前列腺素E1通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激保護(hù)心肌梗死后大鼠的心臟*

饒?zhí)m蘭，馬添翼

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院 1藥學(xué)部，2心血管內(nèi)科，海南?？?70208）

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是嚴(yán)重危害全球人們身體健康的最常見(jiàn)的疾病之一[1]。MI能造成心肌細(xì)胞損失（包含凋亡、壞死和其他類型死亡造成的細(xì)胞數(shù)減少），而梗死區(qū)殘存的心肌細(xì)胞則受到MI后心力衰竭的進(jìn)一步損傷[2]。心肌細(xì)胞死亡的增加和心肌間質(zhì)纖維化的加重是MI后心室重構(gòu)和心功能減退的重要原因[3]，因此保護(hù)心肌細(xì)胞免受MI后繼續(xù)損傷和抑制MI后心肌間質(zhì)纖維化的加重，有望提高M(jìn)I后心功能并抑制慢性心力衰竭的進(jìn)展。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）誘導(dǎo)的死亡途徑不同于死亡受體途徑（外源性途徑）和線粒體介導(dǎo)的死亡途徑（內(nèi)源性途徑）[4]，因此內(nèi)質(zhì)網(wǎng)也被認(rèn)為是決定細(xì)胞死亡的重要細(xì)胞器。當(dāng)細(xì)胞面對(duì)缺氧、缺血和鈣代謝紊亂等刺激時(shí)可導(dǎo)致未折疊的蛋白的積累，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應(yīng)以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和功能穩(wěn)定性，若ERS反應(yīng)過(guò)度延長(zhǎng)或過(guò)于嚴(yán)重，則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡[5]。ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡涉及3種信號(hào)通路：C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）、caspase-12和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun NH2-terminal kinase，JNK）。此外，作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的伴侶蛋白，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）在ERS動(dòng)態(tài)平衡的調(diào)節(jié)中也起著關(guān)鍵作用，也是ERS的標(biāo)志[6]。最近研究發(fā)現(xiàn)，ERS參與心血管疾病的病理發(fā)展過(guò)程，減少由ERS導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷和心室重構(gòu)可提高M(jìn)I后的心功能[4，7]。

前列腺素E1（prostaglandin E1，PGE1）也稱前列地爾，因?yàn)榫哂卸喾N藥理活性如血管擴(kuò)張、抑制白細(xì)胞黏附和血小板聚集、改善血液流變學(xué)特性、抗炎等，所以已被廣泛用于治療外周血管疾病、潰瘍、肝病、肺動(dòng)脈高壓、缺血性心臟病等[8-10]。近期研究中，PGE1被證明在缺血再灌注肝損傷動(dòng)物模型中可誘導(dǎo) GRP78的表達(dá)[6]，這提示 PGE1具有調(diào)節(jié) ERS作用。然而，PGE1對(duì)MI后心室重構(gòu)中的作用尚不清楚。因此，本研究利用冠脈左前降支結(jié)扎法建立大鼠MI模型，觀察PGE1是否對(duì)MI后的心臟具有保護(hù)作用，并進(jìn)一步探討其機(jī)制。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

50只5 周齡雄性SPF級(jí)SD大鼠（130～140 g）購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[SCXK（粵）2016-0041]，飼養(yǎng)于海南省藥物研究所[SYXK（瓊）2014-0025]SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)。大鼠正常飲食、飲水。飼養(yǎng)環(huán)境為室溫、57%濕度、采用12 h光/暗循環(huán)。

