益氣活血方治療心力衰竭的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機(jī)制研究

張婷 王婕 吳愛明 馬喆 趙一舟 張冬梅 金秋碩 婁利霞

[摘要] 目的 探討益氣活血方通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）信號通路改善心力衰竭的分子機(jī)制。 方法 SPF級雄性SD大鼠30只，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組（10只），只開胸不結(jié)扎;余20只采用結(jié)扎左冠狀動脈前降支的方法制備大鼠急性心肌梗死模型。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、益氣活血組，每組10只。模型組和假手術(shù)組灌胃去離子水5 mL/（kg·d），1次/d。益氣活血組灌胃益氣活血方5 mL/（kg·d），連續(xù)給藥4周。左心室插管檢測血流動力學(xué)指標(biāo)包括左心室舒張終末壓（LVEDP）、左心室內(nèi)壓最大上升速率（+dp/dt max）、左心室內(nèi)壓最大下降速率（-dp/dt max）、左心室收縮壓（LVSP）和心率（HR）。Rt-PCR法檢測腦鈉肽（BNP）、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶A（CaNA）基因的表達(dá)水平，Western blot法檢測caspase-12、蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）、肌醇需要酶1（IRE1）、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）蛋白的表達(dá)水平。 結(jié)果 模型組大鼠LVEDP、-dp/dt max、HR高于假手術(shù)組;+dp/dt max、LVSP低于假手術(shù)組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。益氣活血組大鼠LVEDP、-dp/dt max、HR低于模型組;LVSP、+dp/dt max高于模型組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。模型組大鼠BNP、CaNA mRNA表達(dá)高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。益氣活血組大鼠BNP、CaNA mRNA表達(dá)低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。模型組大鼠caspase-12、PERK、IRE1和GRP78蛋白表達(dá)水平高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）;益氣活血組大鼠caspase-12、PERK和IRE1蛋白表達(dá)水平低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 益氣活血方可以改善心肌梗死后大鼠的心功能，其機(jī)制與調(diào)節(jié)ERS信號通路有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 益氣活血方;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激;心力衰竭;心功能

[中圖分類號] R541.6? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）05（a）-0032-06

Study on endoplasmic reticulum stress mechanism of treating heart failure with Yiqi Huoxue Recipe

ZHANG Ting1? ?WANG Jie2? ?WU Aiming1? ?MA Zhe1? ?ZHAO Yizhou1? ?ZHANG Dongmei1? ?JIN Qiushuo1? ?LOU Lixia1

1.Chinese Internal Medicine Laboratory of of Ministry of Education and Beijing， Dongzhimen Hospital， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing? ?100700， China; 2.Department of Cardiology， the First People′s Hospital of Lanzhou New District， Gansu Province， Lanzhou? ?730300， China

