熒光PCR-探針熔解曲線法在缺失型α-地中海貧血快速診斷中的應(yīng)用

李戀湘 肖奇志 張素粉 吳洪秋

[摘要]目的 探討熒光PCR-探針熔解曲線法（PMCA）在缺失型α-地中海貧血（簡(jiǎn)稱“α-地貧”）快速診斷中的應(yīng)用。方法 收集2019年10～12月珠海市婦幼保健院2261份血樣本和35份羊水樣本。通過雙盲法，采用PMCA和單管多重PCR技術(shù)（gap-PCR）同時(shí)對(duì)上述2296份臨床樣本進(jìn)行3種常見缺失型α-地貧基因檢測(cè)，結(jié)果不符樣本用DNA測(cè)序技術(shù)以確認(rèn)。結(jié)果 2296份臨床樣本中，除PMCA檢測(cè)出1例未知突變基因之外，其余與gap-PCR檢測(cè)結(jié)果一致，兩者符合率為99.9%，此例經(jīng)DNA測(cè)序顯示在探針覆蓋區(qū)域發(fā)生了單個(gè)堿基突變（A>G）。結(jié)論 PMCA技術(shù)能快速準(zhǔn)確檢測(cè)3種常見缺失型α-地貧基因，可作為gap-PCR技術(shù)的替代或驗(yàn)證方法，也可用于大規(guī)模人群篩查及產(chǎn)前診斷。

[關(guān)鍵詞]探針;熔解曲線;α-地中海貧血;多重聚合酶鏈反應(yīng)

[中圖分類號(hào)] R714.55? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1674-4721（2020）5（c）-0024-04

Application of fluorescence PCR-probe melting curve analysis in the rapid diagnosis of deletion α-thalassemia

LI Lian-xiang? ?XIAO Qi-zhi? ?ZHANG Su-fen? ?WU Hong-qiu

Department of Clinical Laboratory， Zhuhai Municipal Maternity and Child Healthcare Hospital， Guangdong Province， Zhuhai? ?519001， China

[Abstract] Objective To explore the application of fluorescence PCR-probe melting curve analysis （PMCA） in the rapid diagnosis of deletion α-thalassemia. Methods A total of 2261 blood samples and 35 amniotic fluid samples were collected in Zhuhai Municipal Maternity and Child Healthcare Hospital from October to December 2019. Through double-blind method， PMCA and single-tube multiplex PCR （gap-PCR） were used to detect three common deletion α-thalassemia genes in these 2296 clinical samples. The samples inconsistent with results were confirmed by DNA sequencing analysis. Results In these 2296 samples， except for one unknown mutation gene detected by PMCA in one sample， the results of PMCA in others were consistent with those of gap-PCR， with a coincidence rate of 99.9%. DNA sequencing of the only inconsistent sample showed that a single base mutation （A>G） occurred in the probe coverage area. Conclusion PMCA can quickly and accurately detect three common deletion α-thalassemia genes， which can be used as an alternative or verification method of gap-PCR technology， as well as for large-scale population screening and prenatal diagnosis.

[Key words] Probe; Melting curve; α-thalassaemia; Multiplex polymerase chain reaction

α-地中海貧血（a-thalassemia），簡(jiǎn)稱α-地貧，是人類最常見的常染色體隱性遺傳病之一，曾譯為甲型地中海貧血或α-珠蛋白基因生成障礙性貧血，于1955年由Rigas首先報(bào)道，其病因是由于α-珠蛋白基因缺陷，使α-珠蛋白肽鏈的合成受到部分或完全抑制而引起的遺傳性溶血性貧血[1]。廣東省α-地貧發(fā)病率達(dá)8.53%[2]，珠海市發(fā)病率為8.91%[3]。α-地貧分子缺陷主要為α-珠蛋白基因大片段缺失（缺失型，-α），少數(shù)為α-珠蛋白基因點(diǎn)突變（非缺失型，αT），最常見的-α基因有三種，即東南亞缺失（--SEA/）、右側(cè)缺失（-α3.7/）、左側(cè)缺失（-α4.2/）[1]。靜止型或輕型α-地貧（缺失1個(gè)或2個(gè)α-基因）表現(xiàn)為無癥狀攜帶者;中間型α-地貧（缺失3個(gè)α-基因）的臨床表現(xiàn)較為嚴(yán)重，會(huì)有輕、中度貧血，黃疸或肝脾腫大等癥狀[4];重型α-地貧（4個(gè)α-基因全缺）則可致宮內(nèi)胎死或胎兒出生前后死亡，甚至導(dǎo)致嚴(yán)重產(chǎn)科并發(fā)癥[5]。由于目前該病尚無理想的治療方法，通過產(chǎn)前基因診斷選擇性地淘汰中、重型α-地貧胎兒是控制該病發(fā)生的首要途徑[1]。