2 實(shí)驗(yàn)試劑

蘇木素-伊紅（HE）染料、戊巴比妥鈉、TUNEL試劑盒、RIPA裂解液和BCA試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天生物科技公司；Masson三色染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技公司；PGE1（前列地爾注射液，北京泰德制藥股份有限公司生產(chǎn)）購(gòu)自本院門診藥房；同型IgG II抗和Triton X-100均購(gòu)自Invitrogen；5%牛血清白蛋白購(gòu)自 Sigma；抗 GRP78、CHOP、caspase-12、Bcl-2、Bax、caspase-3和cleaved caspase-3抗體以及HRP標(biāo)記的II抗購(gòu)自Santa Cruz。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 實(shí)驗(yàn)分組與動(dòng)物模型的建立 50只SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，10只分入假手術(shù)（sham）組，20只分入模型（model）組，20只分入model+PGE1組。參考文獻(xiàn)[11]描述，把大鼠固定在手術(shù)臺(tái)上，通過(guò)腹腔注射3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，并予以插管和呼吸器泵通氣，打開(kāi)大鼠胸腔以暴露心臟，用縫線將冠狀動(dòng)脈左前降支從肺動(dòng)脈圓錐結(jié)扎到左心耳，然后依次關(guān)閉胸腔，心電圖顯示ST段抬高證實(shí)構(gòu)建MI大鼠模型成功。假手術(shù)組除不進(jìn)行冠脈結(jié)扎外，其它手術(shù)方式與模型組相同。模型+PGE1組大鼠在冠脈結(jié)扎造模術(shù)后第1～7天，每天通過(guò)每只大鼠經(jīng)尾靜脈注射2 μg/kg的PGE1（注：術(shù)后第1天注射時(shí)間為術(shù)后4 h）。假手術(shù)組和模型組在假手術(shù)或冠脈結(jié)扎造模術(shù)后第1～7天，每天經(jīng)尾靜脈注射等量的生理鹽水。所有大鼠繼續(xù)飼養(yǎng)8周。

3.2 超聲心動(dòng)圖對(duì)大鼠心功能的分析 8周后，使用Sonos 7500超聲儀（Philips）記錄大鼠仰臥時(shí)的超聲心動(dòng)圖圖像。通過(guò)觀察大鼠心尖四腔的二維聲波圖像，記錄左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左心室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）、左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD）和心輸出量（cardiac output，CO）并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

3.3 TTC染色 8周后，每組任取5只大鼠，麻醉后，處死各組的大鼠并取出心臟，放入-80℃速凍10 min后，沿長(zhǎng)軸連續(xù)切5片厚度為2 mm的心肌切片。心肌切片用1%TTC溶液在37℃條件下染色10 min，隨后用4%多聚甲醛固定24 h，拍照，并用ImageJ軟件計(jì)算梗死面積。

3.4 組織形態(tài)學(xué)分析 8周后，麻醉處死各組剩余的大鼠并取出心臟，分離左心室組織。左心室組織分成兩部分，一部分直接凍存在-80℃（用于后續(xù)Western blot檢測(cè)），另一部分固定在4%多聚甲醛24 h，并包埋在石蠟中進(jìn)行組織學(xué)研究。石蠟包埋組織被切成厚約5 μm的切片，分別予以HE和Masson染色，觀察心肌組織的形態(tài)。

3.5 TUNEL法檢測(cè) 按照細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書步驟對(duì)各組左心室心肌組織石蠟切片進(jìn)行染色并在熒光顯微鏡下觀察，并計(jì)數(shù)病變區(qū)域或sham組同位置的TUNEL染色陽(yáng)性（綠色熒光）細(xì)胞。

3.6 免疫組化染色 使用常規(guī)的免疫組織化學(xué)方法對(duì)各組左心室心肌組織石蠟切片分別進(jìn)行GRP78，CHOP、caspase-12、Bcl-2、Bax和 cleaved caspase-3的免疫組織化學(xué)染色。上述I抗均為兔單克隆抗體，稀釋比例分別為1∶150（抗CHOP抗體）、1∶200（抗GRP78抗體）、1∶300（抗caspase-12抗體）、1∶400（抗Bcl-2抗體和抗Bax抗體）和1∶100（抗cleaved caspase-3抗體）。然后使用蘇木精進(jìn)行核復(fù)染。從每個(gè)樣品中隨機(jī)選擇病變區(qū)域或sham組同位置的的5個(gè)區(qū)域進(jìn)行觀察，并用ImageJ軟件對(duì)目的蛋白表達(dá)進(jìn)行半定量分析。

