CALUX生物檢測(cè)法測(cè)定垃圾焚燒廠周邊農(nóng)田土壤中的二噁英類

張會(huì)強(qiáng),白 昭,王 斐,張秦銘,馬文鵬,王雨薇

(1.陜西省環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站，陜西 西安 710054；2.國(guó)家環(huán)境二噁英監(jiān)測(cè)西北分中心，陜西 西安 710054)

1 引言

二噁英類物質(zhì)包括多氯二苯并二噁英(PCDDs)和多氯二苯并呋喃(PCDFs)，共計(jì)210種化合物。這類化合物通過(guò)進(jìn)入動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)與芳香烴受體(AhR)結(jié)合，調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄，引發(fā)各種的毒性效應(yīng)[1,2]，包括致癌、致畸、致突變和生殖毒性效應(yīng)[3～6]。隨著工業(yè)社會(huì)的發(fā)展，鋼鐵冶煉、垃圾焚燒、水泥生產(chǎn)、制漿造紙等行業(yè)排放產(chǎn)生的二噁英[7]，蓄積在土壤、底泥等環(huán)境介質(zhì)當(dāng)中，因其極難降解，隨食物鏈放大并富集在動(dòng)物和人體當(dāng)中，影響食品安全和人體健康[8～10]。

2016年5月28日國(guó)務(wù)院印發(fā)了《土壤污染防治行動(dòng)計(jì)劃》，簡(jiǎn)稱“土十條”，旨在加強(qiáng)土壤污染防治，保證土壤環(huán)境質(zhì)量，保障農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全。土壤中的二噁英類的定量檢測(cè)主要依據(jù)HJ 77.4-2008《土壤和沉積物二噁英的測(cè)定同位素稀釋高分辨氣相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用法》(high resolution gas-high resolution mass spectrometer ，簡(jiǎn)稱 HRGC-HRMS法)。該方法檢測(cè)過(guò)程繁瑣，成本高，周期長(zhǎng)，需有昂貴的高分辨質(zhì)譜檢測(cè)，不適用于環(huán)境樣品的大量篩選。熒光素酶報(bào)告基因法(the chemical-activated luciferase expression,以下簡(jiǎn)稱CALUX法)是將熒光素酶作為報(bào)告基因插入到控制轉(zhuǎn)錄的DRE基因下游，制備成報(bào)告基因質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染大鼠肝癌細(xì)胞構(gòu)建的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。含二噁英類的樣品與細(xì)胞株共同孵育時(shí)，就會(huì)激活A(yù)hR信號(hào)通路，進(jìn)而激活含DRD(dioxin responsive domain, DRD)報(bào)告基因的啟動(dòng)子，誘導(dǎo)熒光素酶的表達(dá)，加入熒光素酶底物產(chǎn)生熒光，熒光值與二噁英含量成正比[11]。CALUX法已經(jīng)成為行業(yè)內(nèi)二噁英快速篩選的“熱點(diǎn)”方法[12～14]。

對(duì)某生活垃圾焚燒發(fā)電廠周邊農(nóng)田土壤進(jìn)行了布點(diǎn)采樣(1#～9#樣品，詳見(jiàn)圖1)，采用快速溶劑萃取(ASE)進(jìn)行樣品提取，硫酸酸洗和多層硅膠柱凈化，溶劑轉(zhuǎn)換為二甲基亞砜(DMSO)后，利用CALUX法測(cè)定了土壤樣品中的二噁英類。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 主要儀器與試劑耗材

(1)主要儀器設(shè)備,如表1所示。

(2)試劑與耗材。正己烷、二氯甲烷，色譜純，均為Fisher品牌；甲苯、濃硫酸、濃鹽酸，色譜純，均為德國(guó)merck品牌；無(wú)水硫酸鈉、氯化鈉、硅藻土、優(yōu)級(jí)純，均為德國(guó)merck品牌；酸性硅膠柱、堿性硅膠柱、活性炭柱均為FMS品牌；CALUX細(xì)胞株和CALUX-Aid軟件由美國(guó)XDSI公司授權(quán)使用；胎牛血清(FBS)、細(xì)胞培養(yǎng)用抗生素(Pen Strep簡(jiǎn)稱P/S)、胰蛋白酶(Trypsin)、培養(yǎng)基(RPMI-1640)均為Gibco品牌；二甲基亞砜(DMSO)為美國(guó)Sigma品牌；細(xì)胞裂解液、熒光素酶試劑盒均為Promega品牌；2,3,7,8-TCDD(50μg·mL-1，DMSO溶劑)為Wellington品牌；30～300 μL八通道移液器，1-100 mL大容量電動(dòng)移液器購(gòu)自德國(guó)Sartorius品牌；XB-K-25型細(xì)胞計(jì)數(shù)板，購(gòu)自上海求精生化試劑儀器有限公司；Mr.Frosty梯度降溫盒，Nunc 96孔底透微孔板，均購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher公司；2 mL凍存管，50 mL離心管，10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿均購(gòu)自美國(guó)Corning公司；其它玻璃器皿為實(shí)驗(yàn)室常用規(guī)格。

