丙戊酸對食管癌細(xì)胞增殖凋亡的影響及其抗腫瘤活性機(jī)制的研究

楊鯨蓉 柳亞明 張錦燦 曾志勇

[摘要]目的 探索丙戊酸（VPA）對食管癌細(xì)胞增殖凋亡的影響以及Bcl-2蛋白、Caspase蛋白表達(dá)及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的分子機(jī)制。方法 將食管癌ECa-109細(xì)胞株培養(yǎng)于PRMI1640培養(yǎng)液，按照溶劑對照和溶度梯度分組：空白對照及VPA 0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、2.0 mmol/L、4.0 mmol/L。根據(jù)不同的藥物濃度處理細(xì)胞24、48、72 h后，觀察食管癌ECa-109細(xì)胞的變化，運(yùn)用不同的檢測方法檢測食管癌ECa-109細(xì)胞的細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡及周期的變化;Western Blot檢測CyclinD1、p21、Survivin、Bcl-2和Caspase蛋白及PI3K/Akt和MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的變化。結(jié)果 VPA可有效影響ECa-109細(xì)胞的活力、增殖和分化，能夠通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯使細(xì)胞產(chǎn)生凋亡。Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，VPA可以影響ECa-109細(xì)胞中Bcl-2、Survivin以及Caspase蛋白的表達(dá);VPA可明顯降低ECa-109細(xì)胞中CyclinD1蛋白表達(dá)水平，同時增加p21蛋白的表達(dá)，使其能夠影響信號通路PI3K/Akt和MAPK途徑中AKT、MAPK等關(guān)鍵蛋白的磷酸化。結(jié)論 VPA能夠影響食管癌細(xì)胞的增殖凋亡，并具有濃度依賴性;能夠通過影響多種蛋白激酶途徑中的信號通路、生存蛋白的表達(dá)以及PI3K/Akt和MAPK信號通路的表達(dá)而影響食管癌細(xì)胞的生長。

[關(guān)鍵詞]組蛋白去乙?；?組蛋白去乙?；敢种苿?食管癌;ECa-109細(xì)胞;丙戊酸;Bcl-2;Caspase3;Akt

[中圖分類號] R966? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2020）5（c）-0004-06

Effect of Valproic Acid on proliferation and apoptosis of esophageal cancer cells and study on its antitumor activity mechanism

YANG Jing-rong1? ?LIU Ya-ming1? ?ZHANG Jin-can2? ?ZENG Zhi-yong1

1. Department of Cardiothoracic Surgery， the 900th Hospital of the Joint Support Force （the Former Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Region）， Fujian Province， Fuzhou? ?350025， China; 2. Fuzong Clinical College of Fujian Medical University， Fujian Province， Fuzhou? ?350025， China

[Abstract] Objective To explore the effect of Valproic Acid （VPA） on proliferation and apoptosis of esophageal cancer cells， and expression of Bcl-2， Caspase protein， as well as molecular mechanisms of signal transduction pathways. Methods ECa-109 cell line of esophageal cancer was cultured with PRMI1640 medium， and grouped according to solvent control and solubility gradient： blank control and VPA 0.25 mmol/L， 0.5 mmol/L， 1.0 mmol/L， 2.0 mmol/L， 4.0 mmol/L. After treating cells for 24， 48 and 72 hours according to different drug concentrations， the changes of esophageal cancer ECa-109 cells were observed， and different detection methods were used to detect the changes of cell viability， apoptosis and cycle of esophageal cancer ECa-109 cells. Western Blot was used to detect CyclinD1， p21， Survivin， Bcl-2， Caspase protein and PI3K/Akt and MAPK signal transduction pathway changes. Results VPA showed different extent changes on vitality， proliferation， differentiation of ECa-109 cells， could induce cell apoptosis by inducing cell cycle arrest. Western Blot experiment results showed that VPA could affect the expression of Bcl-2， Survivin and Caspase proteins in ECa-109 cells. VPA could significantly reduce the expression level of CyclinD1 protein in ECa-109 cells and increase the expression of p21 protein， which influenced the phosphorylation of key proteins such as AKT and MAPK in the signaling pathway PI3K/Akt and MAPK pathway. Conclusion VPA has an effect on the proliferation and apoptosis of esophageal cancer cells and it is concentration-dependent， which can affect the growth of esophageal cancer cells through the signaling pathways of multiple protein kinase pathways， the expression of survival proteins， the expression of PI3K/Akt and MAPK signaling pathways.

