RNA干擾沉默胃癌細胞FasL表達的抗腫瘤免疫作用

何茂欽， 譚笑杏#， 阿合提別克·塔布斯， 馬博， 李劍輝

在我國，胃癌的發(fā)病率、死亡率高居第2位，僅次于肺癌［1］，也是全球癌癥死亡主要病因之一［2］。近年來胃癌的治療較以往已有很大的改進，但其5年總生存率低于25%，仍然不能令人滿意［3］。胃癌發(fā)病原因尚未明確，已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)胃癌細胞能夠抑制NK細胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，從而導(dǎo)致機體免疫功能異常［4］。腫瘤細胞的“反擊”可能是惡性腫瘤疾病進展的原因。目前已知促進細胞凋亡的TNF超家族（如DR3、DR5、FasL、Fas），抑制細胞凋亡的有IAP家族（如Livin、Survivin）、Bcl?2家族、FLIP、NF?kB等。胃癌細胞能夠高表達FasL、Liv?in、Survivin［5］，從而逃避機體免疫。我們應(yīng)用RNA干擾技術(shù)（RNA interferrence，RNAi）抑制胃癌細胞表達FasL，并將處理過的胃癌細胞與腫瘤特異性細胞毒T淋巴細胞（CTL）細胞共培養(yǎng)，探討其中可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

RPMI1640培養(yǎng)液、Hanks和PBS平衡液自行配制；絲裂霉素C（MMC）、促有絲分裂原ConA購自Sigma公司；淋巴細胞分離液由上海生化試劑二廠生產(chǎn)（比重1.077）；T細胞分離和純化柱（RTCC?5）和紅細胞溶解試劑盒購自加拿大真達科技公司。Plasmid Mini Purification Kit，Lipofectamine，胎牛血清，聚凝胺購自Gibco公司，G418購自Promega，各限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司。IL?12P70和IFN?γELISA檢測試劑盒購自晶美公司；細胞毒性分析試劑盒 Cyto Tox 96?Non?Radicative Cytotoxicity Assay Kit為Promega公司產(chǎn)品。mIL?12基因真核表達載體、DH5α大腸桿菌、PA317細胞、NIH3T3成纖維細胞，人外周血PBL取材自臨床標(biāo)本。

1.2 方法

1.2.1 胃癌細胞采集及Fas/FasL檢測 取臨床手術(shù)所切除胃癌組織標(biāo)本（胃竇癌標(biāo)本48例，胃體癌標(biāo)本15例，Ⅰ期胃癌占10%，Ⅱ期占23%，Ⅲ期占67%，部分為新鮮手術(shù)標(biāo)本，部分來源于組織標(biāo)本庫）。無菌條件下切取胃癌組織標(biāo)本，經(jīng)無菌Hanks液漂洗，用含1 g/L的Ⅰ型膠原酶、0.02 g/LⅡ型DNA酶和0.5 g/LⅠ型蛋白酶（Sigma Chemical Co，St.Louis，MO）的溶液消化腫瘤組織標(biāo)本，獲得細胞懸液。將上述細胞培養(yǎng)液制作細胞涂片，以S?P免疫組織化學(xué)染色方法，檢測人胃癌細胞Fas/FasL蛋白的表達情況。

1.2.2 腫瘤特異性CD8+CTL提取、特異性T淋巴細胞的建立 淋巴細胞分離液常規(guī)分離胃癌患者外周抗凝血PBL，離心后吸取中間乳白色的淋巴細胞層。提取胃癌細胞膜表面抗原。96孔細胞培養(yǎng)板中加入單個或數(shù)個目標(biāo)T細胞（有限稀釋法），再分別加入一定數(shù)量的腫瘤上皮抗原、飼養(yǎng)細胞、ConA和IL?2。在5%CO2溫箱中，37℃及95%濕度下培養(yǎng)1 h，將非貼壁細胞吸至離心管，再用37℃預(yù)溫的完全（含血清）RPMI?1640液輕輕蕩洗培養(yǎng)瓶，并將洗滌液亦收集到離心管中，在18～20℃下，離心10 min，棄上清，用5～10 mL完全RPMI?1640液重懸細胞，臺盼藍染色并計數(shù)活細胞，調(diào)整細胞濃度至0.5～1.0×107/mL。

1.2.3 構(gòu)建siRNA載體并轉(zhuǎn)染胃癌細胞后與CD8+CTL共培養(yǎng) 流式細胞儀檢測胃癌細胞中FasL的表達，提取FasL?mRNA，設(shè)計并合成特異性引物。按文獻報道方法合成FasL siRNA雙鏈分子（FasL?shRNA），檢測其基因沉默效應(yīng)，序列經(jīng)BLAST同源比較分析后顯示與其他人類基因序列無同源性。構(gòu)建攜帶上述shRNA的silencer質(zhì)粒載體并通過轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的細胞檢測其表達效率和抑制作用。構(gòu)建攜帶上述shRNA的蔓病毒pLL3.7載體，同上述silencer質(zhì)粒載體處理方法檢測表達效率和抑制作用。轉(zhuǎn)染前24 h，以1×105個/孔接種生長至對數(shù)期的目標(biāo)細胞于6孔板，將已制備好的FasL?siRNA混合物加入6孔板，陰性對照組僅加入脂質(zhì)體，空白對照組不做處理，轉(zhuǎn)染參照LppofectamineTM2000說明，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)。收集轉(zhuǎn)染48 h的3組細胞，加入MTT溶液（5 mg/mL），確定靶細胞最佳濃度，即光密度值至少為培養(yǎng)基對照光密度值的2倍。然后加入培養(yǎng)基共同培養(yǎng)。培養(yǎng)3 d、5 d、7 d后，酶標(biāo)儀測定各個孔的吸光度值（A值）。實驗重復(fù)3次。

