穿心蓮內(nèi)酯對急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的生長抑制及凋亡誘導(dǎo)作用*

李曉文，周越菡△，鄧健志，羅珍華，江海鍵，張漫麗，覃楚玲

（1桂林醫(yī)學(xué)院，廣西桂林541100；2桂林理工大學(xué)，廣西桂林541004）

急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）是中國十大高發(fā)惡性腫瘤之一[1]。目前，臨床上治療ALL的手段主要以應(yīng)用糖皮質(zhì)激素，如地塞米松等作為基礎(chǔ)化療藥物從而減少ALL細(xì)胞的數(shù)量為主[2]，但現(xiàn)有治療方案易引發(fā)水鹽代謝紊亂、高血壓、骨質(zhì)疏松等不良反應(yīng)，且會(huì)引起耐藥，從而使預(yù)后變差[3]。因此，開發(fā)可替代現(xiàn)有治療方案的新型抗ALL化療藥物，將在ALL的治療中發(fā)揮重要作用。

穿心蓮內(nèi)酯（andrographolide，AND）是爵床科穿心蓮屬植物穿心蓮（Andrographis paniculata）的主要活性成分，具抗炎、保肝、抗病毒等作用[4-6]，還對多種腫瘤發(fā)揮抗增殖、抗凋亡等作用[7]。當(dāng)前關(guān)于AND對ALL的作用的研究非常有限，且AND對耐藥性ALL的作用仍未有報(bào)道。本研究以地塞米松耐藥的人源ALL細(xì)胞株CEM-C1為實(shí)驗(yàn)對象，觀察AND對CEM-C1細(xì)胞生長的抑制作用，探討AND對凋亡相關(guān)因子 cleaved caspase-3、cleaved caspase-7、Bcl-2和Bax的影響以及對線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）的作用，并觀察AND對CEMC1細(xì)胞構(gòu)建的BALB/c-nu雌性裸鼠異位移植瘤模型的影響，最后應(yīng)用免疫組化法檢測裸鼠腫瘤組織凋亡蛋白cleaved caspase-3的改變，以期為ALL的臨床治療提供了新策略。

材料和方法

1 主要材料

1.1 細(xì)胞株及動(dòng)物 人源急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株CEM-C1購于中科院上海細(xì)胞庫。5周齡Balb/c-nu雌性裸鼠購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)SYXK（湘）2016-0002，在桂林醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心SPF級屏障系統(tǒng)中飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑及儀器 AND（Sigma-Aldrich）；RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco）；青/鏈霉素（HyClone）；胎牛血清（Lonsera）；CCK-8試劑盒和Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒（DOJINDO）；Corning?Matrigel?Basement Membrane Matrix（BD）；Wright-Giemsa染色試劑盒（Solarbio）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（H+L）和細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（碧云天）；抗 caspase-3、cleaved caspase-3、caspase-7和cleaved caspase-7抗體（Cell Signaling Technology）；JC-1線粒體膜電位試劑盒（Thermo Fisher）。FACSAria? Ⅲ流式細(xì)胞儀（BD）；酶標(biāo)儀（Bio-Rad）；正置顯微鏡和熒光倒置顯微鏡（Olympus）；CO2培養(yǎng)箱（SANYO）；凝膠成像系統(tǒng)（Tanon）；Centro LB 960微孔板發(fā)光檢測儀（Berthold）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物配制 CEM-C1細(xì)胞培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基，即含有1%青/鏈霉素和10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。AND用DMSO配成40 mmol/L的貯存液，無菌處理后分裝保存于-20℃中，臨用前用培養(yǎng)基稀釋至相應(yīng)的濃度。

2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞活力 取生長對數(shù)期的CEM-C1細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基配成單細(xì)胞懸液，以每孔1×104個(gè)的密度接種于96孔板中，每孔接種100 μL，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。24 h后，加入相應(yīng)濃度的AND，正常對照（control）組加入無藥物的完全培養(yǎng)基，溶劑對照（vehicle）組加入與AND最高劑量相應(yīng)濃度的DMSO。藥物作用12、24和48 h后，使用CCK-8法于酶標(biāo)儀450 nm處檢測細(xì)胞吸光度（A）值。細(xì)胞相對活力（%）=加藥組平均A值/對照組平均A值×100%。