1.2.5 Western Blot檢測? VPA可促進(jìn)食管癌細(xì)胞凋亡來抑制食管癌細(xì)胞的生長。為了進(jìn)一步探究VPA誘導(dǎo)的食管癌細(xì)胞凋亡的潛在的分子機(jī)制，選用Western Blot檢測CyclinD1、p21、Survivin、Bcl-2家族和Caspase蛋白、C-PARP及PI3K/Akt和MAPK信號因子;在濃度為0.5 mmol/L VPA處理0、24、48 h后，經(jīng)過RIPA裂解、蛋白的提取、蛋白溶度的測定、蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后進(jìn)行抗體孵育及顯影。加入配置好的一抗室溫下孵育2 h，TBST洗滌干凈后，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫下孵育1 h，然后將多余的抗體棄去，加入顯影液使其覆蓋膜表面，最后進(jìn)行顯影。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)時定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次做3個重復(fù)孔，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 MTT檢測不同VPA濃度處理對細(xì)胞生長的抑制作用

VPA能夠抑制ECa-109細(xì)胞活力，且抑制作用具有濃度依賴性，隨著濃度的增高，抑制效果明顯增強(qiáng)，而且其IC50值為0.5 mmol/L，此濃度將作為后續(xù)試驗(yàn)VPA的濃度;進(jìn)一步分析得出，相同時間及濃度下，藥物作用時間越長，抑制率越高，生存能力越低。不同濃度VPA兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。VPA對細(xì)胞的增殖抑制作用隨其濃度的增加而增強(qiáng)，用濃度為0.5 mmol/L的VPA分別作用于細(xì)胞24、48、72 h后，發(fā)現(xiàn)其對細(xì)胞生長均有明顯的抑制作用，抑制率分別為（31.20±0.21）、（54.30±0.23）、（57.40±0.33）%，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。不同時間下VPA對細(xì)胞的抑制率有顯著影響（P<0.05）（圖1）。

2.2流式細(xì)胞檢測細(xì)胞凋亡及周期的變化

經(jīng)VPA處理后的食管癌細(xì)胞，處于G2/M期的細(xì)胞隨著濃度的增加而逐漸增多;VPA對食管癌細(xì)胞誘發(fā)凋亡有作用，0.5 mmol/L VPA在0、24和48 h時，細(xì)胞凋亡比例依次為2.6%、11.9%、17.4%，食管癌凋亡細(xì)胞的數(shù)目隨著藥物作用時間的延長，細(xì)胞凋亡的數(shù)目逐漸增多（圖2）。

2.3 VPA對CyclinD1蛋白和p21調(diào)控蛋白表達(dá)的影響

經(jīng)0.5 mmol/L VPA處理后的食管癌細(xì)胞，CyclinD1蛋白表達(dá)水平降低，而p21表達(dá)水平增高，而且隨著藥物作用時間的延長，具有一定的時效關(guān)系（圖3～4）。

2.4 VPA對Caspase家族蛋白表達(dá)的影響

經(jīng)過0.5 mmol/L VPA處理后的食管癌細(xì)胞對Caspase家族蛋白的影響主要是通過調(diào)節(jié)相應(yīng)的活化蛋白C-Caspase-3、C-Caspase-8、C-PARP的表達(dá)水平，且隨著藥物作用時間的延長，增加了相應(yīng)的活化蛋白C-Caspase-3、C-Caspase-8、C-PARP的表達(dá)水平（圖5～7）。