圖1 某垃圾焚燒發(fā)電廠周邊農(nóng)田土壤采樣布點(diǎn)

表1 主要儀器設(shè)備相關(guān)信息

2.2 實(shí)驗(yàn)步驟

2.2.1 樣品的預(yù)處理 稱取5.000g土壤樣品經(jīng)酸泡，過(guò)濾后，進(jìn)行快速溶劑萃取，儀器條件：加熱溫度120℃，加熱時(shí)間6 min，靜態(tài)時(shí)間7 min，循環(huán)3次，清洗體積70%，吹氣時(shí)間200 s。提取液經(jīng)3次酸洗后用飽和氯化鈉溶液水洗，經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至約5 mL。經(jīng)多層硅膠柱(酸性硅膠柱+堿性硅膠柱+活性炭柱)凈化后，用正己烷定容至10 mL，分取5 mL轉(zhuǎn)移到K-D管濃縮到1.0 mL,氮吹吹干，用200 μLDMSO定容，室溫避光保存。

2.2.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 按照91% (RPMI-1640)+8%FBS+1%P/S的比例配制培養(yǎng)基。從-80℃超低溫冰箱取出含CALUX細(xì)胞株的凍存管， 37℃恒溫水浴快速解凍，吹打散后快速轉(zhuǎn)入10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇。37℃,5%CO2恒溫培養(yǎng)至長(zhǎng)滿90%培養(yǎng)皿后再進(jìn)行細(xì)胞傳代。將重復(fù)傳代的細(xì)胞溶液1 000 rpm離心3 min后，加入培養(yǎng)基重懸。細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為7.5×105cells·mL-1，此溶液為細(xì)胞種板溶液。按照每孔200 μL的細(xì)胞混懸液的量接種96孔板，每個(gè)孔接種15萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，接種方式按照?qǐng)D2進(jìn)行。然后將接種好的底透板做好標(biāo)記后進(jìn)行培養(yǎng)。

將50μg·mL-12,3,7,8-TCDD用DMSO進(jìn)行逐級(jí)稀釋，配制成下表2濃度值。對(duì)培養(yǎng)了14～24 h的96孔板進(jìn)行細(xì)胞給藥，然后置于37℃,5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20～24 h。取出底透板，進(jìn)行細(xì)胞裂解，于化學(xué)發(fā)光讀扳機(jī)上進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，讀取熒光響應(yīng)值(RLU)。

圖2 細(xì)胞種板布板方式

(備注：PBS表示磷酸鹽緩沖溶液；NC表示DMSO溶劑空白；STD1～STD9表示標(biāo)準(zhǔn)系列；QC表示質(zhì)控樣；1#～9#表示樣品。)

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度

2.3 結(jié)果與分析

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果 將上機(jī)檢測(cè)讀取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的RLU值代入CALUX-Aid軟件，得出圖3熒光值對(duì)2,3,7,8-TCDD標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)曲線。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的熒光響應(yīng)曲線

2.3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 將上機(jī)檢測(cè)讀取樣品的RLU值代入CALUX-Aid軟件，得出1#～9#農(nóng)田土壤樣品中的二噁英毒性當(dāng)量濃度分別為7.05 ngTEQ·kg-1、7.95 ngTEQ·kg-1、6.20 ngTEQ·kg-1、14.16 ngTEQ·kg-1、8.42 ngTEQ·kg-1、4.06 ngTEQ·kg-1、7.07 ngTEQ·kg-1、4.93 ngTEQ·kg-1、3.50 ngTEQ·kg-1。NC樣品未檢出，QC結(jié)果在合格范圍內(nèi)。

2.3.3 結(jié)果討論 9個(gè)樣品均為某生活垃圾焚燒發(fā)電廠周邊農(nóng)田土壤，二噁英毒性當(dāng)量濃度范圍為3.50～14.16 ngTEQ·kg-1。均值為7.04 ngTEQ·kg-1低于荷蘭和瑞士的農(nóng)田土壤標(biāo)準(zhǔn)(10ngTEQ·kg-1)[15]。由圖4可見(jiàn)點(diǎn)位與排放口的距離越遠(yuǎn)，二噁英濃度越低。該廠所處地理位置常年主導(dǎo)方向?yàn)槟巷L(fēng)，其中4#、5#和7#均位于該廠北面，因此，濃度值略高，其中4#超出了10 ngTEQ·kg-1的農(nóng)田土壤標(biāo)準(zhǔn)限值。

圖4 二噁英毒性當(dāng)量濃度與采樣點(diǎn)位距煙囪直線距離的關(guān)系

3 結(jié)論

與HRGC-HRMS法相比，CALUX法檢驗(yàn)結(jié)果僅能指示2,3,7,8-TCDD的毒性當(dāng)量值，并不能給出樣品中二噁英組分的單體指紋特征及豐度，只能作為二噁英類快速篩選的半定量方法。但是，CALUX法利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞對(duì)二噁英進(jìn)行暴露試驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果直接反映人體健康風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)大量樣品的高通量檢驗(yàn)，因此，CALUX法在實(shí)際應(yīng)用中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和意義。