氣相色譜法測定糖精鈉中鄰、對甲苯磺酰胺含量

張東閣 郭艷玲 宇杰

[摘要]目的 建立氣相色譜法（GC）測定糖精鈉中鄰、對甲苯磺酰胺。方法 DB-17MS毛細管色譜柱，初始溫度180℃保持20 min，以10℃/min升至260℃，保持32 min。結(jié)果 鄰甲苯磺酰胺在11.80～223.60 μg/ml（r=1）內(nèi)峰面積與濃度呈良好線性關系，平均加樣回收率為96.58%，RSD為5.73%（n=6）。對甲苯磺酰胺在10.15～203.00 μg/ml（r=1）內(nèi)峰面積與濃度呈良好線性關系，平均加樣回收率為103.99%，RSD為2.83%（n=6）。6個批次的糖精鈉中鄰、對甲苯磺酰胺含量測定由于結(jié)果低于檢測限，未檢出，符合藥典要求。結(jié)論 GC測定糖精鈉中甲苯磺酰胺含量操作簡便、準確，可作為糖精鈉的質(zhì)量評價標準。

[關鍵詞]氣相色譜法;糖精鈉;甲苯磺酰胺;含量測定

[中圖分類號] R917? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2020）5（c）-0031-05

Content determination of o/p-toluenesulfonamide in saccharin sodium by the gas chromatography

ZHANG Dong-ge1，2? ?GUO Yan-ling2? ?YANG Yu-jie1

1. Chengde Medical University， Hebei Province， Chengde? ?067000， China; 2. Jingfukang Pharmaceutical Group Co.， Ltd.， Hebei Province， Chengde? ?067000， China

[Abstract] Objective To establish the gas chromatography for the determination of o/p-toluenesulfonamide in saccharin sodium. Methods DB-17MS chromatographic column was applied， the initial temperature was set at 180 ℃ for 20 min， and then heated up to 260℃ at 10℃/ min and maintained for 32 min. Results The peak area of o-toluenesulfonamide in 11.80-223.60 μg/ml （r=1） showed a good linear relationship with the concentration， the average sample recovery rate was 96.58%， and the RSD was 5.73% （n=6）. The peak area of p-toluenesulfonamide in 10.15-203.00 μg/ml （r=1） showed a good linear relationship with the concentration， the average sample recovery rate was 103.99%， and the RSD was 2.83% （n=6）. The content of o/p-toluenesulfonamide in saccharin sodium in 6 batches was not detected because the results were lower than the detection limit， which met the requirements of the pharmacopoeia. Conclusion The GC for the determination of toluenesulfonamide in saccharin sodium is simple and accurate， and can be used as a quality evaluation standard for saccharin sodium.

[Key words] Gas chromatography; Saccharin sodium; Toluenesulfonamide; Content determination

糖精鈉是一種常用的甜味劑，據(jù)報道，在美國廣泛應用于食品和醫(yī)藥行業(yè)[1]。糖精鈉甜度是蔗糖的300～500倍，除了在味覺引起甜的感覺外，對人體無任何營養(yǎng)價值，安全性至今存在較大爭議[2-3]。糖精鈉利用甲苯法生產(chǎn)過程中，一般會生成甲苯磺酰胺這種中間品，由于生產(chǎn)過程中氧化不徹底，未完全反應的甲苯磺酰胺未完全分離，而甲苯磺酰胺屬于致癌物[1]。甲苯磺酰胺包括鄰甲苯磺酰胺和對甲苯磺酰胺，兩種成分為同分異構(gòu)體。另有文獻報道糖精鈉中鄰、對甲苯磺酰胺通常認為有致癌作用，所以樣品中這兩種雜質(zhì)的測試十分重要[4]。國內(nèi)外標準均控制糖精鈉中雜質(zhì)鄰、對甲苯磺酰胺的含量[5]。聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織食品附加劑聯(lián)合專家委員會第十八次會議決定限制糖精鈉中全部甲苯磺酰胺異構(gòu)體少于100 PPM[6]。2015版《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）[7]對糖精鈉中鄰、對甲苯磺酰胺含量進行了控制，采用的是氣相色譜法（gas chromatography，GC），但在實際檢驗過程中存在色譜條件分離度不佳的情況。另有研究人員采用紫外分光光度法和高效液相色譜法測定鄰、對甲苯磺酰胺含量[8]。但是經(jīng)分析紫外分光法，準確度不高;高效液相色譜法分析時間較長。目前國內(nèi)利用GC同時測定鄰、對甲苯磺酰胺含量報道較少。本研究在《中國藥典》[7]方法的基礎上對色譜條件進行了改進和優(yōu)化，以期得到一種更可行的色譜方法。

