基于流式細胞術(shù)的烏飯樹核DNA含量（2C-值）測定

黃婧 張敏 林峰 周鵬 周潔

摘 要：? 核DNA含量（2C-值）是描述植物生物多樣性的一個重要特征參數(shù)。該研究利用流式細胞儀檢測越橘屬植物烏飯樹核DNA含量，建立了適合烏飯樹的流式細胞術(shù)測定方法：以野生烏飯樹的嫩葉為材料，以已知核DNA含量的水稻品種‘日本晴為內(nèi)標，采用GPB解離液，細胞核懸液加入50 μL 瘙 簚 mL-1碘化丙啶染色5 min即可上機檢測。結(jié)果表明：（1）9個烏飯樹單株的核DNA含量平均值為（1.22±0.03） pg，最小值為1.18 pg，最大值為1.27 pg。（2）檢測結(jié)果與已知的越橘屬二倍體植株的2C-值含量相似，且不同地理來源的單株DNA含量沒有顯著差異（P>0.05），推測這9個單株為二倍體植株。（3）測定的烏飯樹核DNA含量（2C-值）可豐富越橘屬植物的C-值庫;基于流式細胞術(shù)建立的烏飯樹核DNA含量測定方法可為該屬其他植物的相關(guān)研究提供借鑒。

關(guān)鍵詞： 烏飯樹， 核DNA含量， 2C-值， 流式細胞術(shù)

中圖分類號：? Q946

文獻標識碼：? A

文章編號：? 1000-3142（2020）05-0680-07

Determination of nuclear DNA content （2C-value） of Vaccinium bracteatum by flow cytometry

HUANG Jing1， ZHANG Min1*， LIN Feng2， ZHOU Peng1， ZHOU Jie1

（ 1. Jiangsu Academy of Forestry， Nanjing 211153， China; 2. Nanjing Forestry University， Nanjing 210037， China ）

Abstract：? The plant nuclear DNA content （2C-value） is a principal characteristic parameter to describe biodiversity of plant species. For better understanding the nuclear DNA information of this plant， the nuclear DNA content of Vaccinium bracteatum wild plants were estimated by flow cytometry （FCM）. In order to establish the optimal FCM method， young fresh leaves were taken as samples， and Oryza sativa subsp. japonica ‘Nipponbarewith known nuclear DNA content was set as internal standard. The nucleus of the mixed leaf cells was isolated by GPB dissociation solution and stained with 50 μLmL-1 propidium iodide （PI） with 5 min， then the PI emission fluorescence intensity was measured by flow cytometry. The results were as follows： （1） The average nuclear DNA content of nine Vaccinium bracteatum plants was （1.22±0.03） pg， the minimum value was 1.18 pg and the maximum was 1.27 pg. （2）The results were similar to the nuclear DNA content of the known diploid plants of Vaccinium， and there was no significant differences in DNA content of plants from different geographical origins （P>0.05）. It is speculated that these nine V. bracteatum plants are diploid plants. （3） The detected nuclear DNA contents （2C-value） of V. bracteatum can enrich the C-value database of Vaccinium. The nuclear DNA content detection method established based on FCM for V. bracteatum can provide reference for related research of other Vaccinium species.

Key words： Vaccinium bracteatum， nuclear DNA content， 2C-value， flow cytometry （FCM）

真核生物體細胞核中，染色體組數(shù)和DNA含量保持一定的數(shù)值，為了將DNA含量與染色體數(shù)目相區(qū)分，Swift et al.（1950）提出了C-值（C-value）的概念，C-值是指真核生物細胞中，沒有復制的單倍體細胞核（無論倍性水平）所含的DNA總量。C-值的單位可以用皮克（pg，1 pg=10-12 g）表示，1 pg DNA代表0.978×109堿基對（base pairs，bp）（Dolezel et al.， 2003）。C-值是植物的一項重要特征參數(shù)，與生物體的細胞大小、壽命、光合速率等生理參數(shù)有一定的相關(guān)性（Beaulieu et al.， 2007），同時C-值具有種的特征，也與植物的種群進化、遺傳信息總量等有密切關(guān)系，因此對植物的C-值進行研究有重要意義。目前，植物C-值數(shù)據(jù)庫（http：//data.Kew.org/cvalues/）包含超過8 500個種的數(shù)據(jù)，包括被子植物、裸子植物、蕨類、苔蘚、藻類的C-值數(shù)據(jù)，方便科研工作者查詢與分析。

