膽管癌脾酪氨酸激酶表達(dá)增高對(duì)腫瘤微環(huán)境巨噬細(xì)胞M2型極化的影響*

袁 輝，林澤龍，胡 敏，蔣煜川，劉 珂，曲 辰，洪 健，，△

（1南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腫瘤中心，廣東廣州510315；2暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽外科，3暨南大學(xué)藥學(xué)院藥學(xué)系，4暨南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理系，廣東廣州510632）

膽管癌（cholangiocarcinoma，CCA）惡性程度高，易向周圍組織侵犯及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后極差[1-2]，患者的5年生存率僅為20～30%。手術(shù)切除、化療和輔助放療是膽管癌的主要治療手段，尚缺乏有效的靶向藥物[3]。膽管癌發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多階段和多步驟的慢性演變過程，主要包括膽管增生、膽管異型增生、膽管瘤和膽管癌[4-5]。因此，探索膽管癌發(fā)生發(fā)展的調(diào)控機(jī)制與有效靶標(biāo)，是目前膽管癌研究的重要方向。前期研究中我們觀察到肝臟增生的膽管中脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，SYK）表達(dá)顯著升高[6]，本研究擬通過構(gòu)建自發(fā)誘導(dǎo)的大鼠和小鼠肝內(nèi)膽管癌模型，進(jìn)一步探究膽管癌演變進(jìn)程和人膽管癌組織中SYK的表達(dá)變化及其作用機(jī)制。

材料和方法

1 組織標(biāo)本

本研究涉及的48例人膽管癌標(biāo)本和癌旁肝組織（距腫瘤邊緣＜2 cm）及15例人正常肝組織標(biāo)本（患者因血管瘤接受切除手術(shù)）均來自暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院。上述標(biāo)本均獲明確的病理學(xué)診斷，術(shù)前未接受過任何抗腫瘤治療。本研究獲得暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)規(guī)定。

2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠40只[8～9周齡，體重（350±20）g]和SPF級(jí)雄性BALB/c小鼠30只（7周齡）均購(gòu)于南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[許可證號(hào)為SCXK（粵）2016-0041]，飼養(yǎng)于獨(dú)立通氣籠盒（individually ventilated caging，IVC）系統(tǒng)中，溫度為（23±1）℃，濕度為45%，自由飲食。

3 實(shí)驗(yàn)試劑

硫代乙酰胺（thioacetamide，TAA）和二乙基亞硝胺（diethylnitrosamine，DEN）均購(gòu)自 Sigma-Aldrich；SYK抑制劑entospletinib（GS-9973）購(gòu)自Selleck；蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色試劑盒購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）、檸檬酸鹽緩沖液、山羊血清和抗體稀釋液均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；抗SYK、CK19、CD163和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）抗體均購(gòu)自Abcam；免疫組化II抗及辣根過氧化氫酶DAB顯色試劑盒購(gòu)自Dako；熒光II抗和細(xì)胞核染色試劑（DAPI）購(gòu)自Thermo Fisher。

4 主要方法

4.1 大鼠肝內(nèi)膽管癌模型的構(gòu)建[7]、分組及處理將40只大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組（35只，每天飲用含300 mg/L TAA的飲用水）和空白對(duì)照組（5只，正常飲水），飼養(yǎng)于IVC系統(tǒng)中，每周2次監(jiān)測(cè)體重變化，分別于第9、12和16周末每次處死3只大鼠，第24周末處死16只大鼠，開腹觀察肝臟表面及其病變情況，切取部分肝臟（病變）組織，中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋。24周后，將剩余的10只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和SYK抑制劑（7.5 mg/kg）組，每組5只，每天定時(shí)灌胃給藥，對(duì)照組給予等體積的溶劑。每周2次監(jiān)測(cè)體重變化并觀察大鼠狀態(tài)，共持續(xù)4周。麻醉下開腹觀察肝臟表面及其病變情況，切取部分肝臟（病變）組織，中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋。