1儀器、試劑與試藥

1.1儀器與試劑

GC儀（島津，GC-2010）;色譜柱：DB-17MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）;FID檢測器;硅藻土（分析純，天津歐博凱化工有限公司）、鹽酸（分析純，天津歐博凱化工有限公司）、二氯甲烷（優(yōu)級純，天津歐博凱化工有限公司）;玻璃色譜管（250 mm×25 mm）。

1.2試藥

鄰甲苯磺酰胺對照品（中國食品藥品檢定研究院，100038-201204）;對甲苯磺酰胺（中國食品藥品檢定研究院，100131-201603）;糖精鈉（湖北華納大藥廠股份有限公司，批號：171101、171102、171108、171114、171105、171109、171111）。

2方法與結(jié)果

2.1氣相色譜系統(tǒng)適應性條件

GC儀;色譜柱：DB-17MS;采用程序升溫：初始溫度180℃保持20 min，以10℃/min升至260℃，保持32 min;進樣量：1 μl;柱流速：1.5 ml/min;分流比：5∶1;進樣口溫度：200℃;檢測器溫度：280℃。

2.2溶液制備

2.2.1混合對照品溶液的制備? 分別取鄰甲苯磺酰胺與對甲苯磺酰胺對照品，精密稱定（鄰甲苯磺酰胺稱樣量：0.012 53 g;對甲苯磺酰胺稱樣量：0.012 56 g），加二氯甲烷溶解并稀釋制成每1毫升含上述的甲苯磺酰胺異構(gòu)體各50 μg的溶液作為對照品混合溶液。

2.2.2供試品溶液的制備? 供試品溶液的制備：取本品2.0 g（稱樣量1：2.002 g;稱樣量2：2.004 g），精密稱定，用5%碳酸鈉溶液8.0 ml溶解后，加色譜用硅藻土[稱取硅藻土（過九號篩）100 g，加鹽酸800 ml，時時攪拌，浸漬12 h以上，除去酸液，再用鹽酸同樣處理3次，每次1 h，然后用水洗滌至溶液顯中性，將硅藻土分散于甲醇300 ml中，濾過，在80℃烘干]10 g，混合均勻，裝入25 mm×250 mm的色譜管，照柱色譜（通則0511第二法），用二氯甲烷洗脫約30 min，收集洗脫液50 ml，蒸發(fā)至近干，加二氯甲烷，使成1.0 ml作為供試品溶液。

2.3標準曲線制備

取鄰甲苯磺酰胺對照品與對甲苯磺酰胺對照品，精密稱定分別置10 ml容量瓶中，加二氯甲烷溶解并稀釋至刻度，分別制成每1毫升含上述的甲苯磺酰胺異構(gòu)體各1 mg的對照品儲備液。經(jīng)稱量后最終鄰甲苯磺酰胺儲備液1.118 mg/ml，對甲苯磺酰胺儲備液1.015 mg/ml。

分別精密吸取兩種儲備液0.1、0.2、0.5、1、2 ml置5個10 ml容量瓶中，用二氯甲烷稀釋至刻度，搖勻，即得系列濃度的鄰甲苯磺酰胺與系列濃度的對甲苯磺酰胺混合對照品溶液。進GC樣，記錄峰面積。結(jié)果顯示，鄰甲苯磺酰胺線性回歸方程為y=2353.7x-3043.4，鄰甲苯磺酰胺濃度在11.80～223.60 μg/ml內(nèi)線性關系良好（r=1）;對甲苯磺酰胺線性回歸方程為y=2213.7x-116.81，對甲苯磺酰胺濃度在10.15～203.00 μg/ml內(nèi)線性關系良好（r=1）（表1，圖1～2）。

2.4檢出限

參考文獻[9-13]了解檢出限的具體細節(jié)后，取鄰甲苯磺酰胺對照品與對甲苯磺酰胺對照品約10 mg，精密稱定分別置25 ml容量瓶中，加二氯甲烷溶解并定容至刻度，制得兩種對照品儲備液。經(jīng)稱量定容后得：鄰甲苯磺酰胺儲備液濃度為427.6 μg/ml，對甲苯磺酰胺儲備液濃度為431.2 μg/ml。

