曲克蘆丁及其代謝產(chǎn)物在大鼠體內(nèi)的排泄動(dòng)力學(xué)研究

余芳，金涌

作者單位：安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥230032

曲克蘆丁是黃酮類化合物蘆丁的半合成衍生物，可以抑制血小板凝集，防止血栓形成，具有抗氧化、抗炎、抗化學(xué)性肝損傷等一系列藥理作用；是臨床上用來治療慢性靜脈功能不全、毛細(xì)管出血、腦血栓等疾病的常用藥物[1-6]。近年來對(duì)曲克蘆丁的研究主要集中在藥理作用和作用機(jī)制等方面[7-10]，關(guān)于其代謝方面的研究知之甚少。曲克蘆丁在大鼠和人體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究表明曲克蘆丁口服吸收差，生物利用度低，臨床應(yīng)用不良反應(yīng)較多[11-12]。我們前期的研究結(jié)果表明曲克蘆丁在體內(nèi)主要被腸道菌群代謝脫去蕓香糖成曲克蘆丁苷元[13]。因此弄清曲克蘆丁及其代謝產(chǎn)物在體內(nèi)的排泄情況是研究曲克蘆丁的一個(gè)非常重要的補(bǔ)充。本研究起止時(shí)間為2018年7月至2019年3月，針對(duì)大鼠腹腔注射曲克蘆丁后其在尿液、膽汁和糞便樣品中的排泄情況，以及曲克蘆丁代謝產(chǎn)物在糞便中的生成量，探討了曲克蘆丁在體內(nèi)的一般排泄規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 LC-20A高效液相色譜儀（日本島津公司）；Neofuge23R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（力康發(fā)展有限公司）；KQ-500DE型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；XW-80A渦旋振蕩器（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）。

曲克蘆丁原料藥（阿拉丁試劑有限公司，生產(chǎn)批號(hào)T101630）；蘆丁對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，生產(chǎn)批號(hào)100080-201811，）、曲克蘆丁對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，生產(chǎn)批號(hào)100416-201607）；甲醇（天津四友精細(xì)化學(xué)品公司，生產(chǎn)批號(hào)0113180403，色譜純）；其他試劑為分析純。

健康雄性SD大鼠5只，體質(zhì)量范圍為（250±50）g，（安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)合格證號(hào)：皖醫(yī)實(shí)動(dòng)準(zhǔn)字第01號(hào)）。

1.2 色譜條件 色譜柱為Shim-pack ODS C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；內(nèi)標(biāo)物為蘆?。涣魉贋?.0 mL/min；柱溫40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)350 nm；流動(dòng)相為甲醇（A）和1.7%冰醋酸（B），梯度洗脫（0～15 min，41%A；15～30 min，41%～65%A；30～40 min，65%～41%A）；進(jìn)樣量20 μL。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑和溶液配制

1.3.1 藥物溶液的配制 用0.9%的生理鹽水將曲克蘆丁制成5.25 mg/mL的溶液，臨用前配制。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取蘆丁、曲克蘆丁、曲克蘆丁苷元對(duì)照品，用甲醇配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4℃保存。

1.4 給藥與樣品采集

1.4.1 尿液和糞便 SD大鼠5只，雄性，分別置于5只代謝籠中，給藥前12 h禁食，不禁水，收集空白尿液、糞便。腹腔注射曲克蘆丁，劑量為52.5 mg/kg，分別收集0～2 h、2～4 h、4～8 h、8～12 h、12～24 h的尿液和糞便，測(cè)定尿液容積后置于-20℃冰箱保存。糞便烘干研碎稱重后置于-20℃冰箱保存。

