扶腎方調(diào)節(jié)各種細(xì)胞因子干預(yù)腹膜間皮細(xì)胞EMT的實(shí)驗(yàn)研究

楊波，王孟孟，李潔，喬延恒，楊洪濤△

腹膜透析（PD）是終末期腎臟?。‥SRD）患者的重要腎臟替代療法。目前，全球PD患者約占透析人群的11%，并正以每年8%的速度增長［1］。長期PD易發(fā)生腹膜纖維化，導(dǎo)致超濾衰竭，最終迫使患者退出治療［2］。研究表明，裸露的腹膜間皮細(xì)胞從上皮細(xì)胞表型向間充質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化即上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是腹膜纖維化的起始和可逆環(huán)節(jié)［3］。因此，明確腹膜間皮細(xì)胞EMT具體機(jī)制，對于防治腹膜纖維化具有重要意義。中藥復(fù)方因其多靶點(diǎn)調(diào)節(jié)的特點(diǎn)，在防治腹膜纖維化方面具有較好前景［4］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，扶腎方（院內(nèi)制劑：津藥制字Z20130941）具有防治腹膜纖維化，延緩超濾衰竭的作用，但具體機(jī)制尚不明確［5］。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)探討扶腎方含藥血清對轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）干預(yù)腹膜間皮細(xì)胞EMT過程中E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、緊密連接蛋白-1（ZO-1）、轉(zhuǎn)化生長因子-β 受體Ⅰ（TGF-βRⅠ）、TGF-βRⅡ、泛素連接酶Smad泛素化相關(guān)因子2（Smurf2）的影響及抑制腹膜間皮細(xì)胞EMT 的機(jī)制，為其應(yīng)用于PD 相關(guān)腹膜纖維化防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 清潔級SD雄性大鼠26只，6周齡，體質(zhì)量150～180 g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動物許可證：SCXK（京）2016-0006。胰蛋白酶、DMEM 完全培養(yǎng)基、TGF-β1（母液濃度50 mg/L）、蛋白酶體抑制劑MG132（母液濃度10 mmol/L）、一抗β-actin（1∶500）、Smurf2（1∶200）購自北京中杉金橋生物有限公司；75%乙醇，10%水合氯醛購自成都市科龍化工試劑廠；手術(shù)器械（剪刀和鑷子），無菌注射器（20 mL 和1 mL），50 mL 無菌離心管購自北京市瑞康達(dá)醫(yī)療器械有限公司。

1.2 方法

1.2.1 腹膜間皮細(xì)胞分離及原代培養(yǎng) 大鼠20 只（每次5只，共4 次），行肌內(nèi)注射10%水合氯醛約1 mL，待麻醉后向大鼠腹腔內(nèi)注射20～30 mL 0.25%胰蛋白酶/0.02% EDTA 消化液。30 min 后斷頸處死大鼠，消化l h，75%乙醇全身浸泡消毒5 min。將大鼠仰面放置于超凈工作臺上，沿腹中線依次剪開腹壁皮膚及肌肉，吸出腹腔內(nèi)液體，移入50 mL 離心管中。1 500 r/min離心15 min，棄上清，加入含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的DMEM/F12 培養(yǎng)液，輕輕用吸管吹打使之成為細(xì)胞混懸液，種植于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。放入37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。約每3 d 更換1 次完全培養(yǎng)基。待細(xì)胞生長至培養(yǎng)瓶底60%～70%時，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，第2代用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 腹膜間皮細(xì)胞EMT 模型建立及鑒定 基于前期實(shí)驗(yàn)和參考文獻(xiàn)［6］，采用40 μg/L TGF-β1 因子刺激培養(yǎng)的2 代大鼠腹膜間皮細(xì)胞24 h建立EMT模型。模型鑒定：倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞數(shù)量、生長狀態(tài)及形態(tài)變化；上皮E-cadherin、ZO-1可作為腹膜間皮細(xì)胞EMT的特異生物標(biāo)志物。