4.2 小鼠肝內(nèi)膽管癌模型的構(gòu)建[5]雄性BALB/c小鼠30只，飼養(yǎng)于IVC系統(tǒng)中。將小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組（6只，不作任何處理）和實(shí)驗(yàn)組（24只）。實(shí)驗(yàn)組小鼠于第1和2周，給予DEN（100 mg/kg）腹腔注射；于第5周末，在1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉下，開腹行左中位膽管結(jié)扎；從第6周開始至第28周，每周給予DEN（25 mg/kg）灌胃1次。每周2次監(jiān)測(cè)體重變化，分別于第9、12和16周末每次處死5只小鼠，第28周時(shí)處死剩余小鼠，開腹觀察肝臟病變情況，切取部分肝臟（病變）組織，中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋。

4.3 免疫組織化學(xué)染色 制備2 μm厚的肝組織連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟水化，滴加3%雙氧水，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性后微波修復(fù)抗原，冷卻至室溫后山羊血清37℃封閉30 min，抗SYK、CK19、iNOS和CD163抗體用抗體稀釋液1∶100稀釋，4℃孵育過夜；PBS漂洗后滴加生物素標(biāo)記的II抗，室溫孵育30 min，DAB顯色，蘇木精染色，常規(guī)脫水透明封片。

4.4 免疫熒光染色 切片常規(guī)脫蠟水化，微波修復(fù)抗原，冷卻至室溫，山羊血清37℃封閉30 min，加入混合抗體[抗SYK抗體（1∶100）+抗iNOS抗體或抗CD163抗體（1∶50）]，4℃孵育20小時(shí)；PBS漂洗后滴加熒光標(biāo)記的II抗，室溫孵育60 min；PBS漂洗后DAPI染色，吹干封片，使用熒光顯微鏡觀察。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析，兩變量的相關(guān)分析采用Pearson直線相關(guān)分析法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 成功構(gòu)建大鼠和小鼠肝內(nèi)膽管癌模型

在大鼠膽管癌模型中，肝臟大體形態(tài)與顯微鏡下肝組織改變：第9周末肝臟形態(tài)正常，鏡下可見部分匯管區(qū)小膽管增生，即膽管細(xì)胞數(shù)目增多，增生后的膽管有明確的邊界和管腔結(jié)構(gòu)，未見細(xì)胞異型性；第12周末大鼠肝臟表面有凹凸不平小顆粒，鏡下可見部分膽管異型增生，即增生的膽管具有異常的管腔輪廓，細(xì)胞核大、深染、異型性，核膜不規(guī)則，明顯的核仁和核極性喪失，未侵犯周圍組織；第24周末大鼠肝臟顏色晦暗，表面凹凸不平，可見多個(gè)白色圓形質(zhì)硬結(jié)節(jié)（直徑最大約10 mm），通過HE染色法觀察到細(xì)胞發(fā)生癌變，具有細(xì)胞核大、深染、異型性等組織學(xué)改變，侵及周邊正常肝組織，CK19染色（肝臟膽管細(xì)胞來源的特征性標(biāo)志物）確診為膽管癌，見圖1（紅色箭頭所指分別為大鼠正常膽管、膽管增生、膽管異型增生和膽管癌中的CK19陽(yáng)性細(xì)胞）。

在小鼠膽管癌模型中，第12周末小鼠肝臟形態(tài)大致正常，鏡下可見部分小膽管增生（具體組織學(xué)改變同大鼠膽管增生）；第16周末小鼠肝臟表面有質(zhì)軟囊性腫物，鏡下HE染色可診斷為膽管瘤，肝匯管區(qū)可見局灶性紊亂排列的膽管，細(xì)胞未見明顯異型性；第28周末肝臟可見不規(guī)則白色質(zhì)硬結(jié)節(jié)（最長(zhǎng)徑約10 mm），HE染色可見異型腫瘤細(xì)胞，CK19染色證實(shí)為膽管細(xì)胞來源，見圖2（紅色箭頭所指分別為小鼠正常膽管、膽管增生、膽管瘤和膽管癌中的CK19陽(yáng)性細(xì)胞）。

