鉬酸鈉和抑制劑鎢酸鈉對草莓幼苗氮代謝關(guān)鍵酶與15N吸收利用的影響

劉利，韓真，李勃，陶吉寒

（山東省果樹研究所，山東 泰安 271000）

鉬（Mo）是植物正常生長發(fā)育不可或缺的一種微量元素［1，2］。Mo的化合價從0到+6價皆有［2］，在底物和輔酶因子（如鐵硫簇、血紅素和黃素類等）之間起電子傳遞的作用。植物主要從土壤中吸收+6價的鉬酸根（MoO2-4）以滿足正常生長發(fā)育所需［2］。鉬單獨存在于植物體內(nèi)并不具有生物活性，而是以鉬酶的形式參與到體內(nèi)的氧化還原反應(yīng)過程中［1，3-5］。植物中的鉬酶有5種，分別是硝酸鹽還原酶（nitrate reductase，NR）、黃嘌呤脫氫酶（xanthine dehydrogenase，XDH）、醛氧化酶（aldehyde oxidase，AO）、亞硫酸鹽氧化酶（sulfite oxidase，SO）和線粒體氨肟還原蛋白（mitochondrial amidoxime reducing component，mARC）［6-8］。植物通過這些鉬酶參與到氮、碳、嘌呤、激素和硫的代謝過程中，鉬在植物的氮代謝過程中發(fā)揮著重要作用，參與到氮素固定、氮素還原和氮素同化過程中［3］。鉬缺乏可能導(dǎo)致植物中硝酸鹽積累，進(jìn)而影響植物的正常生長發(fā)育。

世界上很多地方土壤中的有效Mo含量不能滿足植物正常生長發(fā)育所需，對于酸性土壤這一現(xiàn)象尤其嚴(yán)重［9］。在我國有大約4 400多萬公頃耕地缺Mo［10］，生長在有效Mo含量低的酸性黃棕壤上的冬小麥等作物出現(xiàn)了嚴(yán)重的缺Mo癥狀［11］。Mo缺乏的癥狀有鉬酶活性降低、氮饑餓反應(yīng)、莖和葉發(fā)育受阻、葉枯斑病、種子發(fā)育不良、坐果率降低等［2，9，12］。研究發(fā)現(xiàn)，鉬可以提高水稻、小麥和煙草的硝酸還原酶活性，促進(jìn)氮代謝，從而得出施鉬可以提高氮素利用率［13-15］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，葉面噴施合適濃度的鉬酸鈉可以提高葉片和根系的硝酸還原酶、亞硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合酶活性，然后用Ca（15NO3）2同位素示蹤法直接證明了合適濃度的鉬提高了草莓植株的15N利用率［16］。為了進(jìn)一步研究鉬酸鈉對草莓氮代謝的影響，本試驗中我們使用鉬酸鈉和鉬的抑制劑鎢酸鈉研究其對幼苗生長發(fā)育和氮代謝關(guān)鍵酶活性以及15N吸收及利用的影響，以期為草莓生產(chǎn)上合理施用氮肥和鉬肥提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設(shè)計

試驗于2019年10—12月在濟(jì)南市歷城區(qū)董家草莓試驗站日光溫室內(nèi)進(jìn)行。草莓供試品種為‘章 姬’（Fragaria ananassa Duch.cv.‘Akihime’）。選取生長勢一致的幼苗定植于栽培槽中，每個槽內(nèi)定植2行，株距15 cm左右，共定植8棵，每個處理24棵。利用改良后的不含鉬元素的霍格蘭營養(yǎng)液培養(yǎng)，每隔2 d換一次營養(yǎng)液。試驗所有溶液均用蒸餾水配制。待幼苗長到10～15片真葉時，選取生長一致的幼苗用蒸餾水進(jìn)行饑餓處理7 d，然后進(jìn)行試驗處理。

試驗分為3個處理：①CK（-Na2MoO4-Na2WO4），②Mo處理（+2.4 mmol·L-1+2.4 mmol·L-1Na2MoO460 mL），③W 處理（+2.4 mmol·L-1Na2MoO460 mL+2.4 mmol·L-1Na2WO460 mL）。Mo和W 處理每隔7 d噴施一次，一共噴施3次。然后分別用含Ca（15NO3）2（上海化工研究院生產(chǎn)，豐度為10.20%）但不含鉬的全硝態(tài)氮霍格蘭營養(yǎng)液培養(yǎng)。每個處理設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，45 d后取樣測定植株鉬含量、氮代謝關(guān)鍵酶活性和15N的分配、吸收及利用。

1.2 測定項目與方法

1.2.1 植株鉬含量 參照Wang等［17］的方法進(jìn)行測定。稱取草莓植株干樣0.3 g于消解管中，加入5 mL優(yōu)級純濃硝酸浸泡過夜后，再加入2 mL優(yōu)級純雙氧水，采用微波消解萃取儀進(jìn)行消解，消解完全冷卻后轉(zhuǎn)移至比色管中，用超純水定容至50 mL，放置過夜即可得樣品待測液；同時采用相同消解方法制備空白對照。用NexION 300X型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測定。

