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    豬鏈球菌2型分離株的生物學(xué)特性試驗

    2011-05-18 08:41:56劉麗蓉
    中國動物檢疫 2011年5期
    關(guān)鍵詞:豬鏈球菌紙片鏈球菌

    劉麗蓉 ,常 凱 ,吳 娟 ,單 虎

    (1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,山東 青島 266109;2.泉州出入境檢驗檢疫局,福建 泉州 362000)

    豬鏈球菌2型感染可引起豬腦膜腦炎、心內(nèi)膜炎、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎等疾病,可感染人并致死,是一種重要的人獸共患病病原菌[1-2],在全國范圍內(nèi)都是優(yōu)勢流行株。2005年6-7月發(fā)生在四川省資陽、內(nèi)江等地區(qū)的2型豬鏈球菌感染事件造成了極大的經(jīng)濟損失,引起社會廣泛關(guān)注[3]。此外,1型和9型是除2型外的流行株[4-5],也可使豬發(fā)病。近幾年來,豬鏈球菌病的發(fā)病呈上升趨勢,該病往往發(fā)病急,死亡快,給養(yǎng)殖業(yè)帶來了重大的經(jīng)濟損失。同時也給公共衛(wèi)生安全帶來的重大的隱患。雖然理論上有很多藥物能治療豬鏈球菌病,但隨著抗菌藥物的廣泛使用以及臨床中不合理用藥,使得病原菌的耐藥現(xiàn)象日趨嚴重[6-8]。本試驗對從發(fā)病豬肺、肝、脾和淋巴結(jié)中分離到的鏈球菌株進行生化試驗、藥敏試驗及致病性試驗等研究,確定為豬鏈球菌2型,為預(yù)防和控制該病的流行提供了重要依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 豬鏈球菌2型參考菌株(HA9801)由中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心提供;病原菌株由濟南某屠宰場和急性死亡病例豬豬場提供。

    1.1.2 實驗動物 小鼠,購于青島市藥品檢驗所。

    1.1.3 主要試劑 THB液體培養(yǎng)基為北京陸橋有限公司產(chǎn)品;微量生化發(fā)酵管為杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品;藥敏紙片為北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司產(chǎn)品。

    1.1.4 參照倪秀艷等[9],針對CPS 2J基因片段設(shè)計合成引物對:

    P1:5’-CAAACGCAAGGAATTACGGTATC-3’

    P2:5’-GAGTATCTAAAGAATGCCTATTG-3’

    由北京賽百盛生物工程公司合成。

    1.2 方法

    1.2.1 細菌分離

    無菌條件下,采集病豬心血、肺、肝、脾和淋巴結(jié)、扁桃體劃線接種于綿羊血平板,37℃培養(yǎng)18~24 h,挑取α溶血、光滑圓形、針尖狀大小的可疑菌落接種到THB液體培養(yǎng)基中,37℃震蕩培養(yǎng)過夜。

    1.2.2 培養(yǎng)特性鑒定及形態(tài)觀察

    分離菌株分別接種于綿羊血平板及THB液體培養(yǎng)基中,置37℃培養(yǎng)16~18 h,觀察其培養(yǎng)特性。用接種環(huán)取血平板單菌落作革蘭氏染色,在油鏡下進行形態(tài)觀察。

    1.2.3 生化特性

    將分離得到病原菌接種于乳糖、蔗糖、蕈糖、葡萄糖、七葉苷、山梨糖、山梨醇、甘露醇、尿素、水楊苷、棉子糖、阿拉伯糖、甘油、VP、6.5%高鹽肉湯和pH 9.6肉湯中。放置于37℃恒溫箱培養(yǎng)中培養(yǎng)24 h后,觀察并記錄結(jié)果。重復(fù)全部試驗3次,列出重復(fù)性良好的菌株的生化特性。符合鏈球菌生化指標(biāo)的菌株判為鏈球菌。

