拍照。按照文獻報道的方法判斷每只小鼠的筑巢分數[9]。

2.4 腦組織取材 筑巢實驗結束后第2天，給小鼠腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥鈉進行麻醉，待麻醉后將其置于手術臺上，利用預冷的生理鹽水進行灌流后快速將整個大腦取出。將腦組織沿矢狀縫切開，左半腦置于30%蔗糖溶液中脫水，用于制作冰凍切片，進行尼氏染色；而右半腦儲存于-80℃冰箱中，用于real-time PCR及Western blot檢測。

2.5 尼氏染色 將左半腦置于包埋盒中，加入冰凍包埋劑，置于-80℃冰箱中進行速凍24～48 h，隨后利用恒冷切片機對組織進行連續(xù)切片，隔十取一，片厚7 μm。將切片置于梯度乙醇中的順序為：100%乙醇30 s、95%乙醇30 s、70%乙醇30 s，雙蒸水洗滌切片3次；將切片浸入甲酚紫染液中，56℃孵育1 h，雙蒸水洗滌3次；中性分色液2 min，浸入100%乙醇中脫水，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。

2.6 real-time PCR 用TRIzol提取各組小鼠海馬組織總RNA，按RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄生成cDNA；按照qPCR SYBR?Green Master Mix所示構建PCR。相關引物序列見表1。反應條件如下：95℃ 5 min；95℃ 10 s，55℃ 30 s，40個循環(huán)。以GAPDH作為內參照。mRNA的相對表達量用2-ΔΔCt值表示，實驗重復3次。

表1 real-time PCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for real-time PCR

2.7 Western blot 分離小鼠海馬區(qū)腦組織，加入RIPA裂解液后放入手動勻漿器內手動制備腦勻漿。冰上孵育30 min后，3 000×g離心15 min，轉移上清液至離心管中備用。用BCA法測定蛋白質含量，以保證每組樣品上樣量一致。隨后加入蛋白上樣緩沖液，蛋白變性，進行SDS-PAGE，隨后300 mA電流下轉膜1.5 h。將轉膜后的PVDF膜用TBST洗5 min，將PVDF膜移至封閉液中，室溫搖床上搖動封閉1 h，TBST洗膜3次，每次5 min；分別加入I抗（1∶1 000）進行孵育，4℃孵育過夜；次晨，TBST洗膜3次，每次5 min；加入HRP標記的Ⅱ抗（1∶1 000），室溫孵育1 h；TBST洗膜3次，每次5 min；將按照試劑盒配置ECL工作液，滴加ECL工作液到PVDF膜上，放置2 min后棄工作液；用吸水紙吸去過多液體，拍照并用ImageJ軟件分析相對灰度。

3 統(tǒng)計學處理

數據采用GraphPad Prism 6軟件進行分析處理。數據采用均數±標準差（mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩組間比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 HBO對小鼠學習記憶能力的影響

我們利用Morris水迷宮實驗檢測HBO對APP/PS1小鼠的空間位置感和空間定位學習記憶能力的影響，定位航行結果顯示，與WT組相比，TG組小鼠的逃避潛伏期顯著延長（P＜0.05）；與TG組相比，HBO治療后小鼠逃避潛伏期顯著縮短（P＜0.05）；而與HBO組相比，H89組小鼠逃避潛伏期顯著延長（P＜0.05），見圖1A、B。同時，空間探索實驗結果顯示，第6天撤去平臺后，與WT組相比，TG組小鼠穿越原平臺次數顯著減少（P＜0.05），處于原平臺象限時間也顯著縮短（P＜0.05）；與TG組相比，HBO組小鼠穿越原平臺次數顯著增加（P＜0.05），并且處于原平臺象限時間也顯著延長（P＜0.05）；而與HBO組相比，H89組小鼠穿越原平臺次數顯著減少（P＜0.05），處于原平臺象限時間也顯著縮短（P＜0.05），見圖1C、D。

Figure 1.The therapeutic effects of HBO on the cognitive decline of APP/PS1 mice.A：the representative swimming paths in the escape latency experiment on day 5；B：quantitative analysis of the escape latency；C：quantitative analysis of the number of crossing the removed platform；D：quantitative analysis of the time spent in the target quadrant.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs WT group；#P＜0.05 vs TG group；&P＜0.05 vs HBO group.圖1 HBO對APP/PS1小鼠認知功能的影響

2 HBO對小鼠筑巢能力的影響

筑巢實驗結果顯示，WT組小鼠搭建了具有立體感的巢穴，筑巢分數高；TG組小鼠撕咬了部分棉墊，沒有很好地進行筑巢，與WT組相比，筑巢分數顯著降低（P＜0.05）；HBO組小鼠搭建了淺平狀的巢穴，與TG組相比，筑巢分數顯著增加（P＜0.05）；與HBO組相比，H89組小鼠同樣沒有很好地進行筑巢，筑巢分數顯著降低（P＜0.05），見圖2。

