?朱頂紅的組培快繁技術(shù)研究?

?黃敏 梁春輝 許雯 岳海林 許潔珊 董斌?

摘 要：以朱頂紅鱗莖為材料，研究了朱頂紅離體培養(yǎng)中各環(huán)節(jié)的關(guān)鍵技術(shù)，包括外植體具體部位的選取、外植體的消毒方式、增殖培養(yǎng)基及生根培養(yǎng)基的優(yōu)化等，初步建立了朱頂紅的組培快繁體系。結(jié)果表明：宜以朱頂紅下部鱗莖為外植體;最佳消毒方式為先使用75%酒精消毒30 s，再使用2% NaClO消毒18 min，無(wú)菌水沖洗后接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中;從誘導(dǎo)出的叢芽上切取含1～2 個(gè)芽的部分接入到增殖培養(yǎng)基中，最佳增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+活性炭0.2 g/L+蔗糖25 g/L+瓊脂7 g/L，增殖率能達(dá)到4.82;最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS+1.0 mg/L NAA+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L，生根率為92.5%。

關(guān)鍵詞：朱頂紅;鱗莖;組織培養(yǎng);快繁

中圖分類(lèi)號(hào)：S682.25 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-060X（2020）05-0001-03

Study on Tissue Culture and Rapid Propagation Techniques for Amaryllis vittata

HUANG Min，LIANG Chun-hui，XU Wen，YUE Hai-lin，XU Jie-shan，DONG Bin

（Guangdong Agriculture Industry Business Polytechnic， Guangzhou 510507， PRC）

Abstract： The in vitro culture of Amaryllis vittata was conducted using its bulb as explant material to determine the sterilization time of explants， specific parts cut for explants， optimal proliferation medium and rooting medium， then a rapid propagation system for Amaryllis vittata tissue culture was established. The optimal protocol for Amaryllis vittata tissue culture was that the pieces from the lower part of a bulb were used as the explants， disinfected with 75% alcohol for 30 s， with 2% NaClO for 18 min， then washed with sterile water， finally inserted into the induction medium; the part containing 1 or 2 buds was cut from the induced cluster buds and inserted into the proliferation medium; the optimal proliferation medium was MS + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 1.0 mg/L + AC 0.2g/L + sucrose 25 g/L + agar 7.0 g/L， with a proliferation rate of 4.82;? the optimal rooting medium was 1 /2 MS + NAA 1.0 mg/L + sucrose 30 g/L + agar 7.0 g/L， with a rooting rate of 92.5%.

Key words： Amaryllis vittata; bulb; tissue culture; rapid propagation

朱頂紅（Amaryllis vittata）又名朱頂蘭、孤挺花、百枝蓮，是石蒜科朱頂紅屬多年生草本植物，球形鱗莖，葉略帶肉質(zhì)，花大而挺立，具有較高的觀賞價(jià)值[1-3]。朱頂紅在中國(guó)的商品化栽培起步較晚，繁殖技術(shù)相對(duì)落后，目前中國(guó)生產(chǎn)所用的優(yōu)質(zhì)種球絕大部分依賴(lài)進(jìn)口，從而導(dǎo)致其生產(chǎn)成本居高不下[4-5]。朱頂紅自花不實(shí)，一般通過(guò)分球繁殖，但這種方法繁殖系數(shù)較低，無(wú)法滿(mǎn)足市場(chǎng)需求，且長(zhǎng)期的無(wú)性繁殖也容易積累和傳播病毒[6]。植物組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)則是改善和提高朱頂紅繁殖質(zhì)量和數(shù)量的理想途徑[7]。因此，筆者以朱頂紅鱗莖為材料進(jìn)行組培快繁技術(shù)優(yōu)化研究，以期建立朱頂紅組培快繁體系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為直徑6～8 cm大小的朱頂紅鱗莖，取自廣東農(nóng)工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院溫室，品種為冰雪皇后，鱗莖健壯飽滿(mǎn)無(wú)病。