2.3 Wright-Giemsa染色觀察細(xì)胞形態(tài) 取對數(shù)期的CEM-C1細(xì)胞，給藥處理24 h后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，1 000 r/min離心3 min，去除上清液。加入PBS，1 000 r/min離心3 min，去除上清液。再加適量的PBS重懸細(xì)胞，取30 μL細(xì)胞懸液均勻涂布于載玻片上自然晾干，用4%多聚甲醛室溫下固定30 min。按照Wright-Giemsa染色試劑盒說明書進(jìn)行染色，于顯微鏡下采集圖像。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布 AND處理CEM-C1細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞至離心管1 000 r/min離心3 min，棄上清并用預(yù)冷PBS洗滌，再次離心沉淀細(xì)胞，用在70%乙醇在4℃中固定過夜。次日，用1 000 r/min離心3 min，沉淀細(xì)胞。用PBS洗滌后，將細(xì)胞與碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色液在37℃避光孵育30 min。使用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期的變化情況，并分析檢測結(jié)果。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 AND處理CEM-C1細(xì)胞24 h后，按Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit所述步驟進(jìn)行annexin V-FITC及PI染色，然后上流式細(xì)胞儀檢測[激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm；annexin V-FITC的綠色熒光通過FITC通道（FL1）檢測，PI的紅色熒光通過PI通道（FL2或FL3）檢測]。

2.6 Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) AND處理CEM-C1細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞至離心管，1 000 r/min離心3 min沉淀收集細(xì)胞，棄上清并用預(yù)冷PBS洗滌，再次離心沉淀細(xì)胞，將細(xì)胞用RIPA裂解液裂解后，用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，加5×上樣緩沖液混勻，煮沸5 min。進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。用5%脫脂奶粉封閉2 h，將膜在4℃與I抗溫育過夜。次日，將膜用1×TBST洗滌3次，之后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的II抗，在室溫下孵育2 h，用1×TBST漂洗3次。避光處，將ECL顯色液滴加到PVDF膜上，反應(yīng)1～3 min。凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，應(yīng)用ImageJ軟件對條帶進(jìn)行灰度分析。

2.7 JC-1法檢測細(xì)胞MMP 將CEM-C1細(xì)胞接種于6孔板中并用AND處理24 h。以羰基氰化氯苯腙（carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone，CCCP；10 μmol/L）作為陽性對照，按照J(rèn)C-1檢測試劑盒說明書所述步驟進(jìn)行染色。對染色的CEM-C1細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞涂片、封片，并應(yīng)用熒光顯微鏡采集圖像。將細(xì)胞接種于96孔黑色底透微孔板中，按上述分組應(yīng)用藥物處理24 h后，每孔加入JC-1，使其終濃度為5 μmol/L。37℃避光孵育20 min后，參照文獻(xiàn)[8]的方法，在激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長600 nm處檢測紅光熒光強(qiáng)度A1，在激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長530 nm處檢測綠光熒光強(qiáng)度A2。各組的熒光值A(chǔ)=A1/A2，最終以相對熒光比例對MMP數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析：相對熒光比例（%）=相應(yīng)組別A/control組A×100%。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.8 AND對Balb/c-nu荷瘤鼠腫瘤生長的影響 將CEM-C1細(xì)胞重懸于無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中，細(xì)胞密度控制在1×1011/L。將細(xì)胞懸液與人工合成基質(zhì)膠按1∶1的體積比例混勻，然后皮下注射到5周齡雌性BALB/c-nu裸鼠右脅腹側(cè)，每只接種200 μL。從接種當(dāng)天開始，每天應(yīng)用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測量并按以下公式計(jì)算腫瘤體積（V）：V=L×W2×0.5，L為長度，W為寬度。將動(dòng)物隨機(jī)分為4組，每組4只。以注射細(xì)胞當(dāng)天的天數(shù)記為0，第7天起每天分別腹腔注射生理鹽水（空白組）或不同劑量的AND（0.5、1或2 mg/kg），注射容積為10 mL/kg。AND用生理鹽水配制。在初次腹腔注射給藥后2周（第21天）處死動(dòng)物，完整剝離腫瘤組織并應(yīng)用分析天平測量其重量。