[Abstract] Objective To explore the molecular mechanism of improvement effect of Yiqi Huoxue Recipe in heart failure treatment by regulating endoplasmic reticulum stress signaling （ERS） pathway. Methods Thirty SPF male SD rats were divided into sham operation group （10 rats） by the random number table method， and the remaining 20 rats model of acute myocardial infarction was prepared by ligating the anterior descending branch of the left coronary artery. Rats with successful modeling were randomly divided into model group and Yiqi Huoxue group，? with 10 rats in each group. The rats in model group and sham operation group were gavaged with deionized water 5 mL/（kg·d）， 1 time/d. Rats in Yiqi Huoxue group were gavaged with Yiqi Huoxue Recipe 5 mL/（kg·d）. The drug was administered continuously for 4 weeks. Hemodynamic index including left ventricular end-diastolic pressure （LVEDP）， left ventricular internal pressure maximal rate of increase （+dp/dt max）， left heart maximum drop rate of indoor pressure （-dp/dt max）， left ventricular systolic pressure （LVSP） and heart rate （HR） were detected by left ventricular intubation method. The expressions of brain natriuretic peptide （BNP） and calcineurin A （CaNA） mRNA were detected by Rt-PCR and the protein levels of caspase-12， protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase （PERK）， inositol requiring enzymes 1（IRE1） and glucose-regulated protein 78 （GRP78） were detected by Western blot. Results LVEDP， -dp/dt max and HR in model group were higher than those in sham group， +dp/dt max and LVSP were significantly lower than those in sham operation group， and the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. LVEDP， -dp/dt max and HR of rats in Yiqi Huoxue group were lower than those in model group， LVSP and +dp/dt max were higher than those in model group， and the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. The expressions of BNP and CaNA mRNA in model group were higher than those in sham operation group， with statistically significant differences （P < 0.05 or P < 0.01）. The expressions of BNP and CaNA mRNA in Yiqi Huoxue group were lower than those in model group， with statistically significant differences （P < 0.05）. The expression levels of caspase-12， PERK， IRE1 and GRP78 in model group were higher than those in sham operation group， with statistically significant differences （P < 0.05）. The expression levels of caspase-12， PERK and IRE1 in Yiqi Huoxue group were lower than those in model group， with statistically significant differences （P < 0.05）. Conclusion Yiqi Huoxue Recipe can improve the cardiac function of rats with heart failure induced by myocardial infarction， and the mechanism included may be related to the endoplasmic reticulum stress signaling pathway regulation.

[Key words] Yiqi Huoxue Recipe; Endoplasmic reticulum stress; Heart failure; Cardiac function

心力衰竭（heart failure，HF）是指由于各種原因的初始心肌損傷導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化，造成心室充盈或射血功能受損，器官、組織血液灌注不足，引發(fā)肺循環(huán)和/或體循環(huán)瘀血的復(fù)雜臨床綜合征，嚴(yán)重危害人類的生命健康[1]。近年來，我國心力衰竭的患病率持續(xù)增加，病死率居高不下[2]，臨床治療面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，心力衰竭屬于“胸痹”“真心痛”范疇，其病理性質(zhì)為本虛標(biāo)實(shí)之證，即氣虛陽虛為本，痰淤水泛為標(biāo)。已有研究[3]顯示，氣虛血瘀是心力衰竭的基本病理環(huán)節(jié)，因此補(bǔ)益心氣需貫穿心力衰竭治療的始終，同時采用活血化瘀療法達(dá)到標(biāo)本兼治的功效。

益氣活血方具有益氣溫陽，活血通脈的作用，多年來在臨床上用于治療心力衰竭，可有效防止及緩解心力衰竭的病情進(jìn)展[4-7]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是指由于某種原因?qū)е录?xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡、生理功能發(fā)生紊亂的一種亞細(xì)胞器的病理過程[8]。研究[9]顯示，ERS與心力衰竭的病理生理過程密切相關(guān)，適度ERS是細(xì)胞的一種自我保護(hù)，但當(dāng)ERS持續(xù)、過度發(fā)生時，會使心肌由代償轉(zhuǎn)為衰竭，參與心力衰竭的發(fā)生發(fā)展。本研究通過結(jié)扎左冠狀動脈前降支制備大鼠心肌梗死后心力衰竭模型，同時給予益氣活血方進(jìn)行干預(yù)治療，觀察益氣活血方對心肌梗死后心力衰竭大鼠心功能的改善作用以及對ERS通路蛋白如caspase-12、蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）、肌醇需要酶1（IRE1）、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）表達(dá)的影響，擬探討益氣活血方治療心力衰竭的ERS分子機(jī)制。

1 對象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級雄性SD大鼠30只，6周齡，體重（200±20）g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：scxk（京）2012-0001，動物合格證號：11400700212863。飼養(yǎng)條件：動物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教育部和北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（以下簡稱“本實(shí)驗(yàn)室”）SPF級實(shí)驗(yàn)動物房，室溫：25℃±2℃，相對濕度：50%±10%，光照時間：白晝12 h，黑夜12 h，相關(guān)動物實(shí)驗(yàn)操作按照本實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)動物操作規(guī)程進(jìn)行，符合動物倫理審查要求。