核DNA含量一般被稱為含有2C的DNA含量（Dolezel & Bartos， 2005），這是由于在有絲分裂間期，細胞核含有兩份未復制的基因組拷貝。核DNA含量的測定方法主要有化學分析法、復性動力學法、孚爾根染色法（feulgen microdensitometry）、流式細胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）等方法?；瘜W分析法和復性動力學法現(xiàn)在已經(jīng)很少被使用了;孚爾根染色法操作復雜且結(jié)果不夠穩(wěn)定（Moscone， 2003）。Galbraith et al.（1983）報道了應用流式細胞術(shù)測定植物細胞周期檢測和細胞核DNA含量的研究，開辟了流式細胞術(shù)應用于植物研究的先河。流式細胞儀（flow cytometer）操作方便迅速，結(jié)果準確可靠，目前被廣泛應用于植物C-值的測定中（金亮等，2016），其工作原理是利用特殊的熒光染料與DNA堿基結(jié)合，激光照射被熒光染料染色的細胞會發(fā)射出熒光，由于熒光強度與DNA含量成正比的原理，通過測定細胞的熒光強度即可推算出樣本細胞的DNA含量。由于不同植物、組織中的細胞內(nèi)含物和次生代謝物質(zhì)不同，針對不同研究對象，采用適合的細胞核提取液配方、提取和染色方法是流式細胞術(shù)的應用難點。

目前，利用流式細胞術(shù)已經(jīng)測定了越橘屬7個種的核DNA含量（Costich et al.， 1993），分別是旱地藍莓（Vaccinium? pallidum）1.21 pg，北方越橘（V. boreale）1.18 pg，藍莓‘埃利奧特（ V. elliottii）1.26 pg，加拿大藍莓（V. myrtilloides）1.26 pg，南方藍莓（V. tenellum）1.30 pg，藍莓‘達柔（V. darrowi）1.31 pg，北高叢藍莓（V. corymbosum）1.33 pg。然而尚無關(guān)于越橘屬植物烏飯樹核DNA含量的研究報道。烏飯樹（V. bracteatum）又名南燭，古稱染菽，是屬于越橘屬的常綠灌木。在我國主要分布在浙江、福建、江西、湖南、江蘇和臺灣等地的丘陵地帶。烏飯樹具有很高的營養(yǎng)價值和保健功能（Lee et al.， 2014），亦是不可多得的盆景及園林綠化樹種。烏飯樹作為一種特色保健鄉(xiāng)土樹種，具有極高的開發(fā)利用價值，但是其基因與基因組層面的研究甚少，嚴重限制了種質(zhì)資源的利用和育種進程。本試驗摸索烏飯樹的流式細胞術(shù)測定方法，檢測烏飯樹野生單株的核DNA含量，并分析基因組倍性情況以及核DNA含量變化與種質(zhì)地理來源之間的關(guān)系，以期為烏飯樹的種質(zhì)資源研究、基因組學和倍性育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

以來自3個省份的9個野生烏飯樹單株為研究對象，其來源省份見表1。以植物鮮嫩葉片為材料，標準植物水稻‘日本晴（Oryza sativa subsp. japonica ‘Nipponbare， 2C=0.795）（Sasaki & Burr， 2000）為內(nèi)部標樣。

1.2 標本制作

1.2.1 解離液選擇與熒光染料配制 采用LB01、Galbraiths、WPB、GPB和Tris-MgCl25種配方進行試驗，找出測定烏飯樹基因組的最佳解離液配方。配制碘化丙啶PI染色液（50 μL 瘙 簚 mL-1，含RNA酶），4 ℃保存。

1.2.2 細胞核懸液制備與DNA特異性染色 制備待測樣、標樣、待測樣+標樣混合的細胞核懸液。取待測樣品和標樣嫩葉各50 mg，一起放入置于冰上的塑料平皿中，加入1 mL預冷的解離液，用鋒利刀片迅速切碎葉片。使用移液槍吸取塑料平皿中的解離液（棄去碎材料），置于1.5 mL EP管，用孔徑為40 μm無菌注射式過濾器過濾，得濾液至新管內(nèi)，置于冰上孵育5 min。4 ℃，800 r·min-1離心5 min，小心吸取上清置于新管中。再加入500 μL 配置好的PI-Rnase染液，避光染色5～10 min。另取待測樣品、標樣的嫩葉各50 mg，按照同樣的方法分別備至細胞核懸液作為空白對照，空白對照以同樣的方法進行染色。將染色的細胞核懸液轉(zhuǎn)入標準上樣管中，上機測定。