分別精密吸取兩種同分異構(gòu)體對照品儲備液各0.2 ml，置兩個不同5 ml容量瓶中，加二氯甲烷稀釋至刻度，即得鄰甲苯磺酰胺母液（17.104 μg/ml）、對甲苯磺酰胺母液（17.248 μg/ml）。再分別精密吸取兩種母液各0.2 ml置同一10 ml容量瓶中，加二氯甲烷稀釋至刻度，即得甲苯磺酰胺異構(gòu)體檢出限濃度。鄰甲苯磺酰胺檢出限濃度為0.342 08 μg/ml，對甲苯磺酰胺檢出限濃度為0.344 96 μg/ml。鄰甲苯磺酰胺信噪比為3.33，對甲苯磺酰胺信噪比為2.04，全部符合2015版《中國藥典》[7]要求。

2.5儀器精密度

取鄰甲苯磺酰胺與對甲苯磺酰胺對照品，精密稱定，加二氯甲烷溶解并稀釋制成每1毫升含上述的甲苯磺酰胺異構(gòu)體各50 μg的溶液作為對照品溶液，具體如下。

分別精密吸取鄰甲苯磺酰胺儲備液（427.6 μg/ml）、對甲苯磺酰胺儲備液（431.2 μg/ml）1.2 ml，置同一10 ml容量瓶中，加二氯甲烷稀釋至刻度即得。進GC樣，記錄峰面積。鄰甲苯磺酰胺：51.312 μg/ml，對甲苯磺酰胺：51.744 μg/ml。精密度結(jié)果具體見表2。

2.6定量限

參考文獻[14-17]了解定量限的細節(jié)后，取鄰甲苯磺酰胺對照品與對甲苯磺酰胺對照品約10 mg，精密稱定分別置25 ml容量瓶中，加二氯甲烷溶解并稀釋至刻度，制得兩種儲備液。鄰甲苯磺酰胺儲備液濃度：427.6 μg/ml，對甲苯磺酰胺儲備液濃度：431.2 μg/ml。

分別精密吸取兩種儲備液各0.2 ml，置兩個不同5 ml容量瓶中，即得鄰甲苯磺酰胺母液（17.104 μg/ml）、對甲苯磺酰胺母液（17.248 μg/ml）。再分別精密吸取鄰甲苯磺酰胺0.6 ml，對甲苯磺酰胺0.9 ml置同一10 ml容量瓶中，加二氯甲烷稀釋至刻度，即得甲苯磺酰胺異構(gòu)體定量限濃度。鄰甲苯磺酰胺定量限濃度：1.026 24 μg/ml，對甲苯磺酰胺定量限濃度：1.552 32 μg/ml。鄰甲苯磺酰胺信噪比為10.86，對甲苯磺酰胺信噪比為10.67，全部符合2015版《中國藥典》[7]要求。

2.7穩(wěn)定性實驗

取本品1.0 g，精密稱定，精密加入混合對照品溶液0.5 ml（約25 μg）用5%碳酸鈉溶液8.0 ml溶解后，加色譜用硅藻土[稱取硅藻土（過九號篩）100 g，加鹽酸800 ml，時時攪拌，浸漬12 h以上，除去酸液，再用鹽酸同樣處理3次，每次1 h，然后用水洗滌至溶液顯中性，將硅藻土分散于甲醇300 ml中，濾過，在80℃烘干]10 g，混合均勻，裝入25 mm×250 mm的色譜管，照柱色譜（通則0511第二法），用二氯甲烷洗脫約30 min，收集洗脫液50 ml，蒸發(fā)至近干，加二氯甲烷，使成1.0 ml作為供試品溶液。分別于0、1、2、4、6、8、12 h進GC樣，記錄峰面積，計算RSD，考察穩(wěn)定性，具體結(jié)果見表3。

2.8重復性實驗

按“2.2.1項”下制備混合對照品溶液，同時精密稱定2.0 g糖精鈉，按“2.2.2項”下制備6份供試品溶液，進GC樣，記錄峰面積，計算含量，具體結(jié)果見表4。

2.9回收率實驗

2.9.1對照品儲備液制備? 取鄰甲苯磺酰胺對照品與對甲苯磺酰胺對照品，精密稱定分別置10 ml容量瓶中，加二氯甲烷溶解并稀釋至刻度，分別制成每1毫升含上述的甲苯磺酰胺異構(gòu)體各1 mg的對照品儲備液。鄰甲苯磺酰胺貯備液濃度：1.119 mg/ml，對甲苯磺酰胺貯備液濃度：1.097 mg/ml。