3 HBO對小鼠海馬區(qū)尼氏體結構及數量的影響

尼氏染色結果顯示，WT組小鼠海馬區(qū)神經元排列整齊致密，形態(tài)規(guī)則，且神經元內尼氏體充盈，呈虎斑狀或點狀；TG組小鼠海馬區(qū)神經元排列散亂、間隙較大，尼氏體數量較少，染色較淺；HBO組小鼠海馬區(qū)神經元形態(tài)有所改善，排列較為整齊，尼氏體數量增多，染色加深，而H89組海馬區(qū)神經元與TG組類似，尼氏體數量減少，排列較為散亂，見圖3。

4 HBO對小鼠海馬區(qū)突觸相關蛋白SYN、PSD95及GAP43蛋白表達的影響

Western blot結果顯示，與WT組相比，TG組小鼠海馬區(qū)SYN、PSD95及GAP43蛋白表達顯著減少（P＜0.05）；而與TG組相比，HBO組小鼠海馬區(qū)SYN、PSD95及GAP43蛋白表達顯著增加（P＜0.05）；而與HBO組相比，H89組SYN、PSD95及GAP43蛋白表達顯著降低（P＜0.05），見圖4。

Figure 2.Comparison of the nesting ability of the mice in each group.A：representative images of mice nesting at 0 and 3 d；B：quantitative analysis of nesting score.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs WT group；#P＜0.05 vs TG group；&P＜0.05 vs HBO group.圖2 各組小鼠筑巢能力的比較

Figure 3.Comparison of Nissl body structure and quantity of neurons in the hippocampus of the mice in each group.圖3 各組小鼠海馬的尼氏體結構和神經元數量的比較

Figure 4.Comparison of SYN，PSD95 and GAP43 protein expression in the hippocampus of the mice in each group.Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs WT group；#P＜0.05 vs TG group；&P＜0.05 vs HBO group.圖4 各組小鼠海馬區(qū)SYN、PSD95和GAP43的蛋白表達

5 HBO對小鼠海馬區(qū)CREB及BDNF mRNA表達的影響

real-time PCR結果顯示，與WT組相比，TG組小鼠海馬區(qū)CREB及BDNF mRNA相對表達量顯著減少（P＜0.05）；與TG組相比，HBO治療后小鼠海馬區(qū)CREB及BDNF mRNA相對表達量顯著增加（P＜0.05）；而H89組小鼠海馬區(qū)CREB及BDNF mRNA相對表達量與HBO組相比顯著減少（P＜0.05），見圖5。

6 HBO對小鼠海馬區(qū)CREB、p-CREB及BDNF蛋白水平的影響

Figure 5.Comparison of relative mRNA expression of CREB and BDNF in the hippocampus of the mice in each group.Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs WT group；#P＜0.05 vs TG group；&P＜0.05 vs HBO group.圖5 比較各組小鼠海馬區(qū)CREB和BDNF mRNA的相對表達量

Western blot結果顯示，與WT組相比，TG組小鼠海馬區(qū)p-CREB及BDNF蛋白水平顯著降低（P＜0.05）；而與TG組相比，HBO組小鼠海馬區(qū)p-CREB及BDNF蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；與HBO組相比，H89組p-CREB及BDNF蛋白水平顯著降低（P＜0.05）；CREB蛋白表達水平在各組之間無顯著性差異（P＞0.05），見圖6。

Figure 6.Comparison of CREB，p-CREB and BDNF protein levels in the hippocampus of the mice in each group.Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs WT group；#P＜0.05 vs TG group；&P＜0.05 vs HBO group.圖6 比較各組小鼠海馬中CREB、p-CREB和BDNF的蛋白水平

討 論

AD是一種中樞神經系統(tǒng)退行性疾病，目前公認的AD的發(fā)病機制有淀粉樣蛋白沉積、氧化應激和炎癥反應等假說。研究表明，AD患者腦內海馬區(qū)域病理特征相關蛋白及信號通路改變會造成記憶損害[9]。CREB是真核生物細胞核內的調控因子，與神經元的生長、損傷、再生、突觸可塑性及學習與記憶能力密切相關。CREB對神經元功能的調控作用依賴于Ser133位點的磷酸化，能促進CRE序列的轉錄，并調節(jié)其下游與學習記憶能力相關的靶基因的轉錄。BDNF作為其下游靶基因，其基因啟動子區(qū)域含有CRE序列，受p-CREB的調控。BDNF作為一種神經營養(yǎng)因子，參與一系列細胞內信號傳導過程，對神經元、軸突和樹突形態(tài)以及突觸可塑性具有保護作用[10]。研究顯示，AD患者腦內p-CREB及BDNF表達均顯著降低，從而造成神經元再生障礙、突觸損傷及學習與記憶能力損害等[11-12]。目前很多藥物都能夠作用于CREB及BDNF，旨在上調p-CREB及BDNF表達來減輕神經元及突觸損傷，從而改善學習與記憶能力，例如黃酮類化合物山奈素可通過減輕AD小鼠腦內氧化應激反應并激活CREB/TrkB/BDNF信號通路發(fā)揮神經保護作用[13]；丁苯酸鈉能夠通過增加p-CREB、BDNF及NT-3表達，改善AD小鼠海馬神經元突觸功能和可塑性，從而減輕記憶損害[14]。但是上述藥物只是在動物及細胞水平上證明了其有效性，距離臨床試驗甚至上市銷售還有相當遠的路要走。而HBO作為臨床上一種重要的治療手段，其作用機制多樣，具有升高血液含氧量，緩解氧化應激狀態(tài)，抑制炎癥反應，促進神經再生，促進Aβ蛋白降解等抗AD樣作用[15]。本研究顯示HBO治療后能夠顯著改善APP/PS1小鼠的學習記憶能力，接近于WT小鼠的學習與記憶能力。筑巢結果顯示HBO治療后的小鼠筑巢能力增強，評分增加，以上說明了HBO能夠改善海馬及前腦皮質的功能，提高APP/PS1小鼠的學習記憶能力及智力水平。此外，尼氏染色結果顯示TG組小鼠海馬區(qū)尼氏體排列稀疏、數量減少，而HBO治療后，海馬區(qū)尼氏體排列較緊密、數目增多，說明HBO改善APP/PS1小鼠學習記憶能力可能與減輕海馬神經元損傷有關。