2.5 VPA對Bcl-2家族蛋白和Survivin蛋白表達(dá)的影響

經(jīng)過0.5 mmol/L VPA處理后的食管癌細(xì)胞，降低了Bcl-2家族蛋白和Survivin蛋白的表達(dá)，且隨著作用時間的延長，Survivin蛋白的表達(dá)以及抗凋亡蛋白Mcl-l、Bcl-XL的表達(dá)逐漸降低（圖8～10）。

2.6 VPA對PI3K/AKT和MAPK信號通路的影響

經(jīng)0.5 mmol/L VPA處理食管癌細(xì)胞后，Akt和MAPK信號因子表達(dá)水平降低，且隨著作用時間的延長，Akt、MAPK的表達(dá)逐漸下降（圖11～12）。

3討論

隨著臨床醫(yī)學(xué)研究工作的逐漸深入，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中，除了基因突變外，表觀遺傳調(diào)控也扮演者重要的角色[5-6]。在眾多的表觀遺傳調(diào)控中都存在著相對應(yīng)的一系列酶對其進(jìn)行修飾，而在這些表觀遺傳調(diào)控修飾酶中，HDACS作為其中的一類存在意義重大，其參與了許多生物化學(xué)信號傳導(dǎo)通路的去乙酰化修飾，其作用與有效干擾腫瘤發(fā)生、發(fā)展的信號傳導(dǎo)激活密切相關(guān)，這為在臨床展開研究工作和治療腫瘤提供了新的切入點(diǎn)。目前，所有HDACi按照化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為4大類：以MGCD0103、MS-275等為代表的苯酰胺類;以TSA、PXD-101、SAHA等為代表的異羥肟酸類;以丁酸鈉、丙戊酸等為代表的羧酸類;以Trapoxin、Aci- dipin、FK-228等為代表的環(huán)肽類。由于HDACi的抗腫瘤分子機(jī)制相對的復(fù)雜，再加上不同腫瘤類型中其抗腫瘤機(jī)制有著非常大的差別，對于各個HDACi在體內(nèi)的抗腫瘤機(jī)制依然存在欠缺[7-10]。目前已有多種HDACi被批準(zhǔn)上市，主要用于血液/淋巴系統(tǒng)的治療，包括伏立諾他、羅米地辛、貝林司他、西達(dá)本胺等[4，11]。但是，由于藥代動力學(xué)性質(zhì)以及腫瘤特異性等原因，大多數(shù)HDACi在實(shí)體瘤治療中的效果并不令人滿意。