根據(jù)原廣東省衛(wèi)生廳2006年頒布的《地中海貧血產(chǎn)前診斷技術(shù)規(guī)范》要求產(chǎn)前診斷地貧基因需用兩種方法進(jìn)行驗(yàn)證，確保準(zhǔn)確性。目前來看，國(guó)內(nèi)大多采用單管多重聚合酶鏈反應(yīng)（single-tube multiplex polymerase chain reaction，gap-PCR）檢測(cè)-α基因，此法成熟、準(zhǔn)確率高，在我市也運(yùn)用了10余年[6]。本研究主要探討一種基于實(shí)時(shí)熒光PCR的探針熔解曲線法（probe melting curve analysis，PMCA），通過盲法，用其與gap-PCR同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)-α基因，并以DNA測(cè)序分析為標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)估PMCA檢測(cè)-α基因的準(zhǔn)確性、適用性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

收集2019年10～12月到珠海市婦幼保健院做α-地貧基因檢測(cè)的2296例樣本，其中靜脈血樣本2261例，羊水樣本35例[孕齡（19.5±1.9）周]，測(cè)試前均與受試者簽署了知情同意書，并經(jīng)相關(guān)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2儀器與試劑

全自動(dòng)核酸提取儀（廈門致善Lab-Aid824）;熒光PCR儀（上海宏石SLAN-96S）;擴(kuò)增儀（珠海黑馬Hema9600）;電泳儀（北京六一DYY-8C）;核酸/蛋白凝膠圖像分析管理系統(tǒng)（珠海黑馬GSG-2000）。DNA抽提試劑盒、PMCA試劑盒由廈門致善生物科技有限公司（醫(yī)療器械注冊(cè)證號(hào)：國(guó)械注準(zhǔn)20173403211）提供;gap-PCR試劑盒由深圳亞能生物技術(shù)有限公司（醫(yī)療器械注冊(cè)證號(hào)：國(guó)械注準(zhǔn)20193401915）提供。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本處理? 靜脈血樣本均采用乙二胺四乙酸三鉀（EDTA-K3）抗凝，羊水標(biāo)本無須特殊處理。

1.3.2 DNA抽提和質(zhì)量鑒定? 運(yùn)用全自動(dòng)磁珠抽提法。采用NanodropR超微量紫外分光光度計(jì)于260、280 nm處測(cè)定吸光度（A）值以鑒定DNA純度和濃度。在A260/A280比值滿足1.60～1.80的條件下，將待檢的DNA樣品用超純水稀釋至20 ng/μl。

1.3.3 -α基因檢測(cè)? 采取雙盲方式，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，PMCA檢測(cè)簡(jiǎn)要過程如下。將預(yù)先稀釋好的待測(cè)DNA各加5 μl到含PCR反應(yīng)液的A、B管中，短暫離心后轉(zhuǎn)至熒光PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增和熔解曲線分析。PCR循環(huán)參數(shù)為：預(yù)先50℃ 2 min去除擴(kuò)增產(chǎn)物污染后[尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG酶）]處理，95℃預(yù)變性10 min后，接著進(jìn)行2次PCR循環(huán)。第1次和第2次PCR循環(huán)參數(shù)分別為：95℃ 30 s、70℃ 30 s（每個(gè)循環(huán)下降1℃）和76℃ 45 s（10個(gè)循環(huán)）和95℃ 30 s、35℃ 3 min和76℃ 45 s（50個(gè)循環(huán)）。擴(kuò)增完畢后，即進(jìn)行熔解曲線分析。首先95℃變性1 min、35℃退火3 min，然后以0.4℃/s的速度從40℃升溫至85℃，同時(shí)采集熒光5-羧基熒光素（5-carboxyfluorescein，F(xiàn)AM）、5-羧基-X-羅丹明琥珀酰亞胺酯（5-carboxyl-x-rhodamine succinimide，ROX）通道信號(hào)，從而可得到PCR產(chǎn)物熔解曲線。對(duì)所有標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行g(shù)ap-PCR檢測(cè)。DNA測(cè)序分析由廈門致善生物科技有限公司完成。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。

2結(jié)果

2.1 PMCA檢測(cè)結(jié)果

嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行結(jié)果判讀。A管FAM（A-FAM）通道檢測(cè)內(nèi)控基因，B管FAM（B-FAM）通道檢測(cè)--SEA/，A管ROX（A-ROX）通道檢測(cè)-α3.7/，B管ROX（B-ROX）通道檢測(cè)-α4.2/，有1例在B-FAM通道檢測(cè)出--SEA/，而在B-ROX熔解曲線圖中可見一峰與野生型峰熔點(diǎn)差（ΔTm）為5.7℃，超出判讀范圍（4.6±0.5）℃，為一“未知突變”，該例及有代表性的結(jié)果見圖1（封四）。