    1.2.4 PCR鑒定

    1.2.4.1 模板的制備

    按照煮沸法制備,吸取培養(yǎng)好的1 mL菌液于1.5 mL EP管里,10000 r/min離心2 min,棄去上清。加入250μL雙蒸水吹打均勻后煮沸 5 min,10000 r/min離心1 min,移上清液至另一EP管里,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.4.2 PCR擴增

    PCR擴增反應(yīng)在PCR儀上進行,在0.5mLPCR反應(yīng)管中,采用20uL體系,反應(yīng)程序為:95℃3min;94℃30s,56℃30s,72℃1min 35 個循環(huán);72℃10min。

    1.2.4.3 PCR產(chǎn)物測序

    將得到的PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳分離,凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行PCR產(chǎn)物回收,克隆到pMD19-T載體上,送上海生工生物技術(shù)有限公司測序。用DNAstar軟件對測定的核苷酸序列進行分析,并與Genebank的序列進行同源性比較。

    1.2.5 藥敏試驗

    用常規(guī)的藥敏紙片擴散法進行該項試驗。用滅菌后的棉簽醮取病原菌密集涂布與綿羊血瓊脂平板表面。用經(jīng)滅菌的鑷子將藥敏紙片輕輕的放置在培養(yǎng)基的表面,紙片直接的距離為3 cm左右,距離培養(yǎng)皿邊緣的距離為1.5 cm左右,然后放置在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,取出觀察抑菌圈的大小。使用的藥敏紙片有:復(fù)方新諾明、氨芐西林、新霉素、卡那霉素、四環(huán)素、恩諾沙星、青霉素、強力霉素、丁胺卡那、慶大霉素、萬古霉素、阿莫西林、多黏菌素和鏈霉素。

    1.2.6 動物致病性試驗

    用分離的鏈球菌接種THB液體培養(yǎng)基純培養(yǎng)24 h,將菌液濃度調(diào)整為約1.5×109CFU/mL,分別按0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL劑量腹腔接種試驗組昆明小鼠,10只/組,對照組注射1.0 mL的THB液體培養(yǎng)基,所用實驗小鼠均為25 g左右。對注射鏈球菌菌液的小白鼠進行隔離飼養(yǎng),隨時觀察并記錄其發(fā)病及死亡情況。對發(fā)病死亡的小鼠應(yīng)及時剖檢,無菌采集其肝臟、肺臟及脾臟,涂片,鏡檢。

    2 結(jié)果

    2.1 細菌的分離

    從發(fā)病豬場50份病料中分離到豬鏈球菌2型8株,檢出率分別為16.0%,分別命名JNB01、JNB02、JNB03、JNB04、JNB05、JNB06、JNB07 和 JNB08。從屠宰場198份生豬扁桃體樣品中分離到豬鏈球菌2型6株,檢出率為3.0%,分別命名JNT01、JNT02、JNT03、JNT04、JNT05 和 JNT06。

    2.2 細菌形態(tài)及培養(yǎng)特性

    分離菌在綿羊血平板上能長出灰白色、圓形、透明濕潤、中央隆起、表面光滑、邊緣整齊、針尖大小的露滴樣小菌落。挑取單個菌落涂片,革蘭染色鏡檢為近乎小桿狀的單個、成對或長短不一的鏈狀排列的革蘭陽性球菌。THB液體培養(yǎng)基中有白色絮狀沉淀,上清渾濁,涂片可見鏈狀排列的革蘭陽性球菌,鏈較固體培養(yǎng)基中的長。

    2.3 生化試驗

    該病原菌可發(fā)酵乳糖、蔗糖、蕈糖、葡萄糖和七葉苷,不發(fā)酵山梨糖、山梨醇、甘露醇、尿素、水楊苷、棉子糖、阿拉伯糖、甘油、VP、6.5%高鹽肉湯和pH9.6肉湯(表 1)。