1.2 主要儀器與試劑

益氣活血方由黃芪40 g、黨參40 g、丹參20 g、川芎20 g、赤芍20 g、紅花20 g組成，所有飲片均購自北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，由本實(shí)驗(yàn)室水煎濃縮制備，分裝4℃保存;caspase-12一抗（ab62484）、IRE1一抗（ab48187）、GRP78一抗（ab21685）和GAPDH一抗（ab181602）購自美國abcam公司;PERK一抗（T980）購自美國Cell Signaling Technology公司;Trizol（1559 6026）購自美國Ambion 公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒（K1622）購自美國Thermo Fisher Scientific 公司;SYBR Green PCR Master Mix購自美國ABI公司;所用引物由北京諾賽基因組研究中心有限公司合成;全蛋白提取試劑盒（KGP250）購自江蘇凱基技術(shù)生物有限公司，其余試劑為市售分析純。

ALC-V8動物呼吸機(jī)（上海奧爾科特生物科技有限公司）;心電圖機(jī)（廈門錫爾摩電氣有限公司，F(xiàn)X-7402 Cardimax）;生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)信號采集系統(tǒng)（成都泰盟軟件有限公司，BL-420S）;千分之一電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司，JA1003N）;4℃離心機(jī)（上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司，TGL-16G）;Gene Quant紫外分光光度計(jì)（Pharmacia Biotech公司）;基因擴(kuò)增儀GeneAmp PCR System 9700（美國ABI公司）;實(shí)時熒光定量PCR儀（美國安捷倫科技公司，Mx3000P）。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與方法

1.3.1 大鼠心肌梗死后心力衰竭模型制備? 根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組（10只），余20只采用結(jié)扎左冠狀動脈前降支的方法制備大鼠心肌梗死模型[10]。1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔麻醉后，大鼠呈仰臥位，頭頸部四肢自然伸直用橡皮筋固定于鼠板，手術(shù)區(qū)備皮消毒后，記錄術(shù)前心電圖。實(shí)施經(jīng)喉氣管插管并連接呼吸機(jī)，以80次/min、潮氣量0.7～0.8 mL進(jìn)行人工呼吸。左胸前區(qū)用絡(luò)合碘消毒，75%酒精脫碘，左側(cè)第3、4肋處橫向切開皮膚約1.5 cm，后鈍性分離局部肌層，沿第3、4肋間間隙打開胸腔，開胸器擴(kuò)大手術(shù)視野，緩慢撕開心包，眼科彎鑷慢慢提起左心耳，充分暴露心臟，在動脈圓錐與左心耳之間向下約1 mm處用5/0線結(jié)扎左冠狀動脈，此時肉眼可見結(jié)扎局部及左心室前壁心肌組織缺血呈灰白色，心臟搏動減弱，然后止血、清理胸腔，確定心電圖顯示ST段顯著抬高后，還原心臟位置，分層縫合胸壁、肌層和皮膚，待大鼠狀態(tài)平穩(wěn)后，停止人工呼吸，同時記錄術(shù)后心電圖。術(shù)后即刻心電圖顯示ST段抬高、術(shù)后24 h心電圖出現(xiàn)病理性Q波，提示結(jié)扎手術(shù)成功。術(shù)后連續(xù)3 d注射青霉素80萬U/d預(yù)防感染。假手術(shù)組手術(shù)過程同上，但只穿線不結(jié)扎，術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)并分組給藥4周。