2 膽管癌演變進(jìn)程中SYK表達(dá)逐漸升高

肝組織中SYK陽(yáng)性染色為棕黃色或棕褐色，定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，正常肝細(xì)胞存在SYK陽(yáng)性表達(dá)，而正常膽管細(xì)胞未見SYK陽(yáng)性表達(dá)。與大鼠正常肝組織的膽管細(xì)胞相比，膽管增生時(shí)開始出現(xiàn)SYK異常表達(dá)（表達(dá)水平相對(duì)較低），隨著疾病進(jìn)展，SYK表達(dá)水平逐漸增高，在膽管異型增生和膽管癌組織中SYK均呈陽(yáng)性表達(dá)（P＜0.01），見圖3A（紅色箭頭所指為膽管結(jié)構(gòu)和膽管癌中的SYK陽(yáng)性細(xì)胞）。小鼠模型中SYK表達(dá)呈現(xiàn)相似趨勢(shì)：肝臟膽管增生組織中開始呈現(xiàn)SYK異常表達(dá)，在膽管瘤和膽管癌中SYK表達(dá)逐步升高（P＜0.01），見圖3B（紅色箭頭所指為膽管結(jié)構(gòu)和膽管癌中的SYK陽(yáng)性細(xì)胞）。

3 膽管癌組織中M2型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增加

與大鼠和小鼠正常肝組織相比，相應(yīng)膽管癌組織中M2型巨噬細(xì)胞（CD163陽(yáng)性）浸潤(rùn)數(shù)目增多，而M1型（iNOS陽(yáng)性）數(shù)目相對(duì)減少（P＜0.01），見圖4（紅色箭頭所指為iNOS/CD163陽(yáng)性細(xì)胞）；但在膽管癌發(fā)生早期（膽管增生、異型增生和膽管瘤）的病變組織中，未見M1和M2型巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)數(shù)目顯著變化。此外，在48例人膽管癌/匹配癌旁肝組織和15例正常肝組織中，免疫組化染色顯示CD163陽(yáng)性細(xì)胞在腫瘤周圍區(qū)域的浸潤(rùn)數(shù)量顯著高于腫瘤內(nèi)區(qū)域和正常肝組織（P＜0.01），見圖5A（紅色箭頭所指為CD163陽(yáng)性細(xì)胞）。

4 膽管癌組織中SYK與M2型巨噬細(xì)胞的相關(guān)性

檢測(cè)48例人膽管癌/匹配癌旁肝組織和15例正常肝組織中SYK的表達(dá)情況，結(jié)果顯示人膽管癌組織中的SYK表達(dá)量均顯著高于癌旁和正常肝組織（P＜0.01），見圖5A（紅色箭頭所指為膽管癌中SYK陽(yáng)性細(xì)胞）。對(duì)人膽管癌組織的SYK和CD163表達(dá)進(jìn)行Pearson相關(guān)分析顯示，SYK的異常表達(dá)與浸潤(rùn)的CD163陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)，即與M2型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量呈正相關(guān)（r=0.57，P＜0.01），見圖5B。通過SYK與iNOS或CD163免疫熒光共染顯示，正常肝臟膽管組織存在大量的M1型巨噬細(xì)胞，少量M2型巨噬細(xì)胞，未見SYK表達(dá)；膽管癌組織中SYK與CD163高表達(dá)，未見iNOS明顯表達(dá)，見圖5C。

Figure 3.SYK expression was gradually increased in two murine spontaneous induction models of cholangiocarcinoma（CCA）.Immunohistochemical（IHC）analysis for SYK protein expression in the development of rat（A）and mouse（B）CCA models.The scale bar=100 μm.Red arrows indicate SYK positive cells.Mean±SD.**P＜0.01 vs normal group.圖3 SYK在大鼠和小鼠膽管癌演變進(jìn)程中的異常表達(dá)

5 靶向SYK治療抑制大鼠膽管癌的腫瘤生長(zhǎng)和巨噬細(xì)胞M2型極化

對(duì)照組的大鼠肝臟表面可見多個(gè)白色圓形質(zhì)硬結(jié)節(jié)（直徑最大約10 mm），SYK抑制劑（GS-9973）組的大鼠肝臟腫瘤直徑較小，數(shù)量較少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖6（黃色圓圈部分為膽管癌）。通過HE染色，進(jìn)一步證實(shí)肝臟表面的白色圓形質(zhì)硬結(jié)節(jié)為膽管癌病變；此外，與對(duì)照組相比，SYK抑制劑組肝臟組織中M2型巨噬細(xì)胞的數(shù)量顯著減少（P＜0.01），見圖6。