1.2 試驗(yàn)方法

將種球在陰涼通風(fēng)環(huán)境下存放2～3 d，然后剝?nèi)ネ鈱痈煽蓣[片，切除種球根部，用自來(lái)水沖洗干凈后置于超凈工作臺(tái)上備用。

1.2.1 最適消毒時(shí)間的選擇 將沖洗干凈的鱗莖種球首先用75%酒精浸泡30 s，用無(wú)菌水沖洗3～4次，接著用2% NaClO溶液分別浸泡8、10、15、18、20 min，然后無(wú)菌水沖洗3～4次，沖洗過(guò)程中反復(fù)搖動(dòng)，消毒完畢后用無(wú)菌紙吸干外植體表面的水分，將鱗片切成帶有鱗莖下盤(pán)基部的長(zhǎng)條形，在無(wú)菌條件下將外植體接入MS基本培養(yǎng)基中，每個(gè)處理接種20瓶，重復(fù)2次，隨后將材料置于25±2℃、光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx的環(huán)境條件下培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)污染率、死亡率及存活率。

1.2.2 最佳外植體的選擇 在無(wú)菌條件下，將已消毒的鱗莖橫切分成上、中、下3個(gè)部分，分別接入配方為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中[8]，每個(gè)處理接種20瓶，重復(fù)2次，隨后將材料置于25±2℃、光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx的環(huán)境條件下培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)污染率和生長(zhǎng)情況。

1.2.3 最佳增殖培養(yǎng)基的篩選 從誘導(dǎo)的鱗莖叢芽上切取含1～2 個(gè)芽的部分轉(zhuǎn)接至不同的增殖培養(yǎng)基中，通過(guò)4因素3水平的正交設(shè)計(jì)L9（34）（表1）優(yōu)化培養(yǎng)基配方，共9個(gè)處理，增殖培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的6-BA（1.0、2.0、3.0 mg/L）、NAA（0.5、1.0、1.5 mg/L）、活性炭（0.2、0.5、1.0 g/L）、蔗糖（20、25、30 g/L），每個(gè)處理接種20瓶，重復(fù)2次，接種后將材料置于25±2℃、光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx的環(huán)境條件下培養(yǎng)，接種后每隔5 d觀察一次，統(tǒng)計(jì)污染率和增殖情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒時(shí)間對(duì)朱頂紅鱗莖消毒效果的影響

由表2可知，在同樣使用2% NaClO溶液對(duì)朱頂紅鱗莖進(jìn)行消毒處理的情況下，不同消毒時(shí)長(zhǎng)對(duì)外植體的消毒效果存在影響。從消毒效果來(lái)看，隨著消毒時(shí)間的延長(zhǎng)，污染數(shù)減少，污染率逐漸降低，當(dāng)消毒時(shí)間達(dá)到20 min時(shí)，污染率最低，僅為15 %。從存活率來(lái)看，當(dāng)消毒時(shí)間高于18 min時(shí)，外植體的存活率明顯降低，當(dāng)消毒時(shí)長(zhǎng)達(dá)到20 min時(shí)，存活率僅為30%。因此，綜合考慮污染率和存活率，使用2% NaClO溶液消毒18 min是朱頂紅鱗莖組織培養(yǎng)的最優(yōu)消毒方案。

2.2 不同部位鱗片對(duì)朱頂紅外植體誘導(dǎo)的影響

從表3可以看出，以鱗片不同部位作為外植體，朱頂紅外植體的誘導(dǎo)情況不同，不同取材部位誘導(dǎo)能力由強(qiáng)到弱依次為下部>中部>上部，下部的誘導(dǎo)率達(dá)到80.0%，鱗莖凸面完全轉(zhuǎn)綠，凹面出現(xiàn)大量愈傷組織，愈傷組織內(nèi)部出現(xiàn)白色凸起物。而從污染率來(lái)看，下部鱗片的污染率卻最高，達(dá)到20.0%。但總體看來(lái)，下部鱗片仍是最優(yōu)的選擇。