1.2.3 扶腎方含藥血清的制備 采用大鼠灌胃法制備含藥血清，6只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組和扶腎方組，每組3只，扶腎方組每只大鼠灌胃2 mL（扶腎方含量為162 g/L）連續(xù)7 d，最后一次灌胃后2 h，麻醉后經(jīng)股動脈取血10 mL，分離含藥血清，空白對照組大鼠灌胃等劑量生理鹽水，其他操作同扶腎方組。扶腎方以中藥飲片為原料，經(jīng)過提取、分離、濃縮、干燥、制粒而成。按照藥物人和大鼠體表面積計(jì)算方法，折算系數(shù)為0.018。扶腎方顆粒成人服用劑量為每次18 g，按照折算系數(shù)計(jì)算出大鼠等效劑量為0.324 g。分離得到的血清經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾除菌，56 ℃30 min滅活補(bǔ)體，制成含藥血清，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù) 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為5組：空白對照組（C組，正常培養(yǎng)基培養(yǎng)腹膜間皮細(xì)胞24 h）；最佳含藥血清組（B 組，正常培養(yǎng)基加大鼠含藥血清培養(yǎng)腹膜間皮細(xì)胞24 h）；模型組（T組，40 μg/L TGF-β1因子刺激腹膜間皮細(xì)胞24 h）；模型+含藥血清組（T+B 組，在模型組處理上加上最佳含藥血清干預(yù)24 h）；模型+MG132組（T+M組，在模型組處理上加 MG132 干預(yù) 24 h）。將 40 μg/L TGF-β1 干預(yù)腹膜間皮細(xì)胞，作用時間選擇 6、12、24 及 48 h，通過MTT 檢測細(xì)胞的活力，最終確定24 h為干預(yù)時間。

1.2.5 實(shí)時熒光定量 PCR（qPCR）檢測E-cadherin、ZO-1、TGF-βRⅠ，TGF-βRⅡ的mRNA 水平 按試劑盒步驟提取每組細(xì)胞總RNA，測定提取RNA純度，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，再進(jìn)行qPCR，引物序列見表1。PCR 反應(yīng)體系：2×SYBR Premix Ex Taq 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，模板2 μL，加ddH2O至總體系25 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，30個循環(huán)。將各樣品cDNA稀釋10倍后取2 μL 作模板，分別用目的基因引物和內(nèi)參基因（GAPDH）引物進(jìn)行擴(kuò)增，重復(fù)檢測孔道數(shù)為3，在60～95 ℃進(jìn)行熔解曲線分析。采取2-ΔΔCt進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對定量分析。

Tab.1 Primer sequences and amplified fragment length表1 引物序列及擴(kuò)增片段長度

1.2.6 蛋白印跡法檢測Smurf2 蛋白的表達(dá) 將培養(yǎng)的各組細(xì)胞棄上清，用無菌PBS清洗3次后，加入細(xì)胞裂解液冰上裂解30 min，低溫高速離心機(jī)4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，取其上清液，BCA 法測定蛋白濃度。以30 μg 蛋白質(zhì)溶液為總上樣量，取適量體積5×SDS（十二烷基苯磺酸鈉）上樣緩沖液充分混勻，100 ℃變性10 min，經(jīng)凝膠電泳分離后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，脫脂奶粉室溫封閉2 h，4 ℃搖床孵育一抗β-actin（1∶500）、Smurf2（1∶200）過夜。緩沖液洗膜3次，每次10 min，室溫下孵育帶有HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG（1∶20 000）二抗1.5 h，緩沖液洗膜3次，每次10 min。使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集圖像，Image J v2.1.4.7軟件進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，計(jì)算各組蛋白的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組比較采用單因素方差分析，以Levene 法進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若方差齊，采用LSD-t法，若方差不齊，采用Games-Howell 法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)的觀察 原代培養(yǎng)的細(xì)胞在第1天可見呈分散的小圓形細(xì)胞，24 h 后大部分細(xì)胞開始貼壁生長，形態(tài)仍為圓形，細(xì)胞數(shù)量較多。第3天細(xì)胞的形態(tài)趨于一致，數(shù)量較第1 天少；第5 天細(xì)胞形態(tài)多種多樣，有圓形、橢圓形、梭形、多角形等，邊緣不齊。第7天細(xì)胞經(jīng)過充分融合，細(xì)胞呈現(xiàn)多邊形，形態(tài)較一致，部分細(xì)胞間連接較為緊密。見圖1。

