超高效液相色譜法測(cè)定人血漿替考拉寧濃度Δ

劉慧芳，王曉雪，陳文倩，秦 偉，張 丹，杜雯雯，李朋梅，張相林

(中日友好醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100029)

替考拉寧為糖肽類抗菌藥物，在臨床被用于治療各種嚴(yán)重的革蘭陽(yáng)性菌感染，與現(xiàn)有其他糖肽類藥物相比，其組織穿透率改善，而腎毒性顯著降低。特別是對(duì)于耐甲氧西林葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA)感染，替考拉寧可用于萬古霉素替代治療，安全有效[1-3]。負(fù)荷劑量給藥時(shí)，由于年齡、潛在疾病(如白血病)、腎功能及血清白蛋白水平等個(gè)體間差異，替考拉寧的血清濃度是高度可變的，因此，監(jiān)測(cè)其血藥濃度具有重要意義[4-5]。近年來，測(cè)定替考拉寧血藥濃度的方法主要有高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)[6-7]和液相色譜-質(zhì)譜法(liquid chromatograph mass spectrometry，LC-MS)[8-9]。與LC-MS相比，HPLC具有內(nèi)標(biāo)較易獲得、對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件要求低及臨床參考范圍明確等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于臨床治療藥物監(jiān)測(cè)。替考拉寧是主要由5個(gè)結(jié)構(gòu)近似的化合物(TA2-1、TA2-2、TA2-3、T2-4和TA2-5)組成的混合物，其中以 TA2-2為主，占各組分總含量的 40% 以上。目前主要有兩種定量方法：(1)將5種成分的峰面積加和進(jìn)行定量；(2)采用TA2-2的峰面積進(jìn)行定量計(jì)算。但何勐等[6]指出，上述兩種定量方法雖無顯著差異，但定量方法(1)會(huì)出現(xiàn) TA2-1、TA2-3、T2-4和TA2-5的峰檢測(cè)不到以及可能還會(huì)出現(xiàn)這4個(gè)峰與其他雜質(zhì)峰達(dá)不到有效分離[6]。本研究建立的超高效液相色譜法(ultra-performance liquid chromatography，UPLC)，以TA2-2為考察對(duì)象，簡(jiǎn)化了血漿前處理方法，以對(duì)羥基苯甲酸甲酯為內(nèi)標(biāo)，具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確且可靠的特點(diǎn)及內(nèi)標(biāo)穩(wěn)定的優(yōu)勢(shì)，更加適合替考拉寧的血藥濃度測(cè)定，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料

1.1 儀器

UPLC儀(日本島津公司)，LC-20AD泵、DGU-12AS在線脫氣機(jī)、SIL-20AC自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-20 A柱溫箱、CBM-20 A系統(tǒng)控制器、SPD-M20 A 檢測(cè)器及LabSolutians 色譜工作站；JingLi LDZ5-2型低速自動(dòng)平衡離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)；Sigma 3K15型超高速離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)；CPA225D型萬分之一電子分析天平(德國(guó) Sartorius公司)； Vortex Genie 2型多用途旋渦混合器(美國(guó)Scientific Industries公司)；Milli-Q Advantage A10型純水機(jī)(法國(guó)Millipore公司)。

1.2 藥品與試劑

替考拉寧對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為130374-201002，每1 mg含894 IU)、對(duì)羥基苯甲酸甲酯對(duì)照品(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為20160509，純度≥98.5%)；甲醇、乙腈均為色譜純(Fisher Scientific，美國(guó))；NaH2PO4為分析純；實(shí)驗(yàn)用水均為Millipore超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為 Waters Symmetry C18柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)柱，流動(dòng)相為0.01 mol/L的NaH2PO4(pH=3.3)-乙腈(V∶V=77∶23)，檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm，流速為1.0 ml/min，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為10 μl。

2.2 替考拉寧儲(chǔ)備液的制備

精密稱取替考拉寧對(duì)照品20.65 mg，置于100 ml容量瓶中，加10%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成 2.065 mg/ml的溶液，分裝并于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 內(nèi)標(biāo)溶液的制備