3.7 Western blot檢測(cè)蛋白水平 取各組左心室心肌組織并利用RIPA裂解液萃取細(xì)胞蛋白。然后采用BCA法將各組蛋白樣品定量至相同濃度后，取20 μg樣品蛋白進(jìn)行SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜和封閉。封閉后以1∶1 000的稀釋比例孵育I抗（caspase-12、CHOP、GRP78、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3 和 GAPDH 抗體），4℃過(guò)夜。次日用TBST洗滌后再室溫孵育相應(yīng)的HRP標(biāo)記的II抗1 h，最后洗滌后利用化學(xué)發(fā)光成像儀顯影。以GAPDH為內(nèi)參照，采用ImageJ軟件分析目的條帶相對(duì)表達(dá)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，并利用GraphPad Prism軟件進(jìn)行后續(xù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多組定量資料的兩兩比較，采用單因素方差分析事后Bonferroni檢驗(yàn)。當(dāng)P＜0.05時(shí)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠的入組情況

因sham組無(wú)大鼠死亡，故sham組納入10只大鼠；model組在術(shù)后第1、2、3、5和9天各發(fā)生1、2、1、3和1只大鼠死亡，故僅納入12只大鼠；model+PGE1組在術(shù)后第3、4和8天各發(fā)生1、1和2只大鼠死亡，故納入16只大鼠。

2 PGE1提高M(jìn)I后的大鼠心功能

術(shù)后8周，通過(guò)超聲儀分別檢測(cè)各組大鼠的心功能，結(jié)果顯示，與sham組相比，model組大鼠的LVEF、LVFS和CO顯著降低，而LVEDD顯著升高（均P＜0.01）；與 model組相比，model+PGE1組大鼠的LVEF、LVFS和CO顯著升高（P＜0.01或P＜0.05），LVEDD顯著降低（P＜0.01），見(jiàn)圖1。以上結(jié)果提示PGE1可提高M(jìn)I后大鼠的心功能。

3 PGE1降低MI后的小鼠心肌梗死和病理形態(tài)學(xué)改變

通過(guò)HE和Masson染色觀察心肌組織病理學(xué)改變，結(jié)果顯示，sham組大鼠左心室區(qū)域心肌細(xì)胞形狀規(guī)則，心肌纖維排列整齊，心肌間質(zhì)間未見(jiàn)明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2A），也未見(jiàn)明顯的膠原沉積（圖2B）；model組大鼠左心室區(qū)域梗死區(qū)和非梗死區(qū)邊界清晰，梗死區(qū)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，心肌條紋紊亂或消失（圖2A），出現(xiàn)心肌間質(zhì)纖維化和大量膠原沉積（圖2B）；model+PGE1組大鼠左心室區(qū)域梗死區(qū)和非梗死區(qū)邊界清晰（但梗死區(qū)較小），梗死區(qū)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較model組輕，心肌細(xì)胞形狀和心肌纖維排列也趨向正常（圖2A），梗死區(qū)心肌間質(zhì)纖維化和膠原沉積也較model組輕（圖2B）。對(duì)Masson染色陽(yáng)性區(qū)面積統(tǒng)計(jì)顯示，與sham組相比，model組大鼠的心肌Masson染色陽(yáng)性面積顯著增大（P＜0.01）；與model組相比，model+PGE1組心肌Masson染色陽(yáng)性面積顯著減?。≒＜0.01），見(jiàn)圖2B。TTC染色結(jié)果顯示，與sham組相比，model組大鼠的心肌梗死面積顯著增大（P＜0.01）；與model組相比，model+PGE1組心肌梗死面積顯著減?。≒＜0.01），見(jiàn)圖2C。

4 PGE1減輕MI后的心肌損傷

Figure 1.Effect of PGE1 on the cardiac function parameters after MI in rats.LEVF：left ventricular ejection fraction；LEFS：left ventricular fractional shortening；LVEDD：left ventricular end-diastolic dimension；CO：cardiac output.Mean±SD.n=10 in sham group；n=12 in model group；n=16 in model+PGE1 group.*P＜0.05，**P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs model group.圖1 PGE1對(duì)MI后大鼠心功能參數(shù)的影響