1.4.2 膽汁 SD大鼠5只，雄性，給藥前12 h禁食，不禁水。腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉后，仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，做膽管插管引流術(shù)，見有膽汁穩(wěn)定流出后，收集空白膽汁。收集一段時(shí)間后腹腔注射曲克蘆丁，劑量為52.5 mg/kg，分別收集0～1 h、1～2 h、2～4 h、4～8 h、8～12 h的膽汁，測(cè)定膽汁容積后置于-20℃冰箱保存。實(shí)驗(yàn)中腹腔注射2 mL生理鹽水以補(bǔ)充體液。

1.5 樣品預(yù)處理

1.5.1 尿液樣品預(yù)處理 分別精密吸取尿液樣品、內(nèi)標(biāo)蘆丁溶液100 μL于1.5 mL離心管中，加入100 μL甲醇，渦旋震蕩1 min使之充分混勻，10 000 r/min離心10 min。精密吸取200 μL上清液于另一干凈離心管中供高效液相色譜法（HPLC）檢測(cè)。

1.5.2 糞便樣品預(yù)處理 取大鼠糞便樣品，加2倍量生理鹽水，超聲10 min，制成勻漿，4 000 r/min離心10 min后取上清液。糞便精密吸取糞便勻漿上清液、內(nèi)標(biāo)蘆丁溶液100 μL于1.5 mL離心管中，加入100 μL甲醇，渦旋震蕩1 min使之充分混勻，10 000 r/min離心10 min。精密吸取200 μL上清液于另一干凈離心管中供HPLC檢測(cè)。

1.5.3 膽汁樣品預(yù)處理 分別精密吸取膽汁樣品、內(nèi)標(biāo)蘆丁溶液100 μL于1.5 mL離心管中，加入甲醇100 μL，渦旋震蕩1 min使之充分混勻，10 000 r/min離心10 min。精密吸取200 μL上清液于另一干凈離心管中供HPLC檢測(cè)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 方法學(xué)結(jié)果

2.1.1 專屬性考查 分別取空白尿液、空白糞便勻漿和空白膽汁，空白尿液、空白糞便勻漿和空白膽汁加曲克蘆丁和內(nèi)標(biāo)蘆丁對(duì)照品溶液，以及給藥后的樣品溶液，按“1.5”項(xiàng)下樣品預(yù)處理方法操作，進(jìn)樣分析，得到相應(yīng)的色譜圖。由圖可知，內(nèi)標(biāo)蘆丁和曲克蘆丁在大鼠空白尿液、空白糞便勻漿和空白膽汁中的保留時(shí)間分別為12 min和15 min左右，曲克蘆丁苷元的保留時(shí)間為35 min左右，分離度符合要求，雜質(zhì)不影響測(cè)定。

2.1.2 線性關(guān)系 分別取空白尿液、空白糞便勻漿和空白膽汁，加入曲克蘆丁儲(chǔ)備液，制成0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、100.0、500.0、1 000.0 μg/mL的尿液樣品；0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 μg/mL的糞便樣品；0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、100.0、500.0、1 500.0 μg/mL的膽汁樣品；取空白糞便勻漿，加入曲克蘆丁苷元儲(chǔ)備液，制成0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、80.0、400.0、800.0 μg/mL的糞便樣品，按“1.5”項(xiàng)下樣品預(yù)處理方法操作。橫坐標(biāo)為曲克蘆丁和曲克蘆丁苷元的濃度，縱坐標(biāo)為曲克蘆丁、曲克蘆丁苷元與內(nèi)標(biāo)蘆丁的峰面積比值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。曲克蘆丁在尿液、糞便和膽汁中的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為y＝0.0455x-0.0837（r＝0.999 8，線性范圍0.1～1 000.0 μg/mL）、y＝0.057 7x-0.051 5（r＝0.999 4，線性范圍0.1～80.0 μg/mL）、y＝0.043 3x+0.141 9（r＝0.999 9，線性范圍0.1～1 500.0 μg/mL）；曲克蘆丁苷元在糞便中的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝0.053 8x-0.076 3（r＝0.999 1，線性范圍 0.1～800.0 μg/mL）。