2.9 免疫組化法檢測荷瘤鼠腫瘤組織中cleaved caspase-3的水平 將上述所得荷瘤鼠腫瘤組織于4%多聚甲醛中固定24 h后進(jìn)行石蠟包埋、切片；參照文獻(xiàn)[9]，對切片進(jìn)行熱固定、去石蠟、重新水化、高溫高壓修復(fù)處理后，于3%H2O2室溫孵育15 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶，再用PBS漂洗3次；兔抗人cleaved caspase-3Ⅰ抗（1∶500）4℃孵育過夜，PBS沖洗3次，加入Ⅱ抗孵育20 min，再用PBS充分淋洗，最后DAB顯色、蘇木精復(fù)染、脫水透明、樹膠封片，于正置顯微鏡下觀察并拍照。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)和方差分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，組間差異用單因素方差分析，兩兩間比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05時(shí)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 AND對CEM-C1細(xì)胞的生長抑制作用

CCK-8結(jié)果所示，AND對CEM-C1細(xì)胞活力的抑制作用呈時(shí)間及劑量依賴性，見圖1A。Wright-Giemsa染色結(jié)果顯示，應(yīng)用AND后，CEM-C1細(xì)胞縮小、凝聚，細(xì)胞染色加深，細(xì)胞質(zhì)均質(zhì)紅染并且細(xì)胞數(shù)減少，進(jìn)一步證明AND對CEM-C1細(xì)胞具有生長抑制作用，見圖1B。

2 AND對CEM-C1細(xì)胞的周期阻滯及凋亡誘導(dǎo)作用

AND處理細(xì)胞24 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果證明，隨著藥物濃度的增加，處于第2、4象限的細(xì)胞數(shù)增多，即凋亡細(xì)胞數(shù)量增多；對3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示，8 μmol/L AND處理24 h后，CEMC1細(xì)胞的凋亡率與空白對照組相比顯著升高（P＜0.05），見圖2A。AND處理24 h后，隨著藥物AND濃度增大，停留在G2期的細(xì)胞增加，證明細(xì)胞周期被阻滯在G2期，細(xì)胞的生長被抑制，見圖2B。

3 AND對凋亡相關(guān)蛋白的影響

Western blot結(jié)果顯示，AND作用 24 h，隨著AND濃度的增加，活化的凋亡蛋白cleaved caspase-3/-7蛋白的量增加，當(dāng)AND為10 μmol/L時(shí)，cleaved caspase-3/-7顯著增加（P＜0.05）；且與空白對照組相比，隨著AND的濃度增加，促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的比值增大（P＜0.01），見圖3。

4 AND對CEM-C1細(xì)胞MMP的影響

JC-1在空白對照組的線粒體中正常聚集并呈現(xiàn)紅色熒光，提示MMP正常；應(yīng)用陽性對照藥CCCP作用于CEM-C1細(xì)胞24 h后，細(xì)胞MMP明顯降低，呈現(xiàn)綠色熒光；AND作用于CEM-C1細(xì)胞24 h后，隨著AND的濃度增大，CEM-C1細(xì)胞的綠色熒光強(qiáng)度增加，指示較低的MMP，熒光定量結(jié)果進(jìn)一步證明，AND劑量依賴性地降低CEM-C1細(xì)胞的MMP，見圖4。因此，AND可能通過降低MMP而引起CEM-C1細(xì)胞凋亡。

5 AND對ALL裸鼠移植瘤的體積、重量及cleaved caspase-3蛋白水平的影響

觀察期結(jié)束后處死動(dòng)物，取瘤稱重，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AND各給藥組的瘤體重量明顯輕于control組，體積亦明顯小于control組（P＜0.05或P＜0.01），見圖5。這表明AND對CEM-C1細(xì)胞裸鼠移植瘤具有明顯的生長抑制作用。

免疫組化結(jié)果顯示，AND各給藥組移植瘤組織中的棕染比例明顯高于control組，染色亦明顯深于control組，即AND組腫瘤細(xì)胞的cleaved caspase-3蛋白水平高于control組，且隨著AND劑量的增加，棕色信號(hào)增強(qiáng)，說明AND在體內(nèi)對ALL的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)呈劑量依賴性，見圖6。