1.3 流式細胞儀檢測及分析

利用BD InfluxTM流式細胞儀對染色后的細胞核懸液樣品上機檢測，采用488 nm的激光激發(fā)，收集670/30通道的熒光，檢測熒光強度。每個待測樣品收集約10 000個細胞，每管樣品測試3次，并在不同日期進行2次重復，取平均值計算。

使用儀器自帶軟件進行作圖分析。已知核DNA含量的水稻‘日本晴的實生幼苗為參照樣本，按照以下公式計算得到待測樣品的核DNA含量，其中G0/G1峰的變異系數(shù)（coefficient of variation，CV=標準差/平均值×100%）CV值大于5%的結(jié)果予以舍棄（Arumuganathan & Earle， 1991a）。并根據(jù)1 pg DNA =978 Mp，計算烏飯樹的基因組大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 解離液的選擇

由于不同解離液對不同植物的解離效果存在明顯差異，在烏飯樹核DNA含量檢測前，比較5種植物常用的解離液（LB01、Galbraiths、WPB、GPB和Tris-MgCl2）對烏飯樹葉片的解離效果。發(fā)現(xiàn)GPB解離液對烏飯樹和水稻葉片細胞核的解離效果最佳，其細胞核懸液的濃度較高，上機檢測能得到較好的熒光信號：噪音少、峰形佳、面積相對較大，變異系數(shù)控制在5%以內(nèi)。因此，本研究采用GPB解離液制樣進行測試。

2.2 待測樣品的熒光強度范圍確定

為了控制試驗誤差，試驗采用內(nèi)標法進行測定，經(jīng)查詢、比較常用的植物標樣和部分越橘屬植物的2C-值后，選擇水稻‘日本晴作為標準樣品。以水稻‘日本晴、烏飯樹樣本單獨上機檢測，通過觀察流式細胞術(shù)檢測圖中峰的位置，初步確定標樣與待測樣本的熒光強度范圍。在同一檢測模板下，水稻‘日本晴的熒光強度峰值在10 000附近（圖1），烏飯樹的熒光強度峰值在17 000附近（圖2）。由于細胞核的熒光強度與核DNA含量成正比，說明水稻‘日本晴的核DNA含量小于烏飯樹;同時可以推測，在下一步混合樣本的流式細胞術(shù)檢測圖中，代表水稻的峰應位于流式細胞術(shù)檢測圖的左側(cè)，而代表烏飯樹樣品的峰應位于圖的右側(cè)。

2.3 烏飯樹核DNA含量（2C-值）的測定結(jié)果

分別將9份烏飯樹測試樣本與水稻標樣的混合樣本上機測試，測試結(jié)果如圖3所示，水稻與烏飯樹混樣的主峰區(qū)分度良好，均清晰且無重疊，說明本試驗方法準確可行。分別比較各烏飯樹測試樣本與水稻標樣的G0/G1期峰值相對位置，圖中左側(cè)的P1峰代表標樣水稻‘日本晴的熒光強度，右側(cè)的P2峰代表烏飯樹測試樣本的熒光強度。

烏飯樹測試樣品的核DNA含量（2C-值）見表2。9個樣本的平均核DNA含量（2C-值）為1.22 pg，標準差為0.03。最大的是樣本6號，為1.27 pg，最小的是樣本5號，為1.18 pg。經(jīng)單因素方差分析（表3），不同省份的野生單株之間核DNA含量無顯著差異（P>0.05），說明烏飯樹核DNA含量沒有因地理分布不同而產(chǎn)生進化差異。檢測結(jié)果與已知的二倍體越橘品種的核DNA含量（1.18～1.31 pg）相似，且前人的研究表示三、四倍體越橘品種的核DNA含量顯著大于二倍體（P<0.05）（Costich et al.， 1993），因此，推測本試驗鑒定的9個單株均為二倍體植株。

一般認為植物DNA 1 pg相當于978 Mb。本試驗測得烏飯樹核DNA含量（2C-值）為（1.22±0.03）pg，推測烏飯樹基因組大小約為（1 194.39±29.07）Mb。

3 討論

本研究首次利用流式細胞術(shù)檢測烏飯樹核DNA含量（2C-值）。測試得到烏飯樹野生單株核DNA含量（2C-值）平均值為（1.22±0.03）pg，基因組大小約為（1 194.39± 29.07）Mb。檢測單株與越橘二倍體品種的核DNA含量近似，且不同省份來源的野生單株的核DNA含量無顯著差異（P>0.05），推測供試單株均為二倍體植株。本研究旨在為烏飯樹基因組學研究、遺傳多樣性研究和育種工作奠定基礎(chǔ)。