精密稱取對(duì)羥基苯甲酸甲酯對(duì)照品51.07 mg，置于50 ml 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得1.0 214 mg/ml的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，取內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液1 ml，置于10 ml 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得102.14 μg/ml 內(nèi)標(biāo)溶液，分裝并于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)量控制(quality control，QC)樣品制備

吸取空白血漿950 μl于1.5 ml離心管中，精密加入替考拉寧儲(chǔ)備液50 μl，用空白血漿進(jìn)行等比稀釋，分別配制成質(zhì)量濃度為103.25、51.63、25.81、12.91、6.45及3.23 μg/ml的系列溶液作為標(biāo)準(zhǔn)曲線點(diǎn)。另取空白血漿適量，加入替考拉寧儲(chǔ)備液，依次配制為34.42、11.47及3.84 μg/ml的高、中及低3個(gè)質(zhì)量濃度的QC樣品。

2.5 血漿樣品前處理

取血漿樣品 200 μl于離心管中，加內(nèi)標(biāo)溶液(102.14 μg/ml)20 μl、90%乙腈300 μl，渦旋混勻5 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液10 μl進(jìn)樣檢測(cè)。

2.6 專屬性考察

替考拉寧和內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液稀釋后直接進(jìn)樣測(cè)定；空白血漿、空白血漿+替考拉寧標(biāo)準(zhǔn)液+內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)液及患者血漿+內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)液按照“2.5”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析，見圖1(圖中標(biāo)示TKLN為TA2-2的峰，IS為對(duì)羥基苯甲酸甲酯的峰)。結(jié)果表明，替考拉寧TA2-2與內(nèi)標(biāo)基線分離且峰形良好，空白血漿中未見干擾。

A.替考拉寧標(biāo)準(zhǔn)液；B.內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)液；C.空白血漿；D.空白血漿+替考拉寧標(biāo)準(zhǔn)液+內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)液；E.患者血漿+內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)液A.standard liquid of teicoplanin; B.Internal standard liquid; C.blank plasma; D.blank plasma+standard liquid of teicoplanin+internal standard liquid; E.patient’s plasma+internal standard liquid

2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將“2.4”項(xiàng)下制備的作為標(biāo)準(zhǔn)曲線點(diǎn)的系列溶液，按“2.5”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣檢測(cè)，以替考拉寧TA2-2組分與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(Y)為橫坐標(biāo)，替考拉寧的質(zhì)量濃度(X)為縱坐標(biāo)，繪制線性回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為:Y=19.092X+0.408 7，r2=0.999 7，替考拉寧質(zhì)量濃度在3.23～103.25 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，此方法的定量限為3.23 μg/ml。

2.8 提取回收率考察

A為替考拉寧3個(gè)質(zhì)量濃度QC樣品；B為用流動(dòng)相稀釋制備與A質(zhì)量濃度相同的低、中及高3個(gè)濃度的替考拉寧標(biāo)準(zhǔn)溶液樣本；分別平行制備5份。均按“2.5”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析，計(jì)算提取回收率。計(jì)算方法為：提取回收率=峰面積A/峰面積B×100%，結(jié)果見表1。

表1 提取回收率結(jié)果(n=5)

2.9 準(zhǔn)確度和精密度考察

取替考拉寧3個(gè)質(zhì)量濃度的QC樣品，每個(gè)質(zhì)量濃度5份，按“2.5”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析，連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算批內(nèi)和批間變異。結(jié)果見表2，表明此方法的準(zhǔn)確度和精密度符合要求。

表2 替考拉寧測(cè)定方法的準(zhǔn)確度、精密度結(jié)果(n=5)

2.10 穩(wěn)定性考察

(1)取患者血漿樣本，按“2.5”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣測(cè)定；在室溫(25 ℃)下存放 24 h 后，再按“2.5”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果無顯著差別(RSD<15%)，表明室溫條件下放置 24 h 穩(wěn)定。(2)反復(fù)凍融試驗(yàn)：低、中及高3 個(gè)質(zhì)量濃度的含藥血漿樣本，-20 ℃冷凍保存，融化放至室溫，再次冷凍24 h，融化至室溫后，按“2.5”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析，結(jié)果表明，凍融穩(wěn)定性良好(RSD<15%)。(3)長(zhǎng)期穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：低、中及高3 個(gè)質(zhì)量濃度的含藥血漿樣本，-80 ℃冷凍保存3個(gè)月，融化至室溫后，按“2.5”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析，結(jié)果表明，長(zhǎng)期穩(wěn)定性良好(RSD<15%)。