2.9.2混合對照品溶液的制備? 分別精密吸取甲苯磺酰胺異構(gòu)體貯備液各0.5 ml，置同一10 ml容量瓶中，加二氯甲烷稀釋至刻度，即得。鄰甲苯磺酰胺濃度：55.95 μg/ml，對甲苯磺酰胺濃度：54.85 μg/ml。

2.9.3加樣回收樣品制備? 取本品1.0 g，精密稱定，精密加入混合對照品溶液0.5 ml（約25 μg）用5%碳酸鈉溶液8.0 ml溶解后，加色譜用硅藻土[稱取硅藻土（過九號篩）100 g，加鹽酸800 ml，時時攪拌，浸漬12 h以上，除去酸液，再用鹽酸同樣處理3次，每次1 h，然后用水洗滌至溶液顯中性，將硅藻土分散于甲醇300 ml中，濾過，在80℃烘干]10 g，混合均勻，裝入25 mm×250 mm的色譜管，照柱色譜（通則0511第二法），用二氯甲烷洗脫約30 min，收集洗脫液50 ml，蒸發(fā)至近干，加二氯甲烷，使成1.0 ml作為供試品溶液。結(jié)果顯示，隨行含測未檢出，加樣回收實驗結(jié)果具體見表5。

2.10樣品含量測定

取6批樣品，按“2.2.2項”下方法制備樣品，同時按“2.2.1項”下方法制備混合對照品溶液，進GC樣，即得，具體結(jié)果見表6。

《中國藥典》[7]規(guī)定糖精鈉中總的甲苯磺酰胺 <0.0025%，6批樣品未檢出符合藥典規(guī)定，同時也與生產(chǎn)廠家的報告單一致。

3討論

本研究中，樣品檢測時未檢出鄰、對甲苯磺酰胺，這與檢驗報告單數(shù)據(jù)一致。分析原因可能為糖精鈉在生產(chǎn)過程中產(chǎn)生鄰、對甲苯磺酰胺中間品，而在后期的氧化過程中，兩種中間品大部分被分離，僅剩余非常少的一部分，而剩余的少部分低于檢出限，很可能埋于噪音中，所以本研究不能絕對地斷定樣品中一點也不含鄰、對甲苯磺酰胺。本次方法學考察由于預實驗時樣品中未檢出甲苯磺酰胺，故在考察樣品的穩(wěn)定性時利用加混合對照方法。在方法學考察過程中，兩種同分異構(gòu)體檢出限濃度和定量限濃度確定過程中要首先做預實驗，在預實驗得出濃度的基礎上再逐級稀釋直至符合限度要求。2015版《中國藥典》[7]要求鄰、對甲苯磺酰胺之和不得超過0.0025%，根據(jù)藥典規(guī)定本數(shù)量級RSD要求不高于6.0%[7]，故本研究實驗方法學的回收率實驗RSD數(shù)據(jù)合理。該方法的分離度良好，鄰、對甲苯磺酰胺定量檢測的線性范圍廣，靈敏度高，并且具有良好的精密度，可以用于鄰、對甲苯磺酰胺的檢測。本次實驗過程中所用到的中性硅藻土提取過程復雜，鹽酸使用量大，在制備過程中鹽酸需注意安全并及時回收避免污染環(huán)境。

生產(chǎn)中要求快速準確測定出對甲苯磺酰胺和鄰甲苯磺酰胺含量，測定方法包括凝固點法與紫外光譜法[18-21]，但兩種方法要求操作條件比較苛刻，不易操作成功，而相關文獻[4，6]雖然采用的也是氣相色譜分析方法，但是兩種方法在方法學考察過程過于簡單，且并未做評價方法準確度的加樣回收實驗，本研究建立的GC色譜條件分離度較好，方法操作簡便，準確，可作為糖精鈉的質(zhì)量評價標準參考，具有一定的推廣價值。

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（收稿日期：2019-09-16? 本文編輯：任秀蘭）

[作者簡介]張東閣（1988-），男，內(nèi)蒙古赤峰人，承德醫(yī)學院2019級在讀碩士研究生，主要從事中藥新藥研究與開發(fā)

通訊作者：楊宇杰，女，教授，碩士研究生導師，主要從事中藥新藥研究與開發(fā)