Figure 2.Effect of PGE1 on the pathological changes and the infarct size of cardiac tissues after MI in rats.A：representative images of HE staining（scale bar=50 μm）；B：representative images of Masson staining（scale bar=50 μm）and quantitative results of Masson staining-positive size；C：representative images of TTC staining（scale in millimeters）and quantitative results of infarct size in cardiac tissues.Mean±SD.n=5.*P＜0.05，**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01vs model group.圖2 PGE1對(duì)MI后大鼠心肌組織病理改變和梗死灶大小的影響

TUNEL法結(jié)果顯示，與sham組同位置心肌切片相比，model組大鼠心肌切片的病變區(qū)的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著增加（P＜0.01）；與model組相比，model+PGE1組大鼠心肌切片的病變區(qū)的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著降低（P＜0.01），見(jiàn)圖3A。免疫組化染色觀察結(jié)果顯示，sham組同位置心肌組織Bcl-2呈中陽(yáng)性，Bax呈弱陽(yáng)性，cleaved caspase-3呈陰性表達(dá)；model組病變區(qū)心肌組織Bcl-2呈陰性，Bax和cleaved caspase-3呈強(qiáng)陽(yáng)性彌散表達(dá)；model+PGE1組病變區(qū)心肌組織Bcl-2呈強(qiáng)陽(yáng)性彌散表達(dá)，Bax和cleaved caspase-3呈中陽(yáng)性表達(dá)，見(jiàn)圖3B。進(jìn)一步用ImageJ軟件量化免疫組化染色圖中蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，與sham組同位置心肌組織相比，model組病變區(qū)心肌組織Bcl-2表達(dá)顯著降低、Bax和cleaved caspase-3表達(dá)顯著增加（P＜0.01）；與model組病變區(qū)心肌組織相比，model+PGE1組病變區(qū)心肌組織Bcl-2表達(dá)顯著增加、Bax和cleaved caspase-3表達(dá)顯著降低（P＜0.01），見(jiàn)圖 3B。Western blot結(jié)果顯示，與sham組相比，Model組心肌組織Bcl-2表達(dá)顯著降低、Bax和cleaved caspase-3的蛋白水平顯著增加（P＜0.01）；與 model組相比，model+PGE1組心肌組織Bcl-2表達(dá)顯著增加、Bax和cleaved caspase-3的蛋白水平顯著降低（P＜0.01），見(jiàn)圖3C。

Figure 3.Effect of PGE1 on myocardial damage after MI in rats.A：the representative images of cardiac tissues with TUNEL staining（scale bar=100 μm）and the quantitative results of TUNEL-positive cells；B：the representative images of immunohistochemical staining（scale bar=100 μm）for Bcl-2，Bax and cleaved caspase-3 in cardiac tissues and the quantitative results；C：the representative Western blot images and quantitative results of the protein levels of Bcl-2，Bax and cleaved caspase-3.Mean±SD.n=5 in sham group；n=7 in model group；n=9 in model+PGE1 group.**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs model group.圖3 PGE1對(duì)MI后大鼠心肌損傷的影響

5 PGE1抑制MI后的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平

通過(guò)免疫組化和Western blot法檢測(cè)ERS標(biāo)志分子GRP78、CHOP和caspase-12的表達(dá)水平來(lái)評(píng)價(jià)PGE1對(duì)ERS的影響。免疫組化染色觀察結(jié)果顯示，sham組同位置心肌組織的caspase-12、CHOP和GRP78呈陰性表達(dá)；model組病變區(qū)心肌組織的caspase-12、CHOP和GRP78呈強(qiáng)陽(yáng)性彌散表達(dá)；model+PGE1組病變區(qū)心肌組織的caspase-12、CHOP和GRP78呈中陽(yáng)性表達(dá)，見(jiàn)圖4A。進(jìn)一步用ImageJ軟件量化免疫組化染色圖中蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，與sham組同位置心肌組織相比，model組病變區(qū)心肌組織caspase-12、CHOP和GRP78的表達(dá)顯著增加（P＜0.01）；與model組相比，model+PGE1組病變區(qū)心肌組織caspase-12、CHOP和GRP78的表達(dá)顯著減少（P＜0.01），見(jiàn)圖4A。Western blot結(jié)果顯示，與sham組相比，model組心肌組織caspase-12、CHOP和GRP78的表達(dá)顯著增加（P＜0.01）；與model組相比，model+PGE1組心肌組織caspase-12、CHOP和GRP78的表達(dá)顯著減少（P＜0.01），見(jiàn)圖4B。