2.1.3 回收率和精密度 分別取空白尿液、空白糞便勻漿、空白膽汁，加入曲克蘆丁對(duì)照品溶液，制成0.5、10.0、60.0 μg/mL的低、中、高三個(gè)濃度樣品，每個(gè)濃度制備5個(gè)樣品，按“1.5”項(xiàng)下樣品預(yù)處理方法進(jìn)行處理后進(jìn)樣，計(jì)算方法回收率。取空白糞便勻漿，加入曲克蘆丁苷元對(duì)照品溶液，制成0.5、10.0、60.0 μg/mL低、中、高三個(gè)濃度樣品，每個(gè)濃度制備5個(gè)樣品，按“1.5”項(xiàng)下樣品預(yù)處理方法進(jìn)行處理后進(jìn)樣，計(jì)算方法回收率。同時(shí)制備0.5、10.0、60.0 μg/mL曲克蘆丁和曲克蘆丁苷元對(duì)照品溶液，直接進(jìn)樣。同等濃度尿液、糞便勻漿、膽汁中曲克蘆丁的峰面積和曲克蘆丁對(duì)照品峰面積的比值為提取回收率。同法配制低、中、濃度的尿液、糞便、膽汁樣品，按“1.5”項(xiàng)下處理后進(jìn)樣，同日和連續(xù)5 d各測(cè)定5份樣品。計(jì)算日內(nèi)和日間精密度。結(jié)果，曲克蘆丁在尿液中低中高濃度的方法回收率分別為（104.10±9.62）%，（98.05±6.29）%，（92.67±3.34）%（n＝5），提取回收率分別為（84.01±11.54）%，（85.47±7.82）%，（81.93±8.38）%（n＝5）；日內(nèi)精密度分別為9.82%，7.51%，6.13%；日間精密度分別為5.46%，9.37%，8.25%。曲克蘆丁在糞便中低中高濃度的方法回收率分別為（90.0±6.67）%，（96.1±5.46）%，（93.19±7.22）%（n＝5），提取回收率分別為（78.05±11.11）%，（82.64±7.08）%，（72.95±8.66）%（n＝5）；日內(nèi)精密度分別為8.66%，10.41%，7.75%；日間精密度分別為7.94%，10.27%，9.98%。曲克蘆丁在膽汁中低中高濃度的方法回收率分別為（94.15±8.51）%，（96.31±7.76）%，（96.59±3.80）%（n＝5）；提取回收率分別 為（74.10±10.64）% ，（83.26±8.80）%，（82.75±7.88）%；日內(nèi)精密度分別為10.12%，8.53%，8.56%；日間精密度分別為8.62%，9.73%，10.64%。曲克蘆丁苷元在糞便中低中濃度的方法回收率分別為（90.20±10.51）% ，（95.32±9.68）% ，（100.08±7.66）%（n＝5）；%，提取回收率分別為（82.07±9.23）%，（77.62±11.28）%，（80.70±11.59）%（n＝5）；日內(nèi)精密度分別為6.09%，4.45%，3.35%；日間精密度分別為5.63%，5.17%，7.06%。

2.1.4 定量限和檢測(cè)限 取曲克蘆丁對(duì)照品儲(chǔ)備液分別用尿液、糞便和膽汁稀釋，曲克蘆丁苷元對(duì)照品儲(chǔ)備液用糞便稀釋，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，以S/N＝10計(jì)算，曲克蘆丁在尿液、糞便和膽汁中的定量限分別為0.17、0.11、0.14 μg/mL，曲克蘆丁苷元在糞便中的定量限為0.13 μg/mL；以S/N＝3計(jì)算，曲克蘆丁在尿液、糞便和膽汁中的檢測(cè)限分別為0.051、0.033、0.042 μg/mL，曲克蘆丁苷元在糞便中的檢測(cè)限為0.039 μg/mL。

