miRNA-374對(duì)缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

趙征　李迎春　劉飛

摘要 目的 探討miRNA-374對(duì)心肌缺血再灌注損傷是否存在保護(hù)作用。方法 取SD新生大鼠，分離心肌組織細(xì)胞培養(yǎng)，隨機(jī)分為空白組（Blank）、陰性對(duì)照組（NC）（轉(zhuǎn)染miRNA-374陰性對(duì)照序列），miRNA-374模擬組（轉(zhuǎn)染miRNA-374模擬基因），miRNA-374抑制劑組（轉(zhuǎn)染 miRNA-374抑制劑）、siRNA-DTNA組（轉(zhuǎn)染siRNA-DTNA）和miRNA-374抑制劑siRNA-DTNA組（轉(zhuǎn)染miRNA-374抑制劑和siRNA-DTNA）。分別觀察各組心肌細(xì)胞超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和乳酸脫氫酶（LDH）的水平，并檢測(cè)各組心肌細(xì)胞增殖及凋亡情況。結(jié)果 ①過表達(dá)miRNA-374和DTNA會(huì)使AKT、Hes1、bcl2表達(dá)上升，使Notch1、DTNA、BAX、HIF-1α表達(dá)下降;②上調(diào)miRNA-374、下調(diào)DTNA能保護(hù)心肌細(xì)胞、促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖、改變心肌細(xì)胞的細(xì)胞周期、抑制心肌細(xì)胞凋亡。結(jié)論 miRNA-374通過介導(dǎo)DTNA下調(diào)，并阻斷Notch1通路，從而保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺血再灌注的損傷。

關(guān)鍵詞 miRNA-374;DTNA;心肌缺血再灌注損傷

中圖分類號(hào)? R743.3? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A? ? 文章編號(hào)? 1671-0223（2020）10-033-06

PROTECTIVE EFFECT OF MIRNA-374 ON ISCHEMIA-REPERFUSION INJURY Zhao Zheng，Li Yingchun，Liu Fei.Cangzhou Central Hospital，Cangzhou 061001，China

Abstract? Objective To explore the protective effect of miRNA-374 on myocardial ischemia-reperfusion injury.Methods SD neonatal rats were divided into blank group， negative control group （NC） （transfection of miRNA-374 negative control sequence），miRNA-374 simulation group （transfection of miRNA-374 analog gene） and miRNA-374 inhibitor group （transfection of miRNA-374 inhibitor）.siRNA-DNA group （transfected siRNA-DINA） and miRNA-374 inhibitor siRNA-DNA group （transfection of miRNA-374 inhibitors and siRNA-DTNA）.The levels of superoxide dismutase （SOD），malondialdehyde （MDA） and lactate dehydrogenase （LDH） in cardiac myocytes were observed.Results ①Overexpression of miRNA-374 and DTNA increased the expression of AKT，Hes1，bcl2， and decreased the expression of Notch1，DTNA，Bax，HIF-1α.②Upregulation of miRNA-374，down-regulation of DTNA can protect cardiomyocytes，promote cardiomyocyte appreciation，change the cell cycle of cardiomyocytes，and inhibit cardiomyocyte apoptosis.Conclusion miRNA-374 protects the cardiomyocytes from ischemia-reperfusion injury by mediating the down-regulation of DINA and blocking the Notch1 pathway.

Key words? miRNA-374;DTNA;Myocardial ischemia-reperfusion injury

心肌缺血再灌注損傷是指在心肌缺血一段時(shí)間后恢復(fù)組織血流灌注從而造成的組織損傷，通常會(huì)引起細(xì)胞死亡，導(dǎo)致梗死面積的擴(kuò)大，誘發(fā)心衰，并增加患者的死亡率[1-2]。合并ST段抬高的急性心肌梗死患者更容易經(jīng)歷再灌注損傷[3]，對(duì)于再灌注損傷最有效的治療是及時(shí)的冠脈溶栓治療以及經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療。目前對(duì)于心肌缺血再灌注損傷發(fā)生的原因尚不完全明了，可能與氧自由基、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、鈣超載等原因有關(guān)[4]。微小RNA（miRNA）屬于一個(gè)具有大約21個(gè)核苷酸短長度的非編碼RNA家族。有序列研究證明包括心臟纖維化、心肌肥大、心肌梗死、心力衰竭以及血管生成在內(nèi)的心血管疾病發(fā)病機(jī)制均涉及 miRNA。本研究亦通過miRNA-374感染心肌細(xì)胞，并通過一系列實(shí)驗(yàn)來探究miRNA-374對(duì)心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

從廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購買了SPF雄性大鼠（這項(xiàng)研究是嚴(yán)格按照美國國立衛(wèi)生研究院“保護(hù)和使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物指南”中的建議進(jìn)行的。該協(xié)議得到了滄州市中心醫(yī)院動(dòng)物保護(hù)與利用機(jī)構(gòu)委員會(huì)批準(zhǔn)）。處死后用眼科剪將大鼠心肌組織切成1mm3大小的組織塊，然后用D-Hanks液沖洗。去除上清液后加入含有0.15%膠原酶的低糖DMEM。隨后，將組織塊放到無菌離心管，在37℃的恒溫電磁攪拌器上放置30分鐘，99克，并轉(zhuǎn)速離心5分鐘，收集沉淀物，然后懸浮在含20%胎牛血清（FBS）的低糖DMEM中，99克，再次離心5分鐘。去除上清液，用D-Hanks液沖洗后，用0.25%胰蛋白酶（含0.02EDTA） 在37℃下作用7～9分鐘。加入含20%FBS的培養(yǎng)基，209克，離心5分鐘后收集沉淀，再懸浮于含20%FBS的DMEM后接種于新的培養(yǎng)皿中。將細(xì)胞懸液放置于含5%CO2的培養(yǎng)箱中37℃下連續(xù)培養(yǎng)，每隔2、3天換一次培養(yǎng)基。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

取指數(shù)生長的細(xì)胞，進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。分為空白組（Blank）、陰性對(duì)照組（NC）（轉(zhuǎn)染miRNA-374陰性對(duì)照序列），miRNA-374模擬組（轉(zhuǎn)染miRNA-374模擬基因），miRNA-374抑制劑組（轉(zhuǎn)染 miRNA-374抑制劑）、siRNA-DTNA組（轉(zhuǎn)染siRNA-DTNA）和miR-374抑制劑siRNA-DTNA組（轉(zhuǎn)染miRNA-374抑制劑和siRNA-DTNA）。

1.3 試驗(yàn)方法

將對(duì)數(shù)生長心肌細(xì)胞種植在六孔板中。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到30%～50%時(shí)，按脂質(zhì)2000（Invitrogen，Carlsbad，CA）的說明轉(zhuǎn)染。分別取各實(shí)驗(yàn)組細(xì)100 pmol，用250μL無血清Opti-mem培養(yǎng)基（Gibco，Grand Island，NY）稀釋后在室溫下孵育5分鐘。同時(shí)將250μL無血清Opti-MEM培養(yǎng)基與5μL Lipofectamine2000混合，室溫孵育5分鐘。將兩種制劑混合，室溫孵育20分鐘后將細(xì)胞種植到培養(yǎng)孔中，37℃下孵育6～8小時(shí)。最后，換成全培養(yǎng)基培養(yǎng)24～48小時(shí)后可收獲細(xì)胞。

1.4 大鼠心肌細(xì)胞超氧化物歧化酶、丙二醛和乳酸脫氫酶的檢測(cè)

收集轉(zhuǎn)染大鼠心肌細(xì)胞，置于冷凍離心機(jī)3221克離心15分鐘，用Eppendorf管收集部分上清液保存于?20℃環(huán)境。根據(jù)檢測(cè)試劑盒（中國上海Mlbio有限公司）的使用方法分別測(cè)定上清液中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和乳酸脫氫酶（LDH）的含量。SOD濃度用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定，而MDA的濃度則用其與硫代巴比妥鈉反應(yīng)的紅色產(chǎn)物的OD值間接測(cè)定。

1.5 大鼠心肌細(xì)胞增值能力的檢測(cè)

轉(zhuǎn)染后細(xì)胞匯合率達(dá)80%時(shí)，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶處理后產(chǎn)生單個(gè)細(xì)胞懸液。然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并以3×103- 6×103/孔的密度接種于96孔板。培養(yǎng)24、48和72小時(shí)后，將培養(yǎng)基換成10%的噻唑藍(lán)（MTT）溶液培養(yǎng)4小時(shí)。然后去掉上清液，加入100μL二甲基亞砜，在搖床上震蕩孵育10分鐘。測(cè)量每個(gè)孔在490 nm波長處的OD值。每個(gè)實(shí)驗(yàn)都是重復(fù)3次，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞活力曲線。