2.2 PMCA與gap-PCR檢測(cè)結(jié)果的比較

結(jié)合2296例樣本αT基因結(jié)果，根據(jù)缺失情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，其中攜帶有三種常見-α基因的樣本有701例，非攜帶樣本有1595例。除1例用gap-PCR檢出--SEA/αα而用PMCA檢出--SEA/αα合并一未知突變外，其余檢測(cè)結(jié)果完全一致，兩者符合率為99.9%（表1）。

2.3 DNA測(cè)序復(fù)檢

對(duì)該例樣本進(jìn)行DNA測(cè)序分析，檢測(cè)到--SEA/αα雜合子，同時(shí)對(duì)PMCA的B-ROX探針覆蓋的基因區(qū)段測(cè)序，檢測(cè)到單個(gè)堿基突變，即A>G（表2），該突變應(yīng)為熔解曲線圖所示的“未知突變峰”。

3討論

目前，PMCA已運(yùn)用于非缺失型α-地貧及β-地貧的基因診斷，該法快速簡(jiǎn)便、低成本、準(zhǔn)確率高，適用于地貧的大規(guī)模篩查及產(chǎn)前基因診斷[7-8]，但運(yùn)用于缺失型α-地貧基因診斷的臨床實(shí)驗(yàn)報(bào)道極少見。本研究中PMCA是先運(yùn)用引物擴(kuò)增人α-珠蛋白基因和內(nèi)控基因，再利用熒光標(biāo)記探針與不同的靶序列雜交形成不同的雙鏈雜交體，在溫度由低到高的變化過程中發(fā)生解鏈，同時(shí)伴隨著熒光探針發(fā)出的熒光信號(hào)強(qiáng)度的變化，在某一溫度熒光強(qiáng)度變化達(dá)到最大值即為該雙鏈雜交體的熔點(diǎn)溫度（Tm）。不同的雙鏈雜交體其穩(wěn)定性不同，Tm值亦不同，從而可呈現(xiàn)出不同的熔解峰以區(qū)分不同的靶序列，通過計(jì)算不同熔解峰的Tm值與對(duì)應(yīng)野生峰Tm值之差（ΔTm）來判讀結(jié)果。本研究發(fā)現(xiàn)，PMCA和gap-PCR檢測(cè)方法相比，優(yōu)勢(shì)主要有：其一，全程閉管操作，僅需用一臺(tái)熒光PCR儀4 h內(nèi)就能完成測(cè)試，快速簡(jiǎn)便，而gap-PCR不僅需多臺(tái)檢測(cè)設(shè)備占用大量實(shí)驗(yàn)室空間，而且擴(kuò)增完后還需跑凝膠電泳，操作相對(duì)繁瑣且耗時(shí)長(zhǎng)，增加開蓋污染及人工出錯(cuò)的風(fēng)險(xiǎn);其二，結(jié)果判讀直觀且客觀，gap-PCR則需借助凝膠成像儀人工判讀結(jié)果，存在一定的主觀性;其三，試劑成本低，單個(gè)樣本成本十幾元，gap-PCR則在六十元左右;此外，PMCA檢測(cè)體系中還包含了內(nèi)控，有效監(jiān)測(cè)了擴(kuò)增效果，還可提示是否漏加樣本。值得一提的是，gap-PCR采用單管擴(kuò)增操作，由于a-珠蛋白基因簇中α1和α2-基因有高同源性及高G+C特點(diǎn)，當(dāng)擴(kuò)增-α3.7/基因片段時(shí)重復(fù)性欠佳[6]，而PMCA檢測(cè)-α3.7/有其特定檢測(cè)通道，所受影響較少。而且，本研究通過盲法測(cè)試，兩種方法檢測(cè)結(jié)果基本符合，并且PMCA能在其檢測(cè)覆蓋區(qū)域內(nèi)準(zhǔn)確檢出未知突變，說明PMCA準(zhǔn)確率高，與之前報(bào)道[7-8]一致，故可作為gap-PCR的替代或驗(yàn)證方法。此外，近年來有報(bào)道[9-10]運(yùn)用多重連接依賴性探針擴(kuò)增技術(shù)、高通量測(cè)序技術(shù)診斷α-地貧基因，方法先進(jìn)且結(jié)果精確度高，可以發(fā)現(xiàn)罕見類型地貧，甄別母血污染源產(chǎn)前診斷樣本，但同時(shí)也存在成本高、技術(shù)要求高、儀器設(shè)備配置高等問題，相比之下，PMCA更適合普遍推廣用于臨床和基層實(shí)驗(yàn)室。