2.3 不同培養(yǎng)基配方對(duì)朱頂紅不定芽增殖的影響

從表4可以看出，培養(yǎng)基的不同成分對(duì)朱頂紅誘導(dǎo)增殖的影響不同，在所選擇的4個(gè)因子中，隨著6-BA、NAA和蔗糖濃度的上升，增殖系數(shù)呈先上升后下降的趨勢(shì)，且3個(gè)水平差異明顯;隨著活性炭濃度的上升，增殖系數(shù)呈先下降后上升的趨勢(shì)。從表4還可以得出，不同試驗(yàn)因子對(duì)朱頂紅鱗莖增殖系數(shù)的極差（R）順序?yàn)椋篘AA>6-BA>活性炭>蔗糖;因此，在4個(gè)因子中，NAA對(duì)朱頂紅鱗莖增殖效果的影響最大，而蔗糖的影響最小。由K值可知，朱頂紅鱗莖增殖的最適培養(yǎng)基配方為A2B2C1D2，即：MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+活性炭0.2 g/L+蔗糖25 g/L+瓊脂7 g/L。

2.4 培養(yǎng)基中NAA濃度對(duì)朱頂紅生根的影響

朱頂紅生根過(guò)程選用1/2 MS為基本培養(yǎng)基，從表5可以看出，隨著NAA濃度的提高，生根率、生根數(shù)及生長(zhǎng)勢(shì)均呈先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)NAA濃度為1.0 mg/L時(shí)，其生根率及平均生根數(shù)在幾個(gè)處理中均為最高，且生長(zhǎng)狀態(tài)好。綜合考慮生根數(shù)量和質(zhì)量，認(rèn)為1/2MS+1.0 mg/L NAA為最佳生根培養(yǎng)基。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)以朱頂紅鱗莖為外植體，研究朱頂紅離體培養(yǎng)各環(huán)節(jié)的關(guān)鍵技術(shù)，包括外植體的消毒、外植體最佳部位的選取、增殖培養(yǎng)基及生根培養(yǎng)基的優(yōu)化等。

在植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，選擇合適的外植體是關(guān)鍵。目前在朱頂紅的組培上多數(shù)以鱗莖為外植體，多項(xiàng)研究中用朱頂紅鱗莖誘導(dǎo)不定芽都取得了較好的效果[9-11];劉鐸等[8]研究表明在朱頂紅鱗莖的誘導(dǎo)中，最適部位為鱗莖下部。筆者的試驗(yàn)結(jié)果與其一致，下部鱗莖的誘導(dǎo)率最高。

培養(yǎng)基是組培苗最主要的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，培養(yǎng)基的成分很大程度上決定了組培苗的生長(zhǎng)及繁殖水平，該研究主要優(yōu)化了朱頂紅增殖和生根的培養(yǎng)基，在增殖培養(yǎng)基的優(yōu)化中采用的是正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，該方法能大幅度減少了試驗(yàn)次數(shù)，節(jié)省成本[12]，試驗(yàn)結(jié)果顯示在6-BA、NAA、活性炭和蔗糖這4個(gè)組分中，NAA對(duì)朱頂紅鱗莖增殖效果的影響最大，而蔗糖的影響最小，最佳不定芽增殖培養(yǎng)基為：MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+活性炭0.2 g/L+蔗糖25 g/L+瓊脂7 g/L。根據(jù)前人對(duì)朱頂紅增殖培養(yǎng)基的研究，發(fā)現(xiàn)在朱頂紅不定芽增殖試驗(yàn)中應(yīng)用最多的激素組合是也是NAA和6-BA[13-14]。

該研究初步建立了朱頂紅的組培繁殖體系，以朱頂紅下部鱗莖為外植體，先使用75%酒精消毒30 s，再使用2% NaClO消毒18 min，無(wú)菌水沖洗后接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中;從誘導(dǎo)出的叢芽上切取含1～2 個(gè)芽的部分接入到增殖培養(yǎng)基中，最佳增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+活性炭0.2 g/L+蔗糖25 g/L+瓊脂7 g/L，增殖率能達(dá)到4.82，最佳生根培養(yǎng)基為：1/2 MS+1.0 mg/L NAA+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L，生根率為92.5%。