1.6 流式實(shí)驗(yàn)測(cè)細(xì)胞周期和凋亡

將細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后用0.25%胰蛋白酶消化并收集，將細(xì)胞密度調(diào)節(jié)為1×106個(gè)/mL。隨后，取1毫升的細(xì)胞懸液以453克離心10分鐘收集細(xì)胞，然后重新懸浮在2mLPBS中離心，用70%預(yù)冷乙醇溶液在4℃下固定。第二天對(duì)固定細(xì)胞進(jìn)行清洗。 用PBS清洗2次，過濾100μL細(xì)胞懸浮液（含有至少106m/L細(xì)胞）。隨后，將單細(xì)胞懸浮液與1mL碘化丙啶（PI）（50mg/mL）混合后在黑暗中孵育30分鐘。用流式細(xì)胞儀在488 nm處測(cè)定細(xì)胞周期。

用V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。收集細(xì)胞的方法與細(xì)胞周期檢測(cè)方法相同。然后添加了V-FITC（10μL）和PI（5μL）。 將細(xì)胞在黑暗中孵育15分鐘后加入300μL結(jié)合緩沖液后，用流式細(xì)胞儀在488 nm處檢測(cè)到細(xì)胞凋亡。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用方差分析方法，兩兩比較采用方差分析方法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組miRNA-374、相關(guān)基因的mRNA及蛋白水平比較

轉(zhuǎn)染結(jié)束后通過RT-PCR和Western來分析比較各組miRNA374的表達(dá)情況，以及AKT、Hes1、bcl、Notch1、DTNA、BAX、HIF-1α的細(xì)胞因子的基因和蛋白表達(dá)水平，見圖1。兩兩比較結(jié)果顯示，各指標(biāo)空白組和陰性對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;miRNA374模擬組的AKT、Hes1、bcl2、表達(dá)水平高于空白組和陰性對(duì)照組（P<0.05），Notch1、DTNA、BAX、HIF-1α表達(dá)水平低于空白組和陰性對(duì)照組（P<0.05）;與陰性對(duì)照組比較，miRNA-374的表達(dá)水平在miRNA模擬組和siRNA-DTNA組均明顯升高，兩組中AKT、Hes1、bcl2表達(dá)均上升，Notch1、DTNA、BAX、HIF-1α表達(dá)均下降，但兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。miRNA-374抑制劑組中的AKT、Hes1、bcl2表達(dá)下降，而Notch1、DTNA、BAX、HIF-1α表達(dá)上升（P<0.05）。

2.2 各組心肌細(xì)胞SOD、MDA、LDH含量比較

提取并比較各組心肌組織中SOD、MDA、LDH的表達(dá)水平。兩兩比較結(jié)果顯示，與空白組和陰性對(duì)照組相比，過表達(dá)miRNA374會(huì)導(dǎo)致SOD水平明顯上升和MDA、LDH明顯下降;下調(diào)表達(dá)DTNA會(huì)導(dǎo)致SOD水平明顯下降和MDA、LDH明顯上升;SOD、MDA、LDH的水平在miRNA-374抑制劑siRNA-DTNA組無明顯改變;這證明上調(diào)miRNA374、下調(diào)DTNA能保護(hù)心肌細(xì)胞，見表1。

2.3 各組細(xì)胞增殖能力的比較

經(jīng)過處理后的各組細(xì)胞被接種于96孔板，于相應(yīng)時(shí)間后收集并計(jì)數(shù)。通過MTT實(shí)驗(yàn)與0、24、48、72小時(shí)觀察細(xì)胞增殖情況。各組細(xì)胞的增殖情況在24小時(shí)無明顯差異，在48、72小時(shí)開始出現(xiàn)差異（P<0.05）?？瞻捉M和陰性對(duì)照組之間各個(gè)時(shí)間段細(xì)胞殖情況差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，siRNA374模擬組和siRNA-DTNA組心肌細(xì)胞增殖能力增強(qiáng);而siRNA374抑制劑組細(xì)胞增殖能力下降;miR-374抑制劑+siRNA-DTNA組細(xì)胞的增殖能力無明顯變化（P>0.05）。這證實(shí)過表達(dá)miR-374、抑制DTNA能增強(qiáng)心肌細(xì)胞增殖能力，見圖2。