    表1 病原菌的生化特性

    2.4 PCR鑒定

    2.4.1 豬鏈球菌2型PCR擴增結(jié)果

    通過PCR擴增cps2J基因,該菌株能擴增出大小為675 bp的條帶(圖1)。

    2.4.2 PCR產(chǎn)物測序

    將克隆產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)有限公司測序。經(jīng)BLAST分析表明,該菌株與Genebank中豬鏈球菌2型參考菌株的同源性達98%~100%。

    2.5 藥敏試驗

    藥敏紙片本身直徑,抑菌直徑是包括藥敏紙片在內(nèi)測量結(jié)果。藥敏試驗的判定依據(jù)是:抑菌圈的直徑≧15mm為高度敏感,抑菌圈直徑在10mm~15mm為中度敏感,抑菌圈≦10mm為不敏感。從表2可看出,該病原菌對復(fù)方新諾明、氨芐西林、恩諾沙星、青霉素、萬古霉素、阿莫西林高度敏感;對新霉素、卡那霉素、四環(huán)素、強力霉素、丁胺卡那、慶大霉素中度敏感;對多黏菌素有耐藥性。

    表2 病原菌的藥敏試驗

    2.6 動物致病性試驗

    腹腔接種0.2 mL分離菌的10只小白鼠和對照組均未見異常;接種0.5 mL分離菌的10只小白鼠于感染后36 h出現(xiàn)精神沉郁、被毛松亂癥狀,但96 h后癥狀減輕并耐過;而接種1.0 mL分離菌的10只小白鼠于24~48 h全部死亡。剖解均見敗血癥,心臟、脾臟、肝臟等涂片,革蘭氏染色,鏡檢,均可分離到接種的細菌。

    3 討論

    鏈球菌在綿羊血平板上多呈單個、成對或短鏈狀排列,在液體培養(yǎng)基中多呈長鏈狀,鑒定鏈球菌難度不大,但要確定其為何種鏈球菌就比較困難。由于鏈球菌的生化特性差異較大,僅以形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、生化特征等難以將分離的菌株準(zhǔn)確的分型歸類,因此,常結(jié)合PCR進行準(zhǔn)確鑒定。PCR檢測方法已廣泛應(yīng)用于病原微生物的特異、敏感及快速的檢測,尤其適用于培養(yǎng)困難或血清學(xué)方法難以檢測的病原微生物。本試驗中參考倪秀艷針對cps2J基因合成的引物能擴增出相應(yīng)的目的片段,充分表明了PCR方法具有很高的特異性,完全適合于豬鏈球菌2型的診斷。

    由于鏈球菌廣泛存在于正常豬的呼吸道、扁桃體等器官和組織中,豬群鏈球菌的帶菌率與豬群是否發(fā)生豬鏈球病并無直接關(guān)系。鏈球菌是革蘭氏陽性菌,理論上很多藥物對其有療效。但近年來由于抗生素的濫用,如在動物飼料中長期添加抗生素用于促進生長及預(yù)防和治療疾病,發(fā)生疾病后為經(jīng)獸醫(yī)診斷就盲目大量使用多種抗生素,不僅治療成本提高,而且產(chǎn)生了大量耐藥菌株,使疾病難以控制。

    對該病原菌的藥敏試驗結(jié)果表明該分離菌株對復(fù)方新諾明、氨芐西林、恩諾沙星、青霉素、萬古霉素、阿莫西林高度敏感;對新霉素、卡那霉素、四環(huán)素、強力霉素、丁胺卡那、慶大霉素中度敏感;對多黏菌素有耐藥性。建議豬場在防治豬鏈球菌病時,對菌株進行藥敏試驗,根據(jù)試驗結(jié)果用2~3種敏感藥物按療程和適當(dāng)劑量交替使用。

    動物試驗是目前區(qū)分豬鏈球菌2型毒力唯一有效的方法。本試驗小鼠均于48 h內(nèi)死亡,表明該分離株為強致病菌株。

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