2.2 排泄結(jié)果

2.2.1 尿液樣品中的排泄情況 大鼠腹腔注射曲克蘆丁52.5 mg/kg后，尿液中曲克蘆丁的累積排泄率為（16.17±10.28）%。見圖2。

2.2.2 糞便樣品中的排泄情況 結(jié)果表明曲克蘆丁大鼠腹腔注射曲克蘆丁52.5 mg/kg后，糞便中曲克蘆丁原型藥物的累積排泄率為（0.54±0.47）%，見圖2。曲克蘆丁代謝物曲克蘆丁苷元的累積生成量為（22.69±12.48）%，見圖3。

圖1 曲克蘆丁和曲克蘆丁苷元在大鼠尿液、糞便和膽汁中的高效液相色譜圖：A為空白尿液，B為空白尿液加對(duì)照品，C為給藥后尿液樣品，D為空白糞便，E為空白糞便加對(duì)照品，F(xiàn)為給藥后糞便樣品，G為空白膽汁，H為空白膽汁加對(duì)照品，I為給藥后膽汁樣品 圖2 大鼠腹腔注射給藥后曲克蘆丁在大鼠尿液、糞便和膽汁中的累積排泄率 圖3 曲克蘆丁苷元在大鼠糞便中的累積生成率

2.2.3 膽汁樣品中的排泄情況 大鼠腹腔注射曲克蘆丁52.5 mg/kg后，膽汁中曲克蘆丁的累積排泄率為（58.94±13.37）%。見圖2。

3 討論

新藥開發(fā)與研究中有很多重要的環(huán)節(jié)，其中藥動(dòng)學(xué)研究是不可或缺的一環(huán)。影響藥物的生物利用度的一個(gè)重要因素就是藥物在體內(nèi)的代謝情況[14]。近年來，曲克蘆丁在大鼠體內(nèi)的排泄動(dòng)力學(xué)及組織分布已有報(bào)道[15]，在人[11-12]和Beagle犬[16]體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)也有相關(guān)研究。但曲克蘆丁和其代謝產(chǎn)物在大鼠體內(nèi)的排泄動(dòng)力學(xué)尚未見相關(guān)研究。因此，本研究以大鼠為研究對(duì)象，腹腔注射曲克蘆丁后，對(duì)其在大鼠尿液、糞便和膽汁中的排泄與代謝進(jìn)行了研究。

本研究中大鼠腹腔注射曲克蘆丁52.5 mg/kg后，曲克蘆丁在大鼠尿液（24 h）、糞便（24 h）和膽汁（12 h）中的累積排泄分?jǐn)?shù)分別為（16.17±10.28）%、（0.54±0.47）% 和（58.94±13.37）% ，總 量 約 為76.00%；大鼠糞便中曲克蘆丁代謝產(chǎn)物曲克蘆丁苷元的累積生成量為（22.69±12.48）%。本研究結(jié)果表明，曲克蘆丁主要通過膽汁進(jìn)行排泄；最后在糞便中生成代謝產(chǎn)物排出體外。這是因?yàn)橄鄬?duì)分子質(zhì)量大于300并且有極性基團(tuán)的藥物主要通過膽汁排到腸道，最后隨糞便排出體外。腸道中有著種類豐富的腸道菌群[17]，糖苷類化合物可被腸道中的微生物水解生成苷元[18-19]。曲克蘆丁結(jié)構(gòu)中存在著糖苷鍵，容易被腸道菌群水解釋放出苷元。同時(shí)糖苷鍵在酸性環(huán)境下容易水解，曲克蘆丁口服進(jìn)入體內(nèi)后在胃腸道內(nèi)發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化，這可能是曲克蘆丁血藥濃度低的一個(gè)重要因素。因此后續(xù)的工作將圍繞曲克蘆丁口服后的吸收機(jī)理和在體內(nèi)的轉(zhuǎn)化進(jìn)行展開，以期弄清曲克蘆丁在體內(nèi)發(fā)揮藥效的作用機(jī)制。