1.2.2 根系活力 采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法［18］測定。TTC可以被植物的根系還原，其還原量表示脫氫酶活性，作為根系活力的指標(biāo)。

1.2.3 葉綠素含量 利用分光光度法［18］測定。取新鮮的草莓葉片，清洗干凈，剪碎；稱取3份0.2 g剪碎的葉片分別放入研缽中研成勻漿，研磨時加入少量石英砂和碳酸鈣粉及3 mL 96%乙醇，研磨至變白，放置4 min左右過濾到25 mL棕色容量瓶中，反復(fù)沖洗干凈研缽，沖洗過濾液均合并至容量瓶中，定容搖勻；以96%乙醇作空白，在波長665、649、470 nm 下測定吸光度，根據(jù)公式（Ca＝13.95D665-6.88D649，Cb＝24.96D649-7.32D665，CT＝Ca+Cb）分別計算葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總量CT的含量。

1.2.4 硝酸還原酶（NR）活性 采用分光光度法測定。硝酸還原酶活性可以由產(chǎn)生的亞硝態(tài)氮的量表示。將草莓幼苗的根、莖和葉片清洗干凈后，每個樣品稱取1.0 g，放在研缽里研磨，參照Pinto等［19］的方法用6 mL提取緩沖液提取，4℃、8 000×g離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)入試管中并編號，于540 nm測定吸光度，以每克鮮樣每小時產(chǎn)生的亞硝態(tài)氮含量（μg·g-1FW·h-1）表示NR活性。

1.2.5 亞硝酸還原酶（NiR）活性 參照Rao等［20］及Ozawa和Kawahigashi［21］的方法測定。取0.5 g新鮮的草莓組織樣品（地上部和地下部），剪碎放入預(yù)冷的研缽中，加入5 mL提取液充分研磨，紗布過濾，收集勻漿液離心獲得上清液即粗酶液。反應(yīng)混合液包含0.1 mol·L-1磷酸緩沖液（pH 7.5）1 mL，10 mmol·L-1KNO20.05 mL，15 mg·mL-1甲基紫晶0.05 mL，粗酶液0.2 mL和50 mg·mL-1溶解在100 mmol·L-1NaHCO3的連二亞硫酸鈉（Na2S2O4）。此混合液在25℃下保溫半小時直至甲基紫晶的顏色消失。反應(yīng)剩余的的量用下述方法測定：上述反應(yīng)剩余液0.2 mL，水6.5 mL，10%（w/v）磺胺（溶于濃HCl中）1.8 mL，1%（w/v）萘乙二胺1.5 mL。搖勻后在30℃下黑暗保溫30 min，然后在540 nm波長下比色。

1.2.6 谷氨酰胺合成酶（GS）活性 參照趙世杰等［18］的方法測定。

1.2.7 谷氨酸合酶（NADH-GOGAT）活性 參照Singh和Srivastava［22］的方法測定。以每分鐘每毫克反應(yīng)混合液于30℃減少1μmol NADH為一個酶活單位。

1.2.815N利用率 將植株分成根部和地上部，放入烘箱中于105℃殺青30 min，80℃烘干至恒重，稱重，研磨粉碎后過0.25 mm篩，裝袋備用。植株全氮用凱氏定氮法測定［23］，15N豐度在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院原子能利用研究所用MAT-251質(zhì)譜儀（美國菲尼根公司）測定。

15N利用率（%）＝器官15N吸收量（g）/施肥量（g）×100；

器官15N吸收量（g）＝Ndff×器官全氮量（g）；

Ndff（%）＝［植物樣品中15N豐度（%）-15N自然豐度（%）］/［肥料中15N豐度（%）-15N自然豐度（%）］×100；

氮肥分配率（%）＝各器官從氮肥中吸收的氮量（g）/總吸收氮量（g）×100；

器官全氮量（g）＝器官生物量（g）×氮含量（%）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，LSD法進(jìn)行差異顯著性檢驗，應(yīng)用Microsoft Excel 2003繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 鉬酸鈉及抑制劑鎢酸鈉對草莓幼苗Mo濃度的影響

由圖1可知，Mo處理的幼苗根部和地上部Mo濃度均最高，顯著高于CK和W 處理，其中根部的Mo濃度顯著高于地上部；W 處理地上部和根部的Mo濃度與CK無顯著差異。

圖1 鉬酸鈉及抑制劑鎢酸鈉對草莓幼苗地上、地下部鉬濃度的影響

2.2 鉬酸鈉及抑制劑鎢酸鈉對草莓幼苗根系活力和葉綠素含量的影響

根系活力的高低直接影響植物對礦質(zhì)元素的吸收和地上部的生長。由圖2和圖3可以看出，Mo處理的幼苗根系活力和葉綠素含量最高，顯著高于其它處理；W 處理的幼苗根系活力和葉綠素含量低于CK，其中葉綠素含量顯著低于CK。表明培養(yǎng)基中加入鉬酸鈉有利于促進(jìn)草莓幼苗的生長。