2.2 各組腹膜間皮細(xì)胞E-cadherin、ZO-1mRNA比較 與 C 組比較，T 組E-cadherin、ZO-1mRNA 表達(dá)均下調(diào)（P＜0.05）；與 T 組比較，B 組和T+B 組E-cadherin、ZO-1mRNA 表 達(dá) 均 上 調(diào) ，T+M 組E-cadherin、ZO-1mRNA表達(dá)均下調(diào)（P＜0.05）；與B組比較，T+B 組和 T+M 組E-cadherinmRNA 表達(dá)下調(diào)，T+M 組ZO-1mRNA 表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）；與T+B 組比較，T+M 組E-cadherin、ZO-1mRNA 表達(dá)均下調(diào)（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Transcription levels of E-cadherin and ZO-1 mRNA in peritoneal mesothelial cells in five groups表2 5組腹膜間皮細(xì)胞E-cadherin、ZO-1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平 （n=6，）

Tab.2 Transcription levels of E-cadherin and ZO-1 mRNA in peritoneal mesothelial cells in five groups表2 5組腹膜間皮細(xì)胞E-cadherin、ZO-1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平 （n=6，）

＊＊P＜0.01；a與C 組比較，b與 T 組比較，c與B 組比較，d與T+B 組比較，P＜0.05；表3同

ZO-1 1.00±0.04 0.79±0.05a 1.37±0.10b 1.29±0.06b 0.40±0.03bcd 84.924＊＊組別C組T組B組T+B組T+M組F E-cadherin 1.01±0.14 0.60±0.13a 1.76±0.47b 0.91±0.15bc 0.21±0.11bcd 17.403＊＊

2.3 各干預(yù)組腹膜間皮細(xì)胞形態(tài) 取培養(yǎng)的第2代腹膜間皮細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，鏡下細(xì)胞生長狀態(tài)較好，細(xì)胞完全融合后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)。C組腹膜間皮細(xì)胞呈圓形、橢圓形、多邊形的上皮樣細(xì)胞。T 組經(jīng)造模后，細(xì)胞數(shù)量明顯減少。B 組細(xì)胞數(shù)量也較C 組減少，但較T 組細(xì)胞數(shù)量多，且有少量細(xì)胞呈現(xiàn)長梭形。T+B組干預(yù)后，細(xì)胞數(shù)量較模型組明顯增多，細(xì)胞形態(tài)較為一致。T+M 組細(xì)胞數(shù)量明顯減少，見圖2。

2.4 各組細(xì)胞TGF-βR Ⅰ、TGF-βR ⅡmRNA 及Smurf2蛋白的表達(dá)比較 與C組比較，T組TGF-β1RⅡmRNA、Smurf2 蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）；與T 組比較，T+B組TGF-β1RⅡmRNA表達(dá)上調(diào)，Smurf2蛋白表達(dá)下調(diào)，而T+M 組TGF-β1RⅠmRNA、Smurf2蛋白表達(dá)均下調(diào)，TGF-β1RⅡmRNA 表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）；與 B 組比較，T+M 組TGF-β1RⅠmRNA 表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）；與T+B 組比較，T+M 組TGF-β1RⅠ和TGF-β1RⅡmRNA 表達(dá)均下調(diào)（P＜0.05），見圖3、表3。

3 討論

PD 是ESRD 患者的主要替代療法之一，目前全世界有超過272 000例患者接受PD治療［1］。中國國家腎臟病數(shù)據(jù)系統(tǒng)顯示，截至2017 年底我國PD 患者達(dá)86 264例［7］。腹膜纖維化發(fā)生的原因和機(jī)制復(fù)雜，作為腹膜結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的間皮細(xì)胞發(fā)揮了重要作用。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要采用預(yù)防腹腔感染、改善腹透液生物相容性、改進(jìn)PD 技術(shù)等手段抑制腹膜間皮細(xì)胞EMT，防治腹膜纖維化，近年也有相關(guān)基因治療的報(bào)道[8]。部分單味及復(fù)方中藥具有抑制EMT、抗纖維化的作用，臨床用于慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）及ESRD 的治療。中醫(yī)藥抑制腹膜間皮細(xì)胞EMT，防治腹膜纖維化備受研究者的關(guān)注。研究表明，大黃素、丹參酮、黃芪甲苷、參芎注射液、腎康注射液等可改善由高糖腹透液誘導(dǎo)的大鼠腹膜功能減退及腹膜間皮細(xì)胞EMT，防治腹膜纖維化[9]。