討 論

膽管癌是一種預(yù)后較差的肝臟原發(fā)惡性腫瘤。近年來，其發(fā)病率和死亡率逐年升高[8]。膽管癌發(fā)病隱匿，確診時(shí)常為晚期，手術(shù)、化療和放療等傳統(tǒng)治療手段療效有限，因此發(fā)展膽管癌早期診斷（干預(yù)）與新靶向治療手段是膽管癌防治研究的重要方向。本研究通過構(gòu)建大鼠和小鼠原發(fā)肝內(nèi)膽管癌模型，模擬了包括膽管增生、膽管異型增生和膽管瘤，到最終形成膽管癌的人類膽管癌發(fā)生發(fā)展演變進(jìn)程。結(jié)果顯示，增生的膽管細(xì)胞和膽管癌細(xì)胞中高表達(dá)的SYK可能通過誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞極化和浸潤(rùn)，促進(jìn)膽管癌發(fā)生發(fā)展。

Figure 4.The infiltration of M2 macrophages was increased in two murine spontaneous induction models of cholangiocarcinoma（CCA）.Immunohistochemical analysis for M1 macrophages（iNOS）and M2 macrophages（CD163）infiltrating in rat（A）/mouse（B）CCA and normal liver tissues.The scale bar=100 μm.Red arrows indicate iNOS/CD163 positive cells.Mean±SD.n=5 in normal group；n=16 in CCA group.**P＜0.01 vs normal group.圖4 膽管癌自發(fā)誘導(dǎo)動(dòng)物模型中M2型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增加

Figure 5.Relationship between SYK expression and M2 macrophage infiltration in human cholangiocarcinoma（CCA）tissues.A：immunohistochemical（IHC）staining of SYK and CD163（M2 macrophage marker）in 48 human CCA tissues（peritumor and intratumor），and analysis of SYK IHC scores and CD163+M2 macrophage infiltration（red arrows indicate SYK/CD163 positive cells）；B：the expression of SYK is positively correlated with M2 macrophage infiltration in human CCA tissues；C：double immunofluorescence images for SYK（green）and CD163/iNOS（red）in normal and CCA liver tissues.The scale bar=100 μm.Mean±SD.**P＜0.01 vs normal group；##P＜0.01 vs peritumor group.圖5 人膽管癌組織中SYK表達(dá)與M2型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系

Figure 6.SYK inhibitor GS-9973 inhibited the tumor growth and M2 macrophage polarization in progressive rat model of cholangiocarcinoma（CCA）.Gross images，HE staining and immunohistochemical analysis for M2 macrophages（CD163）were shown.Red arrows indicate CD163 positive cells.The scale bar=100 μm.Mean±SD.n=5.**P＜0.01 vs vehicle group.圖6 SYK抑制劑GS-9973抑制大鼠膽管癌的腫瘤生長(zhǎng)和巨噬細(xì)胞M2型極化

SYK是一種非受體型酪氨酸激酶，正常生理?xiàng)l件下主要參與淋巴細(xì)胞成熟及免疫細(xì)胞活化[9]。近年來研究顯示，在免疫性疾病[10]、白血病[11]、乳腺癌[12]、肝癌[13]、卵巢癌[14]等病理過程中，SYK同樣發(fā)揮重要功能。我們前期研究結(jié)果顯示，肝纖維化組織中，SYK表達(dá)增高；SYK可促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的激活與增殖；靶向SYK可有效抑制動(dòng)物肝纖維化進(jìn)展及其肝癌發(fā)生，是治療肝臟纖維化的潛在靶點(diǎn)[6]。目前，已研發(fā)出多種SYK小分子化合物抑制劑，并應(yīng)用于多種疾?。ò愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性淋巴細(xì)胞白血病等）的Ⅱ/Ⅲ期臨床試驗(yàn)。