2.3 鉬酸鈉及其抑制劑鎢酸鈉對草莓幼苗氮代謝關(guān)鍵酶活性的影響

Mo處理顯著提高草莓幼苗地上部和根部NR、NiR、GS和NADH-GOGAT活性，而W 處理則降低其地上部和根部NR、NiR、GS和NADHGOGAT活性，而且根部NR、NiR 和NADHGOGAT活性的降幅達(dá)顯著水平（圖4—圖7）。表明培養(yǎng)基中加入鉬酸鈉有利于硝態(tài)氮的同化作用，而加入抑制劑鎢酸鈉后，由于鎢取代了鉬，使得硝酸還原酶活性降低，硝態(tài)氮的同化作用受到抑制。

圖2 鉬酸鈉及抑制劑鎢酸鈉對草莓幼苗根系活力的影響

圖3 鉬酸鈉及抑制劑鎢酸鈉對草莓幼苗葉綠素含量的影響

圖4 鉬酸鈉及抑制劑鎢酸鈉對草莓幼苗地上部（A1）和根部（A2）NR活性的影響

圖5 鉬酸鈉及抑制劑鎢酸鈉對草莓幼苗地上部（B1）和根部（B2）NiR活性的影響

圖6 鉬酸鈉及抑制劑鎢酸鈉對草莓幼苗地上部（C1）和根部（C2）GS活性的影響

2.4 鉬酸鈉及其抑制劑鎢酸鈉對草莓幼苗15 N利用率的影響

同位素15N-Ca（NO3）2標(biāo)記表明，Mo處理的草莓幼苗15N利用率顯著高于其它處理，而W 處理幼苗中15N利用率顯著降低（圖8）。

圖7 鉬酸鈉及抑制劑鎢酸鈉對草莓幼苗地上部（D1）和根部（D2）NADH-GOGAT活性的影響

圖8 鉬酸鈉及抑制劑鎢酸鈉對草莓幼苗15 N利用率的影響

3 討論與結(jié)論

Mo是NR的活性成分，參與硝態(tài)氮還原為亞硝態(tài)氮的電子轉(zhuǎn)移過程［2］；鎢與Mo的性質(zhì)相似，能夠直接取代Moco（molybdenum cofactor）中的Mo，從而抑制NR活性，影響氮代謝過程［24］。葉面噴施鉬酸鈉能夠提高草莓幼苗的氮同化能力，進(jìn)而碳同化的能力也得到加強(qiáng)，發(fā)揮以氮增碳的作用，使得草莓幼苗長勢較好，葉片為正常綠色。對培養(yǎng)基中加入抑制劑鎢酸鈉進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)只加鎢酸鈉的培養(yǎng)基上的幼苗株型變小，長勢減弱，部分葉片表現(xiàn)為黃色，出現(xiàn)與氮素缺乏類似的癥狀。對植株體內(nèi)的Mo濃度檢測發(fā)現(xiàn)，施入鉬酸鈉幼苗的Mo濃度顯著高于其它處理，這說明培養(yǎng)基中的鉬參與到硝酸還原酶的合成過程，從而在植株的氮代謝過程中發(fā)揮作用。加入抑制劑的幼苗中Mo濃度和對照差異不大，這表明由于抑制劑的存在，培養(yǎng)基中加入的鉬酸鈉不能轉(zhuǎn)運到植株體內(nèi)，檢測的Mo濃度基本上是植株體內(nèi)初始Mo濃度。以上結(jié)果表明，缺Mo可能引起草莓幼苗根系和葉片結(jié)構(gòu)發(fā)生異常，導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)的合成及運輸發(fā)生紊亂，從而影響草莓幼苗的氮代謝和碳代謝過程。

本試驗結(jié)果表明，加入鉬酸鈉的幼苗NR活性最高，加入抑制劑鎢酸鈉的NR活性顯著降低，其它氮代謝關(guān)鍵酶（NiR、GS和NADH-GOGAT）表現(xiàn)出類似的趨勢。加入鉬酸鈉處理的幼苗15N利用率最高，而加入抑制劑的幼苗15N利用率較低。表明鉬酸鈉的加入使得植株體內(nèi)Mo元素達(dá)到一種穩(wěn)態(tài)平衡，有利于硝酸鹽的吸收還原，促進(jìn)氮素的同化。綜上所述，葉面噴施2.4 mmol·L-1Na2MoO4有利于草莓幼苗生長，提高其氮代謝水平和15N吸收利用，而噴施抑制劑Na2WO4則會抑制其作用。