本研究發(fā)現(xiàn)PMCA也存在一些不足：當(dāng)DNA濃度不合適或純度不高時(shí)，容易造成曲線不平滑難以判讀;當(dāng)在探針覆蓋區(qū)域的基因片段發(fā)生了未知基因突變時(shí)，可能出現(xiàn)異常峰，從而給判讀造成一定困擾;其次目前還僅限于檢測(cè)三種常見-α基因。本研究還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)判讀-α3.7/--SEA或-α4.2/--SEA基因型時(shí)，由于--SEA/缺失了一對(duì)染色體中的一條染色體上全部的α1-和α2-基因，而-α3.7/或-α4.2/缺失發(fā)生在另一條染色體上部分的α1和α2-基因上，即-α3.7/缺失了α1-基因的5′端和α2-基因的3′端，-α4.2/缺失了α2-基因[1]，--SEA/基因片段超出了PMCA檢測(cè)體系中A-ROX或B-ROX探針檢測(cè)區(qū)域，因此，顯示B-FAM曲線圖上有--SEA/缺失型峰和野生型峰，而在A-ROX或B-ROX曲線圖上僅有-α3.7/或-α4.2/缺失型峰，無野生型峰，這需要特別注意，不要遺漏而錯(cuò)判為-α3.7/或-α4.2/純合子，最好結(jié)合αT基因型、β-地貧基因型及血液學(xué)表型綜合分析，以提高準(zhǔn)確性。另外，本研究中PMCA檢測(cè)到1例--SEA/αα合并未知突變基因，經(jīng)DNA測(cè)序確認(rèn)的單堿基突變，可能由于SNP多態(tài)性所致，同時(shí)結(jié)合該例臨床表現(xiàn)來看，有明顯的小細(xì)胞低色素性貧血，未見異常血紅蛋白帶，綜合分析其確與--SEA/αα基因型相當(dāng)，也與gap-PCR檢測(cè)結(jié)果一致。

近年來，地貧因其具有致死性、致殘性、可導(dǎo)致出生死亡或缺陷而引起國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注[11]，全球每年約有70 000例地貧患兒出生[12]，國(guó)內(nèi)外治療地貧的方法有限，長(zhǎng)期輸血治療，造成嚴(yán)重的家庭、社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，甚至嚴(yán)重的精神負(fù)擔(dān)[13-14]。作為高發(fā)地區(qū)的珠海市，2013年已將地中海貧血基因檢測(cè)列為孕前產(chǎn)前免費(fèi)項(xiàng)目，結(jié)婚夫婦雙方先進(jìn)行孕前及產(chǎn)前的篩查，必要時(shí)做產(chǎn)前基因診斷，從而降低中、重型地貧患兒的出生率。目前本實(shí)驗(yàn)室已建立應(yīng)用RDB聯(lián)合PMCA對(duì)非缺失型α-地貧及β-地貧進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷的雙重體系，大大提高了準(zhǔn)確率同時(shí)還防止漏診及誤診[15]，本研究中經(jīng)PMCA檢測(cè)35例羊水樣本與gap-PCR結(jié)果完全吻合，且結(jié)果準(zhǔn)確，其還可對(duì)可能存在少量母體污染源的羊水樣本具有更明顯的提示作用[15]，所以PMCA可作為另一種驗(yàn)證方法進(jìn)行缺失型α-地貧的產(chǎn)前基因診斷，也可以嘗試展開應(yīng)用gap-PCR聯(lián)合PMCA對(duì)缺失型α-地貧的產(chǎn)前基因診斷。

對(duì)于下一代測(cè)序技術(shù)高速發(fā)展的今天，對(duì)α珠蛋白基因直接進(jìn)行序列分析的檢測(cè)方法也是可行的，但綜合成本效益及本實(shí)驗(yàn)室規(guī)?？紤]，目前更傾向于選擇一種快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、高效的方法，因?yàn)榻?jīng)過血液學(xué)表型篩選后的每個(gè)孕前產(chǎn)前育齡人群都需做α-地貧基因檢測(cè)[16]，而PMCA具備對(duì)大樣本量篩查的優(yōu)勢(shì)，可先用PMCA對(duì)α-地貧基因進(jìn)行快速篩查，如發(fā)現(xiàn)基因型與表型不符，再用gap-PCR及RDB復(fù)檢或有必要時(shí)做DNA測(cè)序，從而盡早得出準(zhǔn)確結(jié)果，臨床也能及時(shí)進(jìn)行孕前產(chǎn)前指導(dǎo)。

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（收稿日期：2020-02-25? 本文編輯：任秀蘭）

[作者簡(jiǎn)介]李戀湘（1982-），女，廣東珠海人，本科，主管技師，主要從事分子遺傳研究