20世紀(jì)80年代就有朱頂紅組織培養(yǎng)的相關(guān)報(bào)

道[15]。目前，朱頂紅的組培快繁技術(shù)主要是采用小鱗莖為外植體[3]，雖然取得了一定的成果，但到目前為止還沒(méi)有形成規(guī)?；纳a(chǎn)。因此，對(duì)于朱頂紅組培快繁過(guò)程中的關(guān)鍵技術(shù)還需要進(jìn)一步的研究和驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王紀(jì)方，賈春蘭，金 波. 朱頂紅組培株生長(zhǎng)習(xí)性的觀察[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，1989，22（1）：53-56.

[2] 韋三立. 花卉組織培養(yǎng)[M]. 北京：中國(guó)林業(yè)出版社，2001.

[3] 汪華清，高歡歡，朱秀鵬，等. 朱頂紅在華南地區(qū)的栽培技術(shù)與園林應(yīng)用[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2019，25（17）：41-43，96.

[4] 魯嬌嬌，嚴(yán) 瑞，何香杉，等. 朱頂紅‘Red Lion胚性愈傷組織誘導(dǎo)及體細(xì)胞胚發(fā)生[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2016，43（12）：2451-2460.

[5] 希吉日，田 欣，金牧蘭，等. 基于朱頂紅愈傷組織途徑誘導(dǎo)形成原球莖的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（13）：51-54.

[6] 王 暉. 東方百合切花華東地區(qū)生產(chǎn)栽培技術(shù)[J]. 中國(guó)花卉園藝，2005（14）：12-14.

[7] 陳漢鑫，余松金，萬(wàn)學(xué)鋒，等. 朱頂紅的組培快繁技術(shù)[J]. 福建林業(yè)科技，2016，43（3）：170-173，186.

[8] 劉 鐸，梁樹(shù)樂(lè). 朱頂紅快繁無(wú)菌體系建立的研究[J]. 現(xiàn)代園藝，2018（3）：23-25.

[9] 孫紅梅，宋利娜. 大花朱頂紅鱗莖不定芽的誘導(dǎo)[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26（14）：247-250.

[10] 朱旭東，田松青. 朱頂紅的組織培養(yǎng)[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002，30（6）：56-57.

[11] 張亞玲，原雅玲，趙錦利. 朱頂紅組織培養(yǎng)最佳繁殖途徑的研究[A]. 中國(guó)園藝學(xué)會(huì)第七屆青年學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集[C]. 泰安：中國(guó)園藝學(xué)會(huì)，山東省園藝學(xué)會(huì)，山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006. 628-636.

[12] 劉瑞江，張業(yè)旺，聞崇煒，等. 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析方法研究[J]. 實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理，2010，27（9）：52-55.

[13] 張 松，達(dá)克東，曹辰興，等. 朱頂紅離體培養(yǎng)快速繁殖體系及胚狀體發(fā)生[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2002，29（3）：285-287.

[14] 田松青，朱旭東，成海鐘，等. 朱頂紅不同繁殖方法比較研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（5）：153-156.

[15] 沈苗苗，于曉南. 朱頂紅組織培養(yǎng)研究進(jìn)展[J]. 黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（10）：135-138.

（責(zé)任編輯：成 平）

收稿日期：2020-03-10

基金項(xiàng)目：2018年度廣東省普通高校青年創(chuàng)新人才類(lèi)項(xiàng)目（2018GK

QNCX059）;2019年“攀登計(jì)劃”廣東省大學(xué)生科技創(chuàng)新培育專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目（pdjh2019b0797）;2019年度廣東農(nóng)工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院熱帶作物應(yīng)用技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目（XJZX1902）

作者簡(jiǎn)介：黃 敏（1987—），女，湖南長(zhǎng)沙市人，實(shí)驗(yàn)師，主要從事植物組織培養(yǎng)研究。

通信作者：董 斌