根據(jù)目前相關(guān)研究顯示，VPA具有明顯的HDACi活性，可以特異性地作用在HDACⅠ與HDACⅡ中，故具有抗腫瘤作用的效果[12]。本次研究所使用的VPA歸于短鏈脂肪酸（SCFA）的范疇內(nèi)。其優(yōu)勢在于患者耐受性較好且不會產(chǎn)生明顯的副作用。本研究結(jié)果顯示，VPA可影響ECa-109細(xì)胞的增殖凋亡以及抑制細(xì)胞的生長，而且具有濃度依賴性，尤其在濃度為0.05 mmol/L時即可明顯抑制食管癌細(xì)胞的活力和增殖。能夠通過抑制CyclinD1啟動子組蛋白H4的乙?；?，誘導(dǎo)細(xì)胞G2/M期阻滯和細(xì)胞凋亡，顯示出較強(qiáng)的抗食管癌活性。相關(guān)研究表明，在大多數(shù)的腫瘤模型當(dāng)中，HDACi已經(jīng)被證實(shí)可以通過影響細(xì)胞內(nèi)、外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而發(fā)揮作用[13]。死亡受體（DR）轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在大多數(shù)的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中有與其相對應(yīng)的配體，當(dāng)死亡受體和其相對應(yīng)的配體結(jié)合后就能夠啟動凋亡途徑，誘導(dǎo)相對應(yīng)的細(xì)胞凋亡。相關(guān)的研究已經(jīng)證實(shí)，在乳腺癌中，MS275和SAHA能夠誘導(dǎo)TRAIL的表達(dá)而不改變DR4和DR5水平，通過募集FADD和激活Caspase8促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的調(diào)亡[14]。另有研究表明，線粒體凋亡途徑也被證實(shí)能夠通過細(xì)胞內(nèi)外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而發(fā)揮作用，其受到外界應(yīng)激因素的干擾破壞線粒體內(nèi)蛋白質(zhì)的釋放，導(dǎo)致Caspase8、Caspase9的釋放和活化，緊接著被活化的Caspase3、Caspase6、Caspase8和已被激活的Caspase8和Caspase9共同作用誘導(dǎo)細(xì)胞的調(diào)亡[14]。在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的過程中，細(xì)胞內(nèi)的促調(diào)亡蛋白和抗調(diào)亡蛋白也發(fā)揮著非常重要的作用[15]。本研究結(jié)果顯示，VPA能夠通過對Caspase通路的干擾及減少Survivin蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2家族中的抗凋亡蛋白Bcl-XL、Mcl-1等機(jī)制促進(jìn)細(xì)胞的凋亡來影響食管癌細(xì)胞。相關(guān)研究表明，細(xì)胞周期抑制劑p21可以被HDACi特異性地抑制[16-17];而且，抑制HDACS可以阻斷多種腫瘤生長相關(guān)信號通路，如PI3K/Akt、MAPK/Erk等[18-19]。因此，本研究通過Western Blot檢測了VPA對p21表達(dá)和PI3K/Akt、MAPK/Erk這兩條細(xì)胞生長依賴的生存信號通路的影響，結(jié)果顯示，VPA可明顯上調(diào)細(xì)胞周期抑制劑p21的表達(dá)水平以及抑制這兩條信號通路中的關(guān)鍵蛋白Akt、MAPK的磷酸化，提示VPA抗食管癌活性不僅僅涉及簡單的分子機(jī)制，還可以通過上調(diào)p21、抑制PI3K/Akt和MAPK信號通路在其中發(fā)揮重要作用。經(jīng)0.5 mmol/L VPA處理食管癌細(xì)胞后，Akt和MAPK信號因子表達(dá)水平降低，且隨著作用時間的延長，Akt、MAPK的表達(dá)逐漸降低。出現(xiàn)這一結(jié)果的原因?yàn)閂PA作用癌細(xì)胞后，抑制了AKt及MAPK的激活，使其表達(dá)降低，間接影響其下游靶基因的激活，從而調(diào)節(jié)下游凋亡相關(guān)蛋白Caspase表達(dá)。

綜上所述，本研究報道的一種高活性的HDACi——VPA的抗食管癌作用及其分子機(jī)制，VPA可以影響食管癌細(xì)胞的增殖凋亡，且具有濃度依賴性;可以通過降低CyclinD1啟動子組蛋白H4的乙酰化水平，抑制G2期CyclinD1的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)使食管癌細(xì)胞周期停滯在G2/M期;可以通過影響蛋白酶途徑和減少Survivin蛋白的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并下調(diào)Bcl-2家族中的抗凋亡蛋白Bcl-XL和Mcl-1，從而激活多重信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;可以通過降低CyclinD1蛋白的表達(dá)和上調(diào)細(xì)胞周期抑制劑p21表達(dá)水平，并有效抑制Akt和MAPK的磷酸化，影響PI3K/Akt和MAPK信號通路的表達(dá)而影響食管癌細(xì)胞的生長，為進(jìn)一步臨床用藥提供了理論依據(jù);然而，目前有關(guān)VPA在食管癌患者體內(nèi)單獨(dú)用藥效果如何以及用藥后不良反應(yīng)的相關(guān)報道罕見，需要進(jìn)一步的動物實(shí)驗(yàn)及臨床研究，隨著該領(lǐng)域研究工作的不斷深入，HDACi VPA在食管癌方面的應(yīng)用價值必然會不斷的增強(qiáng)。

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（收稿日期：2020-02-14? 本文編輯：任秀蘭）

[基金項(xiàng)目]福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2017J01223）

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