1.3.2 動物分組及給藥? 大鼠心肌梗死術(shù)后24 h心電圖檢查評價模型制備情況，將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組和益氣活血組，每組10只。模型組和假手術(shù)組灌胃去離子水5 mL/（kg·d），1次/d。益氣活血組灌胃益氣活血方5 mL/（kg·d），相當(dāng)于生藥量15 g/（kg·d）[11]，于造模后24 h開始給藥，連續(xù)給藥4周。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 血流動力學(xué)檢測? 大鼠經(jīng)1%戊巴比妥鈉（5 mL/kg）腹腔注射，麻醉后仰臥，橡皮筋固定于鼠板，絡(luò)合碘消毒頸部正中皮膚后用酒精脫碘，鈍性分離頸前肌群并暴露右頸總動脈，虹膜剪橫向剪開動脈約1 mm，將導(dǎo)管插管（經(jīng)肝素沖灌）插入左心室，等待大鼠穩(wěn)定3～5 min后開始生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)信號采集系統(tǒng)（成都泰盟軟件有限公司，BL-420S）檢測。檢測指標(biāo)主要包括：心率（HR）、左心室收縮壓（LVSP）、左心室舒張終末壓（LVEDP）、左心室內(nèi)壓最大上升速率（+dp/dt max）、左心室內(nèi)壓最大下降速率（-dp/dt max）。

1.4.2 Rt-PCR法檢測心力衰竭大鼠心肌組織鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶A（CaNA）、腦鈉肽（BNP）基因在mRNA水平的表達(dá)? 剪取心力衰竭大鼠心肌梗死邊緣區(qū)組織，冰上勻漿后，用Trizol法提取總RNA，核酸紫外分光光度計(jì)測定光密度（OD）260/280，并計(jì)算總RNA濃度及純度;逆轉(zhuǎn)錄2 μg總RNA，根據(jù)說明書配制20 μL反應(yīng)體系，最終得到cDNA鏈，反轉(zhuǎn)錄條件：42℃ 60 min、70℃ 5 min。以cDNA為模板，采用Rt-PCR法檢測目的基因BNP和CaNA的相對表達(dá)量，擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性 30 s，55℃退火30 s，72℃延伸20 s，40次循環(huán)。以磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參基因，按照2-△△Ct法計(jì)算基因相對表達(dá)量。引物序列見表1。

1.4.3 Western blot法檢測心力衰竭大鼠心肌組織caspase-12、PERK、IRE1、GRP78蛋白的表達(dá)? 心力衰竭大鼠心肌組織進(jìn)行蛋白提取、BCA蛋白定量，根據(jù)所提取蛋白樣品的濃度，加入適量的裂解液和4X蛋白質(zhì)上樣緩沖液，最終將蛋白濃度稀釋為5 mg/mL，分裝凍存于-80℃冰箱備用;配制10%聚丙烯酰胺凝膠，將蛋白樣品煮沸10 min后，各樣品每孔按照50 μg等量蛋白上樣開始電泳，待溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)凝膠底部時，將蛋白轉(zhuǎn)膜至NC膜，5%脫脂奶粉室溫敷育封閉1 h，加一抗caspase-12（1∶1000）、PERK（1∶500）、IRE1（1∶1000）、GRP78（1∶1000）、GAPDH（1∶10 000），4℃冰箱孵育過夜，加相對應(yīng)的特異性標(biāo)記二抗（1：5000），室溫孵育1 h后，ECL超敏發(fā)光液顯色，使用Tanon 4600凝膠成像儀（北京原平皓生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行圖像掃描，Image J軟件進(jìn)行條帶灰度值分析，GAPDH作為內(nèi)參。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗(yàn)或者SNK檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組血大鼠流動力學(xué)指標(biāo)比較

模型組大鼠LVEDP、-dp/dt max、HR高于假手術(shù)組;+dp/dt max、LVSP低于假手術(shù)組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。益氣活血組大鼠LVEDP、-dp/dt max、HR低于模型組;LVSP、+dp/dt max高于模型組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見表2。

2.2 三組大鼠心肌組織BNP、CaNA mRNA表達(dá)比較

模型組大鼠心肌組織BNP、CaNA mRNA表達(dá)高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。益氣活血組大鼠心肌組織BNP、CaNA mRNA表達(dá)低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見圖1。