2.4 各組細(xì)胞周期分布

通過PI染色來觀察細(xì)胞周期分布。miR-374抑制劑組與空白組和陰性對(duì)照組之間細(xì)胞周期分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖3。

2.5 各組細(xì)胞凋亡比較

各組心肌細(xì)胞的凋亡率檢測(cè)結(jié)果，見圖4?？瞻捉M、陰性對(duì)照組、miRNA-374組、siRNA-DTNA組、miRNA-374抑制劑組、和miRNA-374抑制劑siRNA-DTNA組的凋亡率分別為：（34.18±2.78）%，（31.18±2.44）%，（20.36±

1.74）%，（18.37±2.21）%，（45.59±3.43）%，（32.19±2.20）%。凋亡率在空白組和NC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;與空白組比較，miRNA-374組和siRNA-DTNA組的凋亡率明顯下降（P<0.05）;miRNA-374抑制劑組的凋亡率比空白組明顯增加（P<0.05）;miRNA-374抑制劑siRNA-DTNA組的凋亡率與空白組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。表明上調(diào)miRNA374、下調(diào)DTNA能抑制心肌細(xì)胞凋亡。

3 討論

心肌缺血再灌注損傷是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，缺血器官損傷和炎癥介導(dǎo)再灌注損傷的分期不同，但相互關(guān)聯(lián)[5]。心肌缺血再灌注損傷對(duì)心臟術(shù)后早期心功能的損害存在一定影響 [6]. 此外，心肌缺血再灌注損傷與炎癥、內(nèi)皮功能障礙、凋亡和壞死密切相關(guān)[7-8]?，F(xiàn)如今對(duì)于惡性心血管疾病的處理措施不僅僅是恢復(fù)心臟的血供，而且要同時(shí)預(yù)防由于缺血-再灌注帶來的心肌損傷。

隨著對(duì) Micro RNA越來越多的研究，其在心臟保護(hù)方面的作用逐漸被發(fā)現(xiàn)。先前的研究表明，miRNA-21通過Akt和Bcl-2/Bax途徑對(duì)心臟缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用[9] .本研究中我們通過miRNA-374感染心肌細(xì)胞，并通過一系列實(shí)驗(yàn)來探究miRNA-374對(duì)心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷的作用。NOTCH 1是Notch家族的成員之一，在許多癌癥中調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、凋亡、遷移和侵襲[10]。先前的研究表明[11-12]，NOTCH信號(hào)可以被上調(diào)的miRNA-34a所抑制。另有研究發(fā)現(xiàn)褪黑素[13]可以通過降低Bax的表達(dá)從而抑制心肌細(xì)胞凋亡。Cao等[14]證實(shí)了在H9C2細(xì)胞系中上調(diào)野生型DTNA可以抑制心房利鈉因子（ANF）和腦利鈉肽（BNP）的轉(zhuǎn)錄，表明DTNA通過作用于 ANF和BNP進(jìn)而保護(hù)心肌細(xì)胞的功能。DTNA是miRNA-374的目標(biāo)蛋白，過表達(dá)miRNA-374會(huì)使DTNA表達(dá)下調(diào)，同時(shí)阻斷Notch1通路。培養(yǎng)正常心肌細(xì)胞，過表達(dá)miRNA-374，心肌細(xì)胞活性增強(qiáng)，凋亡和壞死減少，處于細(xì)胞周期S階段的心肌細(xì)胞數(shù)量增加。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miRNA-374會(huì)介導(dǎo)DTNA下調(diào)，并阻斷Notch1通路，上調(diào)miR-374和下調(diào)DTNA可增加Akt、Hes1和bcl-2的表達(dá)，而減少Notch 1、bax和HIF-1α的表達(dá)，從而保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺血再灌注的損傷。此結(jié)論與之前所發(fā)布的報(bào)告結(jié)論一致[15]。

綜上所述，我們的研究表明，miRNA-374下調(diào)DTNA，阻斷Notch 1軸，進(jìn)一步保護(hù)大鼠心肌缺血再灌注損傷。本研究為心肌缺血再灌注損傷的治療提供了新的思路。然而，還需要進(jìn)一步研究miRNA-374影響心肌I/R損傷的具體機(jī)制。

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[2020-4-27收稿]

作者單位：061001 河北省滄州市中心醫(yī)院