Tab.3 Transcription levels of TGF-β1RⅠ and TGF-β 1RⅡmRNA and expression levels of Smurf2 protein in peritoneal mesothelial cells in five groups表3 5組腹膜間皮細(xì)胞TGF-β1RⅠ、TGF-β1RⅡmRNA轉(zhuǎn)錄水平及Smurf2蛋白水平 （n=6，）

Tab.3 Transcription levels of TGF-β1RⅠ and TGF-β 1RⅡmRNA and expression levels of Smurf2 protein in peritoneal mesothelial cells in five groups表3 5組腹膜間皮細(xì)胞TGF-β1RⅠ、TGF-β1RⅡmRNA轉(zhuǎn)錄水平及Smurf2蛋白水平 （n=6，）

組別C組T組B組T+B組T+M組F TGF-β1RⅠ mRNA 1.02±0.24 0.88±0.04 0.80±0.08 1.13±0.41 0.25±0.02bcd 7.435＊＊TGF-β1RⅡ mRNA 1.01±0.14 0.72±0.02a 1.01±0.39 1.53±0.13b 0.95±0.10bd 6.798＊＊Smurf2蛋白0.12±0.05 0.76±0.24a 0.69±0.26 0.28±0.07b 0.36±0.13b 7.454＊＊

PD 相關(guān)腹膜炎、腹膜透析液生物不相容性、高糖腹透液發(fā)生糖基化反應(yīng)產(chǎn)生的糖基化終末產(chǎn)物等是導(dǎo)致腹膜間皮細(xì)胞EMT 的主要原因。其中TGF-β1 是目前公認(rèn)的最強(qiáng)的促纖維化因子，TGF-β1 能促進(jìn)上皮細(xì)胞EMT，還可以增加細(xì)胞外基質(zhì)合成和減少細(xì)胞外基質(zhì)降解，引起膠原沉積，加速腹膜纖維化。TGF-β1 需通過其受體TGF-βRⅠ和（或）TGF-βRⅡ而發(fā)揮作用。TGF-β1 先與TGF-βRⅡ結(jié)合形成復(fù)合物，之后TGF-βRⅠ再與形成的TGF-β1/TGF-βRⅡ復(fù)合物結(jié)合成聚合體形式，最終該聚合體進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用[10]。TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、Smurf2 是腹膜間皮細(xì)胞EMT 中起重要作用的細(xì)胞因子。E-cadherin、ZO-1 是腹膜間皮細(xì)胞EMT的標(biāo)志物，是上皮細(xì)胞側(cè)面表達(dá)的重要連接蛋白。在EMT 早期，E-cadherin、ZO-1 表達(dá)降低，是導(dǎo)致細(xì)胞融合變松散，直至細(xì)胞脫落的原因［11］。Smurf 是一種含E6 同源相關(guān)蛋白羧基端（Homologous to the E6-AP Carboxyl Terminus，HECT）結(jié)構(gòu)域的E3泛素連接酶，通過選擇性地降解Smad 通路的關(guān)鍵組分，在調(diào)節(jié)TGF-β1 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著舉足輕重的作用［12］。Smurf2在TGF-β1信號活性調(diào)節(jié)中起樞紐作用，一旦功能失調(diào)，會導(dǎo)致一系列病理生理學(xué)改變［13］。Smurf2對TGF-β/Smads通路的調(diào)節(jié)是雙向的，既有正調(diào)節(jié)也有負(fù)調(diào)節(jié)作用，主要取決于通過WW結(jié)構(gòu)域與不同蛋白結(jié)合以發(fā)揮不同作用。Smurf2與Smad2和Smad3直接結(jié)合誘導(dǎo)其降解發(fā)揮抑制作用。Smurf2還可以與Smad7結(jié)合使之發(fā)生泛素化降解，從而活化TGF-β1/Smad 信號通路［14］。Smurf2的雙向調(diào)節(jié)功能在維持TGF-β/Smads信號通路平衡中起了重要作用。因此，如何積極運(yùn)用Smurf2 抑制通路的作用減少EMT 發(fā)生也是研究的重點(diǎn)。MG132是一種醛基肽類泛素-蛋白酶體抑制劑，能夠抑制細(xì)胞中不同類型蛋白酶的活性，從而阻斷靶蛋白的泛素化降解，目前在實(shí)驗(yàn)研究中得到廣泛應(yīng)用［15］。前期筆者課題組研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的扶腎方可通過調(diào)節(jié)尿毒癥腹膜透析大鼠腹膜TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ的表達(dá)抑制腹膜間皮細(xì)胞EMT，改善腹膜纖維化[16]。