2.3 三組大鼠心肌組織蛋白表達(dá)水平比較

模型組大鼠caspase-12、PERK、IRE1和GRP78蛋白表達(dá)水平高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）;益氣活血組大鼠caspase-12、PERK和IRE1蛋白表達(dá)水平低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），益氣活血組大鼠GRP78蛋白表達(dá)水平與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見圖2～3。

PERK：蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶;IRE1：肌醇需要酶1;GRP78：葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78;GAPDH：磷酸甘油醛脫氨酶

3 討論

在中醫(yī)看來，氣虛血瘀是慢性心力衰竭發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵病機(jī)，貫穿整個病理過程，因此，臨床使用益氣活血法治療慢性心力衰竭?？扇〉蔑@著效果。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠心功能減退;而益氣活血組大鼠心功能明顯提高。提示益氣活血法可以改善心力衰竭，與臨床報道益氣活血法有效改善心功能[12]、提高患者的生活質(zhì)量一致[13]。

BNP水平是心力衰竭的標(biāo)志物，用于心力衰竭的診斷、病情評估、危險度分層，指導(dǎo)治療與判定預(yù)后[14-16]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠心肌組織BNP、CaNA mRNA表達(dá)高于假手術(shù)組;益氣活血組大鼠心肌組織BNP、CaNA mRNA表達(dá)低于模型組（P < 0.05），提示益氣活血方可以有效糾正心力衰竭指標(biāo)。已有臨床研究[17]顯示，益氣活血方與西藥聯(lián)合治療慢性心力衰竭，可以降低血漿BNP水平，提高患者臨床效果，降低再住院率[18]。CaNA是唯一受鈣離子和鈣調(diào)素調(diào)節(jié)的絲氨酸蛋白質(zhì)磷酸酶，其可以通過介導(dǎo)心肌損傷促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，參與心力衰竭的發(fā)生發(fā)展[19]。而本研究結(jié)果提示益氣活血方能夠降低心力衰竭大鼠心肌組織中CaNA mRNA含量，改善心力衰竭。

研究[14，20]顯示，ERS信號通路是心力衰竭發(fā)生發(fā)展的重要分子機(jī)制。當(dāng)ERS發(fā)生時，PERK、IRE1、GRP78解離并活化，上調(diào)ERS的相關(guān)基因表達(dá)，介導(dǎo)心力衰竭的發(fā)生發(fā)展[21]。而IRE1通路的長時間激活也能夠通過激活caspase-12誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡[22]，引發(fā)或加重心力衰竭。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠caspase-12、PERK、IRE1和GRP78蛋白表達(dá)水平高于假手術(shù)組（P < 0.05），在心力衰竭過程中ERS通過促進(jìn)應(yīng)激分子GRP78同內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相應(yīng)跨膜蛋白解離，激活I(lǐng)RE1和PERK-eIF2a途徑，觸發(fā)JNKs、CHOP、caspase-12 通路，促使心肌細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致心力衰竭[23]。益氣活血組大鼠caspase-12、PERK和IRE1蛋白表達(dá)水平低于模型組（P < 0.05），提示益氣活血方可能通過抑制ERS和未折疊蛋白反應(yīng)的信號通路蛋白的表達(dá)水平，減輕ERS通路介導(dǎo)的心肌損傷，從而改善心力衰竭。

綜上所述，益氣活血方可能通過調(diào)節(jié)ERS通路蛋白分子表達(dá)改善細(xì)胞損傷，減輕心力衰竭程度。本研究有助于從分子水平理解和闡釋益氣活血方治療心力衰竭的作用機(jī)制，為今后心力衰竭的中醫(yī)藥臨床治療機(jī)制研究提供新的方向和思路。

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（收稿日期：2019-09-29? 本文編輯：劉明玉）