2.11 臨床樣本測(cè)定

收集中日友好醫(yī)院15例臨床患者樣本，測(cè)得替考拉寧谷濃度(Cmin)結(jié)果見圖2。替考拉寧平均Cmin為(17.990±9.991)μg/ml；其中，<10 μg/ml者3例，占 20%，10～30 μg/ml者11 例，占 73.33%，>40 μg/ml者1例，占 6.67%。按照替考拉寧藥品說明書中參考值：對(duì)于大多數(shù)革蘭陽(yáng)性菌感染，替考拉寧谷濃度應(yīng)至少達(dá)到10 μg/ml；對(duì)于心內(nèi)膜或其他重癥感染，替考拉寧谷濃度應(yīng)達(dá)到15～30 μg/ml。由此可見，15例患者中至少有3例患者仍需根據(jù)病情程度調(diào)整給藥劑量，及時(shí)給予足夠的替考拉寧負(fù)荷劑量，提高臨床療效。

圖2 臨床患者樣本測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 血漿樣品預(yù)處理方式的選擇

文獻(xiàn)報(bào)道的替考拉寧預(yù)處理方法多為乙腈沉淀蛋白后，二氯甲烷或三氯甲烷萃取法[6]。但考慮到萃取法成本高且操作繁瑣，本研究在預(yù)處理方法的選擇上比較了乙腈、甲醇、5%高氯酸和乙腈(含0.1%甲酸，V/V)四種溶劑。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用乙腈進(jìn)行預(yù)處理的信號(hào)較高，但不成比例?？紤]到替考拉寧易溶于水，因此，比較了不同比例乙腈沉淀蛋白的提取回收率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，預(yù)處理方法采用90%乙腈沉淀蛋白時(shí)的提取回收率最高，故本研究采用90%乙腈直接沉淀蛋白進(jìn)行樣本預(yù)處理。該方法操作簡(jiǎn)便，極大提高了工作效率。

3.2 內(nèi)標(biāo)的選擇

內(nèi)標(biāo)物質(zhì)應(yīng)具有性質(zhì)穩(wěn)定、方便獲得且臨床樣本中無干擾等特點(diǎn)。目前，文獻(xiàn)中多采用哌拉西林作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)[6]。但哌拉西林溶液的穩(wěn)定性較差、出峰時(shí)間容易受pH的影響且患者樣本中容易有外源藥物的干擾，因此，對(duì)樣本、實(shí)驗(yàn)過程及流動(dòng)相配制過程都要求嚴(yán)格。本研究采用對(duì)羥基苯甲酸甲酯作為內(nèi)標(biāo)，不僅可以最大程度減少外源性藥物的干擾，而且室溫下24 h穩(wěn)定性良好(RSD<5%)。

3.3 臨床應(yīng)用

本研究建立的替考拉寧血藥濃度UPLC測(cè)定法，已應(yīng)用于臨床患者樣本測(cè)定。該方法快速、準(zhǔn)確、可靠，可以用于臨床復(fù)雜用藥患者的血藥濃度監(jiān)測(cè)。負(fù)荷劑量給藥時(shí)，能使多數(shù)患者達(dá)到治療相關(guān)谷濃度(≥10 μg/ml)，但仍有患者血藥濃度低于治療范圍。因此，根據(jù)替考拉寧的血藥濃度給予個(gè)體化負(fù)荷劑量具有重要意義。

綜上所述，本研究采用對(duì)羥基苯甲酸甲酯做內(nèi)標(biāo)，采用90%乙腈直接沉淀蛋白進(jìn)行樣本前處理，建立了基于UPLC的人血漿中替考拉寧定量分析方法。該方法快速、穩(wěn)定，可以用于臨床治療藥物監(jiān)測(cè)。