流式細胞術(shù)根據(jù)樣本的相對熒光強度來分析其DNA含量，是一種快速準確鑒定植物基因組大小及倍性的方法。前人利用流式細胞術(shù)檢測越橘屬植物2C-值時使用的解離液（Arumuganathan & Earle， 1991a）和外標樣品（Costich et al.， 1993）（虹鱒魚紅細胞），目前已不常在植物研究中使用，因此本研究自行摸索了烏飯樹的流式細胞術(shù)試驗方法。最終采用水稻‘日本晴作為內(nèi)標，選擇GPB解離液，使用紅色或鮮綠色的烏飯樹鮮葉制備細胞懸浮液，經(jīng)50 μL 瘙 簚 mL-1 PI溶液染色5 min即可上機檢測。該方法相比于前人對越橘屬植物的測定方法簡化了許多，結(jié)果重復性較好，CV值控制在5%，可為本屬其他植物的流式細胞術(shù)研究提供參考。

本研究隨機挑選了分布在江蘇、湖南、江西的9個單株，檢測結(jié)果均為二倍體植株。這與越橘屬其他植物的基因組特性（孫海悅和張亞東，2014）有類似之處，生長在美國東南部溫暖濕潤地區(qū)的常綠越橘（Vaccinium darrowi）、兔眼越橘（V. virgatum）、小穗越橘（V. tenellum）都是二倍體植株（2n=2x=24）;生長在嚴寒地區(qū)的北高叢藍莓、矮叢越橘（狹葉越橘為主）品種多是四倍體植株（2n=4x=48）。烏飯樹與其他越橘屬植物的分布范圍不同，目前只發(fā)現(xiàn)生長在溫暖濕潤的地區(qū)，尤其是丘陵地帶或海拔400～1 400 m的山地（郝娟娟，2010），結(jié)合本試驗的結(jié)果，推測烏飯樹可能是二倍體植物。但由于試驗檢測的烏飯樹單株數(shù)量較少，尚不能確定烏飯樹是否存在三、四、六倍體，還需要檢測更多植株，尤其是生長量大、株高較高，以及生長在低溫地區(qū)的植株。同時，在今后的育種工作中，可以利用烏飯樹的耐熱和低冷溫需要量基因，對耐冷的北方越橘品種進行改良，擴大其種植適應范圍。

越橘屬植物種類繁多，并且經(jīng)過長期的自然選擇，遺傳變異豐富，前人研究發(fā)現(xiàn)，越橘屬不同倍性植株的核DNA含量大小存在顯著差異（P<0.05），甚至在二倍體品種之間也存在一定差異（Costich et al.， 1993），這種現(xiàn)象在其他植物中也被證實存在（吳麗萍等，2013;陳丙以等，2015;林峰等，2017）。本研究中不同省份的烏飯樹二倍體單株核DNA含量沒有顯著差異（P>0.05），暗示這些烏飯樹的核DNA含量可能沒有受到地理環(huán)境影響而發(fā)生遺傳進化。但對于不同地理環(huán)境是否造成種群遺傳進化差異，僅根據(jù)本次試驗結(jié)果，尚無法得出確定的結(jié)論，可以利用分子標記開展不同種源種質(zhì)的遺傳多樣性的研究，進一步了解烏飯樹種質(zhì)的遺傳進化進程。

根據(jù)植物C-值大小的5個等級（Leitch et al.， 1998; Soltis et al.， 2003）劃分，烏飯樹屬于“很小（1C-值≤1.4 pg）”的植物;利用測得的二倍體單株的核DNA含量預測，烏飯樹基因組大小約為（1 194.39 ± 29.07）Mb。對照前人的研究結(jié)果（Arumuganathan & Earle， 1991b），估計烏飯樹基因組大小是擬南芥的4倍，玉米的1/5，番茄的1/2，遠大于木瓜、芒果、杏、櫻桃、橙和覆盆子等水果植物。該結(jié)果能夠為烏飯樹基因組的研究提供一些依據(jù)。

目前，國內(nèi)尚無關(guān)于烏飯樹核DNA含量的研究報道，本研究結(jié)果可以豐富越橘屬植物的C-值庫，基于流式細胞術(shù)建立的烏飯樹核DNA含量測定方法可為加快越橘屬植物的相關(guān)研究提供借鑒。

參考文獻：ARUMUGANATHAN K， EARLE ED， 1991a. Estimation of nuclear DNA content of plants by bow cytometry? [J]. Plant Mol Biol Rep， 9（3）：229-241.

ARUMUGANATHAN K， EARLE ED， 1991b. Nuclear DNA content of some important plant species? [J]. Plant Mol Biol Rep， 9（3）：208-218.