討 論

ALL的治療手段，目前仍以地塞米松為基礎(chǔ)藥物對患者進(jìn)行化療為主，然而長期應(yīng)用地塞米松引發(fā)的不良反應(yīng)及耐藥問題，嚴(yán)重降低了患者的生存質(zhì)量[3]。作為廣西特色中草藥之一的穿心蓮，其主要成分AND已被證明有較強(qiáng)的抗炎和抗病毒作用[10]，并對多種類型的腫瘤具有生長抑制效應(yīng)[7]。有研究表明，AND可抑制ALL細(xì)胞株Jurkat的生長[11]，為AND對ALL的治療作用提供了一定的線索。然而，當(dāng)前關(guān)于AND對ALL作用的研究較為有限，且AND對耐藥性ALL的作用仍未有報(bào)道。因此，我們選用對地塞米松耐藥的ALL細(xì)胞株CEMC1，研究AND是否對其生長及凋亡存在調(diào)控作用。

Hanahan等[12]曾經(jīng)綜述過惡性腫瘤的6大生物學(xué)特征，其中第一大特征就是腫瘤細(xì)胞的無限生長。我們應(yīng)用CCK-8和Wright-Giemsa染色法證實(shí)，濃度低至2.5 μmol/L時(shí)，AND作用24 h即可對CEM-C1細(xì)胞產(chǎn)生明顯的生長抑制作用，形態(tài)上表現(xiàn)為細(xì)胞縮小、凝聚，細(xì)胞染色加深，細(xì)胞質(zhì)均質(zhì)紅染。流式細(xì)胞周期檢測結(jié)果進(jìn)一步證明，AND能將CEM-C1細(xì)胞周期阻滯在G2期從而抑制細(xì)胞生長。因此，AND對耐地塞米松ALL細(xì)胞具有生長抑制作用，具備作為ALL患者對地塞米松耐藥后候選藥物的潛質(zhì)。

Figure 2.AND induced apoptosis and cell cycle arrest of CEM-C1 cells.A：flow cytometry was utilized to detect the apoptosis of CEM-C1 cells treated with AND for 24 h；B：flow cytometry was utilized to detect cell cycle distribution of CEM-C1 cells treated with AND for 24 h.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖2 AND誘導(dǎo)CEM-C1細(xì)胞凋亡及周期阻滯

細(xì)胞凋亡屬于生理性程序性細(xì)胞自殺，是由進(jìn)化保守和遺傳決定的，即細(xì)胞在一定的生理及病理?xiàng)l件下，遵循自身的程序，以細(xì)胞內(nèi)caspases激活為起點(diǎn)自我結(jié)束生命，最后裂解為若干凋亡小體，被其他細(xì)胞吞噬，通常不伴有死亡細(xì)胞內(nèi)容物釋放而無炎癥[13]。細(xì)胞凋亡在細(xì)胞生長過程中發(fā)揮著重要的作用。我們采用annexin V-FITC/PI雙染和流式細(xì)胞術(shù)檢測AND用藥后的細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，不同濃度梯度的AND處理CEM-C1細(xì)胞24 h后，8 μmol/L AND對CEM-C1細(xì)胞即可發(fā)揮凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)，隨著藥物濃度增加，CEM-C1細(xì)胞凋亡率逐漸增大。

Figure 3.The effects of AND on the expression of apoptosis-related proteins in CEM-C1 cells.A：the effects of AND on the protein levels of caspase-3 and cleaved caspase-3；B：the effects of AND on the protein levels of caspase-7 and cleaved caspase-7；C：the effects of AND on the protein levels of Bax and Bcl-2.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖3 AND對CEM-C1細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白水平的影響

Figure 4.AND induced reduction of mitochondrial membrane potential in CEM-C1 cells（JC-1 staining，×400）.The fluorescence values of JC-1 obtained from fluorescence microplate reader were calculated as red/green fluorescence ratio and normalized as percentage of control group from 3 independent experiments.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs control group.圖4 AND降低CEM-C1細(xì)胞的線粒體膜電位