Figure 4.Effect of PGE1 on the ERS level of cardiac tissues after MI in rats.A：the representative images of immunohistochemical staining（scale bar=100 μm）for caspase-12，CHOP and GRP78 in cardiac tissues and the quantitative results；B：the representative Western blot images and quantitative results of the expression levels of caspase-12，CHOP and GRP78.Mean±SD.n=5 in sham group；n=7 in model group；n=9 in model+PGE1 group.*P＜0.05，**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs model group.圖4 PGE1對(duì)MI后大鼠心肌組織ERS水平的影響

討 論

缺氧、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等各種刺激均是MI引發(fā)ERS的常見(jiàn)激活因素[5]。本研究顯示冠脈結(jié)扎8周后心肌組織的CHOP、GRP78和caspase-12表達(dá)顯著升高，表明MI 8周后存在心肌組織ERS的激活。有證據(jù)表明，在MI 4周后心肌細(xì)胞GRP78和CHOP開(kāi)始顯著升高，伴隨 caspase-3 的激活[4，7]。由于 caspase-3的激活參與線粒體介導(dǎo)、死亡受體和ERS誘導(dǎo)的死亡途徑，因此cleaved caspase-3被認(rèn)為是細(xì)胞死亡的標(biāo)志。MI后的心力衰竭可誘導(dǎo)ERS，而ERS過(guò)度反應(yīng)又進(jìn)一步促進(jìn)心肌細(xì)胞cleaved caspase-3的表達(dá)，進(jìn)一步加重心力衰竭的發(fā)展[4，7，12]。本研究結(jié)果顯示，MI 8周后心肌細(xì)胞死亡增多，心肌組織促凋亡因子Bax和凋亡標(biāo)志物cleaved caspase-3表達(dá)升高，抑凋亡因子Bcl-2表達(dá)降低，心肌梗死面積的擴(kuò)大。

PGE1因具有擴(kuò)張血管、抑制血小板聚集、保護(hù)細(xì)胞等作用，被廣泛應(yīng)用于腦血管疾病及循環(huán)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和外周血管疾病的治療。最近研究發(fā)現(xiàn)，PGE1可通過(guò)降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶CHOP和GRP78的表達(dá)抑制ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[6]。本研究結(jié)果顯示，PGE1能抑制MI大鼠的GRP78、CHOP和caspase-12表達(dá)升高，提示PGE1能顯著降低MI后的ERS水平；且PGE1能抑制Bax表達(dá)和促進(jìn)Bcl-2表達(dá)，降低caspase-3的活化，減少M(fèi)I后心肌細(xì)胞死亡的數(shù)量。另外，MI后心功能減退不僅與心肌細(xì)胞損失相關(guān)，還與心肌間質(zhì)的膠原沉積和炎性因子浸潤(rùn)相關(guān)；膠原過(guò)度沉積能導(dǎo)致心肌間質(zhì)組織纖維化，降低心功能；炎性因子浸潤(rùn)不僅能促使心肌細(xì)胞死亡，還能加重MI后心力衰竭的發(fā)展[13-14]。ERS的過(guò)度激活能增加MI后炎性因子浸潤(rùn)和膠原異常增生[4，7]。本研究結(jié)果顯示，PGE1能減少M(fèi)I 8周后膠原過(guò)量沉積，減輕炎癥反應(yīng)，并減緩心功能的降低。結(jié)合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，PGE1可能通過(guò)抑制MI后ERS的激活，隨之抑制心肌細(xì)胞死亡、膠原異常增生和炎癥，最終提高M(jìn)I后的心功能。

綜上所述，PGE1可減緩MI后慢性心力衰竭的進(jìn)展，其機(jī)制可能是其通過(guò)抑制MI后心肌ERS的激活，進(jìn)而減少膠原過(guò)量沉積、炎性浸潤(rùn)和心肌細(xì)胞死亡并提高M(jìn)I后的心功能。