本研究通過體外腹膜間皮細(xì)胞培養(yǎng)，觀察扶腎方對TGF-β1 干預(yù)的腹膜間皮細(xì)胞的E-cadherin、ZO-1、TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ和Smurf2表達(dá)的影響。PD 相關(guān)腹膜纖維化細(xì)胞因子的研究主要采用高濃度葡萄糖腹透液誘導(dǎo)制備模型，上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化模型則多采用TGF-β1干預(yù)腹膜間皮細(xì)胞制備［17］。本實(shí)驗(yàn)采用40 μg/L TGF-β1 干預(yù)腹膜間皮細(xì)胞制備EMT 模型。研究顯示，TGF-β1 干預(yù)腹膜間皮細(xì)胞后，EMT 模型成功，E-cadherin、ZO-1mRNA 表達(dá)降低，而扶腎方含藥血清干預(yù)后則明顯增加E-cadherin、ZO-1mRNA 表達(dá) 。 模 型 組TGF-βR ⅡmRNA 表達(dá)明顯降低，扶腎方含藥血清可明顯上調(diào)TGF-βRⅡmRNA 表達(dá)。另外，本實(shí)驗(yàn)采用MG132作為靶蛋白泛素化的抑制劑，經(jīng)TGF-β1干預(yù)后，模型組Smurf2蛋白表達(dá)量明顯升高，而MG132干預(yù)后明顯下調(diào)，扶腎方含藥血清組Smurf2 蛋白表達(dá)也明顯下調(diào)，作用與MG132組類似。筆者推測扶腎方在TGF-β1 干預(yù)的腹膜間皮細(xì)胞EMT 模型中，通過上調(diào)TGF-βRⅡmRNA 表達(dá)，下調(diào)Smurf2蛋白含量，促進(jìn)腹膜間皮細(xì)胞E-cadherin、ZO-1mRNA 表達(dá)，達(dá)到抑制腹膜間皮細(xì)胞EMT的作用。

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，ESRD 的病機(jī)多為本虛標(biāo)實(shí)證，本虛屬脾腎虧虛，標(biāo)實(shí)表現(xiàn)為濕濁、瘀血，脾腎虧虛是濁、瘀產(chǎn)生的主因?；颊逷D治療后，仍不失ESRD病機(jī)關(guān)鍵，因此PD相關(guān)腹膜纖維化的主要病機(jī)仍為脾腎虧虛，濕濁瘀血內(nèi)蘊(yùn)。扶腎方是根據(jù)以上關(guān)鍵病機(jī)而配伍的臨床效方，由陳皮、半夏、黃芪、當(dāng)歸、丹參、鬼箭羽、熟大黃、淫羊藿等組成，功效為“健脾益腎，化瘀降濁”，組方科學(xué)合理，融中醫(yī)“和、消、補(bǔ)”三法于一體，前期臨床研究及動物實(shí)驗(yàn)表明，該方能改善腎功能，減輕PD 腹膜纖維化［5］，但目前離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)靶點(diǎn)尚不明確。

綜上所述，本研究從體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)，扶腎方可通過上調(diào)TGF-βR ⅡmRNA 表達(dá)，下調(diào)Smurf2蛋白含量，抑制腹膜間皮細(xì)胞EMT，達(dá)到防治腹膜纖維化的作用，為臨床應(yīng)用扶腎方防治腹膜纖維化提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)及理論支持，但扶腎方抑制腹膜間皮細(xì)胞EMT，防治腹膜纖維化是否還通過其他信號通路發(fā)揮作用還需進(jìn)一步深入探索。