Figure 5.The in vivo growth-inhibitory effect of AND on the ALL cell xenograft tumors.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖5 AND對ALL細(xì)胞移植瘤模型的體內(nèi)生長抑制作用

Figure 6.The effect of AND on the protein level of cleaved caspase-3 in ALL cell xenograft tumors（×400）.圖6 AND對ALL細(xì)胞移植瘤組織cleaved caspase-3蛋白水平的影響

為驗(yàn)證AND誘導(dǎo)CEM-C1細(xì)胞凋亡的效應(yīng)，我們應(yīng)用Western blot法檢測應(yīng)用AND后CEM-C1細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的情況。作為caspase家族的關(guān)鍵因子，caspase-3和caspase-7是凋亡被誘導(dǎo)的過程中最主要的效應(yīng)凋亡蛋白酶，其活化可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[14]；cleaved caspase-3和cleaved caspase-7分別是caspase-3和caspase-7活化過程中經(jīng)剪切產(chǎn)生的活性片段，其活化程度及其與caspase-3和caspase-7的比值越高，細(xì)胞凋亡越明顯[15-16]。在本研究中，AND劑量依賴性地升高 caspase-3、caspase-7、cleaved caspase-3、cleaved caspase-7、cleaved caspase-3/caspase-3和cleaved caspase-7/caspase-7的水平。在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步觀察AND對凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的調(diào)控作用。Bcl-2蛋白通過抑制促細(xì)胞凋亡家族成員Bax的激活來阻止細(xì)胞凋亡[17]。而作為預(yù)測抗腫瘤藥物臨床療效的指標(biāo)之一，Bax/Bcl-2的比值與腫瘤緩解率成正比[18]。本研究表明，AND下調(diào)CEMC1細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，提高Bax/Bcl-2的比值，從而抑制ALL細(xì)胞生長。

在細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，線粒體是發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞器。線粒體內(nèi)膜兩側(cè)的電化學(xué)梯度的存在（即MMP）是維持線粒體生物能量合成等正常功能所必需的，MMP的下降是細(xì)胞凋亡的特異性標(biāo)志[19-20]。我們應(yīng)用MMP指示劑JC-1對藥物處理后的CEM-C1細(xì)胞進(jìn)行染色，熒光顯微鏡下觀察MMP的變化情況。JC-1是一種能透過細(xì)胞膜的熒光染料。正常細(xì)胞的MMP較高，JC-1能依賴線粒體跨膜電勢進(jìn)入線粒體基質(zhì)，并形成聚合物從而產(chǎn)生紅色熒光；而當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，MMP較低，JC-1不能聚集在線粒體基質(zhì)中，此時(shí)JC-1為單體，產(chǎn)生綠色熒光。我們發(fā)現(xiàn)應(yīng)用低至2.5 μmol/L的AND即可降低CEM-C1細(xì)胞的MMP，濃度為10 μmol/L時(shí)，對MMP的影響已幾乎接近CCCP，提示AND能通過降低MMP從而誘導(dǎo)CEM-C1細(xì)胞的凋亡。而在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用AND后，裸鼠腫瘤生長減慢，瘤體重量和體積明顯減小。鑒于caspase-3是細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白級聯(lián)反應(yīng)的終結(jié)者，且caspase-3活化成cleaved caspase-3也就意味著細(xì)胞凋亡進(jìn)入了無法逆轉(zhuǎn)的階段[21]，因此我們將cleaved caspase-3作為檢測凋亡的代表性指標(biāo)，用免疫組化方法檢測其在腫瘤組織的含量，發(fā)現(xiàn)AND明顯提高荷瘤鼠腫瘤組織中cleaved caspase-3的水平，提示AND在體內(nèi)對ALL亦有凋亡誘導(dǎo)作用。

綜上所述，AND可誘導(dǎo)耐地塞米松的CEM-C1細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而抑制其生長，說明AND有望成為新型的天然、安全的ALL治療藥物。盡管對誘導(dǎo)凋亡從而抑制生長的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步深入探索，然而本研究為耐藥性ALL的治療提供了初步的理論依據(jù)及新策略，并為民族醫(yī)藥在腫瘤藥物治療學(xué)的應(yīng)用提供了新思路。