突觸在神經元之間緊密接觸并起到彼此傳遞信息的作用。雖然具體分子機制尚不完全清楚，但是AD病理損傷導致的海馬突觸數量減少及突觸蛋白表達降低是造成學習記憶障礙的重要原因[16]。多種突觸相關蛋白一起來維持突觸的功能并調控神經遞質的釋放，通常認為Aβ能夠結合突觸相關蛋白使其失活，這被認為是AD患者突觸可塑性障礙的病理機制之一。SYN位于突觸前膜，是有代表性的與突觸囊泡相關的蛋白，主要調節(jié)神經遞質的釋放，可以用來反映突觸的密度和分布；而位于突觸后膜的PSD-95也是一種調節(jié)突觸分布的重要骨架蛋白，在突觸興奮和維持突觸結構和功能可塑性上發(fā)揮著重要的作用。因此，它特別容易受到AD病理損傷所導致的毒性作用[9]。軸突膜蛋白GAP43是一種神經特異性的蛋白質，主要參與神經細胞外生長及突觸發(fā)育形成和神經細胞再生[17]。AD患者海馬內SYN、PSD-95及GAP43蛋白含量比正常同齡人明顯減少，提示AD患者海馬內神經元突觸丟失明顯。Li等[18]通過增加APP/PS1小鼠海馬神經元突觸蛋白的表達來發(fā)揮逆轉認知功能障礙的作用。Lecca等[19]利用苯絲氨酸增加SYN、PSD95密度來改善神經元死亡、神經炎癥及突觸功能障礙。因此，尋求可以提高AD患者腦內突觸相關蛋白表達水平的治療手段是目前的研究熱點。本研究結果顯示，HBO能夠增加小鼠海馬區(qū)突觸相關蛋白SYN、PSD-95及GAP43的表達，說明了HBO發(fā)揮改善APP/PS1小鼠認知功能障礙，減輕海馬神經元損傷的作用，可能與增加海馬區(qū)突觸密度、改善突觸功能有關。

為了闡明HBO對CREB/BDNF信號通路活性的影響，我們對小鼠海馬內CREB/BDNF信號通路的相關蛋白基因和蛋白表達進行了評價，結果顯示HBO能夠上調CREB、BNDF mRNA及p-CREB、BNDF蛋白的表達，說明了Aβ誘導的CREB/BDNF信號通路抑制可以被HBO激活。為了進一步探討HBO發(fā)揮改善APP/PS1轉基因小鼠認知功能障礙作用的機制與激活CREB/BDNF信號通路的關系，我們利用一種常用的CREB磷酸化的抑制劑H89，來抑制CREB活性，阻止其激活BDNF，以阻斷CREB/BDNF信號通路[20]。結果顯示H89可以逆轉HBO上調小鼠海馬區(qū)CREB、BNDF mRNA及p-CREB、BNDF蛋白表達的作用，同時HBO改善小鼠海馬神經元結構及突觸功能，提高小鼠學習記憶能力的作用均被CREB活性抑制劑H89所阻斷或減弱，這說明了HBO改善APP/PS1小鼠的學習記憶能力，可能與激活CREB/BDNF信號通路，減輕小鼠海馬神經元突觸損傷有關。

綜上所述，HBO可改善APP/PS1小鼠的學習記憶能力與智力水平，減輕海馬區(qū)神經元突觸損傷，上調突觸相關蛋白表達，發(fā)揮神經保護作用。本研究也對HBO發(fā)揮神經保護作用與CREB/BDNF信號通路之間是否存在聯系做了初步探討，但HBO對APP/PS1小鼠發(fā)揮神經保護作用是否是通過調控CREB/BDNF信號通路實現的仍有待進一步研究。