具有免疫抑制作用的M2型巨噬細(xì)胞，在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要促進(jìn)作用[15-16]。SYK參與了血液腫瘤和多種實(shí)體腫瘤的免疫應(yīng)答和反應(yīng)，對(duì)巨噬細(xì)胞的增殖分化及其產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)具有重要作用[17]。本課題組在前期關(guān)于肝纖維化的研究中觀察到：在大鼠膽管結(jié)扎模型中，由膽管結(jié)扎引起的增生膽管細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)SYK表達(dá)顯著升高，并且增生膽管周圍伴有M2型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增加。為進(jìn)一步研究增生膽管細(xì)胞中SYK高表達(dá)與M2型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系，以及對(duì)膽管癌發(fā)生發(fā)展的影響。在本研究中，我們構(gòu)建了兩種動(dòng)物膽管癌自發(fā)誘導(dǎo)模型，模擬了人膽管癌從膽管增生、膽管異型增生、膽管瘤，到最終形成膽管癌的演變過程。上述兩個(gè)動(dòng)物模型的結(jié)果顯示：隨著膽管癌的發(fā)生過程，SYK表達(dá)水平逐漸增高，提示SYK表達(dá)與膽管癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)；膽管癌中SYK異常表達(dá)伴隨M2型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)目增多，提示SYK可能參與誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化，這一結(jié)果在人膽管癌組織標(biāo)本中得到進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，TAA誘導(dǎo)的大鼠自發(fā)膽管癌模型給予SYK抑制劑處理，結(jié)果顯示SYK抑制劑可以顯著減少膽管癌組織中的M2型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，并抑制膽管癌發(fā)生發(fā)展。上述結(jié)果表明，隨著膽管癌的演變進(jìn)展，SYK表達(dá)逐漸升高，可能是通過影響巨噬細(xì)胞M2型極化促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，SYK抑制劑可以有效抑制腫瘤生長(zhǎng)和巨噬細(xì)胞M2型極化。

本研究表明，SYK異常表達(dá)與膽管癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)：在膽管癌發(fā)生早期，即膽管增生時(shí)就已經(jīng)出現(xiàn)SYK異常表達(dá)，并隨著病程進(jìn)展逐漸升高；而增生膽管細(xì)胞和膽管癌細(xì)胞中高表達(dá)的SYK可以通過誘導(dǎo)微環(huán)境M2型巨噬細(xì)胞極化與浸潤(rùn)進(jìn)，促進(jìn)膽管癌進(jìn)展。這些結(jié)果雖然揭示了膽管癌中SYK對(duì)M2型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的影響，但其具體調(diào)控機(jī)制仍不明確。有研究報(bào)道，巨噬細(xì)胞的極化依賴于PI3K信號(hào)通路，PI3K可引起腫瘤中致瘤性巨噬細(xì)胞（多數(shù)為M2型巨噬細(xì)胞）的增多。此外，SYK是激活巨噬細(xì)胞中PI3K所必需的，在PI3K的上游發(fā)揮重要作用?；蚯贸蛩幚硪种芐YK和PI3K，均可以阻斷腫瘤的生長(zhǎng)和巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制，激活先天性和適應(yīng)性抗腫瘤免疫力。因此，SYK可能通過PI3K通路影響腫瘤中巨噬細(xì)胞極化，是重要的腫瘤免疫學(xué)靶標(biāo)之一[18]。在后續(xù)研究中，本課題組將繼續(xù)深入探索膽管癌進(jìn)展中SYK的功能與調(diào)控機(jī)制，重點(diǎn)關(guān)注SYK對(duì)膽管癌細(xì)胞旁分泌細(xì)胞因子的影響與調(diào)控作用，以進(jìn)一步明確膽管癌細(xì)胞SYK影響M2型巨噬細(xì)胞極化的分子機(jī)制。

綜上所述，本研究提示SYK在膽管癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，可能成為膽管癌早期干預(yù)與靶向治療的潛在靶點(diǎn)。此外，我們還初步探討了膽管癌中SYK異常表達(dá)對(duì)巨噬細(xì)胞M2型極化的影響，為進(jìn)一步深入開展膽管癌SYK的具體調(diào)控機(jī)制提供了參考資料。