1.2.4 細胞侵襲能力及胃癌細胞凋亡率檢測 實驗前在Transwell小室中間的聚碳酸酯濾膜上鋪上已預(yù)先稀釋好的Matrigel膠。將生長至對數(shù)期的T細胞制備成不含血清的單細胞懸液100μL（約1×105個細胞），接種于Transwell小室的上室，Tran?swell小室下室的每孔中加入含血清的培養(yǎng)基500μL，培養(yǎng)箱中孵育24 h，取出小室，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%的結(jié)晶紫染色10 min，PBS洗滌后將小室轉(zhuǎn)移至24孔板，隨機選擇6～8個視野，倒置顯微鏡觀察穿膜細胞數(shù)，取均值。實驗重復(fù)3次。依賴Ca2+的磷脂結(jié)合蛋白Annexin V能夠和PS（磷脂酸絲氨酸）高親和結(jié)合。熒光素（FITC）標(biāo)記的Annexin V被當(dāng)作檢測細胞膜表面PS的敏感探針，流式檢測凋亡細胞。

2 結(jié)果

2.1 處理前后胃癌細胞表達FasL情況

免疫組化結(jié)果顯示胃癌細胞有高表達FasL（圖1），而低表達Fas，可誘導(dǎo)表達Fas受體的宿主淋巴細胞凋亡（圖2），該機制可能參與了腫瘤的免疫逃逸，使腫瘤細胞逃避Fas/FasL系統(tǒng)介導(dǎo)的免疫清除作用。在導(dǎo)入FasL?siRNA（shRNA）后，流式細胞儀檢測實驗組胃癌細胞表達FasL量比較轉(zhuǎn)染前呈明顯下降，且實驗組胃癌細胞在轉(zhuǎn)染后比陰性對照組及空白對照組的FasL表達量均明顯減少，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），陰性對照與空白對照組間比較無明顯差異（P＞0.05）。

圖1 人胃癌細胞Fas/FasL表達情況 A、B、C：DAB染色；D：轉(zhuǎn)染前后各組胃癌細胞FasL表達情況

圖2 FasL的宿主淋巴細胞凋亡 A：200×；B：100×

2.2 經(jīng)腫瘤特異性抗原處理CTL對比

未免疫的淋巴細胞，呈球形或卵圓形，表面較光滑，有較多的顆粒和少量的微絨毛；經(jīng)免疫的淋巴細胞則表現(xiàn)為不典型的異常形態(tài)：表面有皺褶和少量微絨毛，甚至可見到長長的“偽足”，形態(tài)上類似單核細胞；有時細胞表面呈絨毛狀，有許多樹突狀突起，形態(tài)上類似樹突狀細胞（圖3）。在酶聯(lián)免疫檢測儀上測得570 nm的OD值，顯示經(jīng)免疫后的淋巴細胞對不同濃度ConA的增殖能力。腫瘤抗原免疫（陽性）組與未免疫（陰性）組的增殖反應(yīng)經(jīng)統(tǒng)計比較，前者顯著高于后者（P＜0.05；n=10）。

圖3 電鏡下觀察經(jīng)腫瘤免疫淋巴細胞超微結(jié)構(gòu)改變 A：未免疫淋巴細胞表面少量的微絨毛；B：經(jīng)免疫淋巴細胞表面可見“偽足”改變；C：腫瘤免疫后T細胞對不同濃度ConA的增殖能力

2.3 胃癌細胞與腫瘤特異性抗原處理CTL共培養(yǎng)結(jié)果

采用MTT法檢測各組在培養(yǎng)3 d、5 d、7 d后的吸光度值（OD），分析淋巴細胞的生長情況，結(jié)果顯示，培養(yǎng)5 d、7 d后實驗組的培養(yǎng)孔計數(shù)顯示腫瘤特異性CTL數(shù)量比陰性對照組及空白對照組明顯增多，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（見圖4）。

圖4 各組淋巴細胞在各時間點吸光度值測量值

2.4 胃癌細胞侵襲能力及細胞凋亡率檢測結(jié)果

侵襲試驗亦顯示RNA干擾沉默降低了胃癌細胞的侵襲能力，經(jīng)腫瘤細胞抗原處理過的CTL對胃癌細胞的特異殺傷效果顯著（圖5）。流式細胞儀檢測的各組細胞凋亡率結(jié)果顯示，F(xiàn)asL?siR?NA的高表達能提高胃癌細胞凋亡率（圖6）。

圖5 CD8+CTL細胞和胃癌細胞的共培養(yǎng)侵襲試驗顯示RNA干擾沉默降低了胃癌細胞的侵襲能力 A：200×；B：00×；**/*，與VC比較，P＜0.05

圖6 高表達FasL?siRNA的胃癌細胞凋亡率升高，細胞呈雙陽性（Annexin V+/PI+）

3 討論

人體細胞增殖與凋亡異常，可能導(dǎo)致細胞惡性轉(zhuǎn)化。細胞凋亡可通過內(nèi)源性和外源性兩個途徑觸發(fā)，F(xiàn)as/FasL途徑為外源性途徑，即可通過Fas受體與FasL結(jié)合發(fā)生三聚化，進而使Fas胞漿段（死亡結(jié)構(gòu)域，death domain）活化，使下游通路被激活。機體內(nèi)多種組織和細胞均可組成或經(jīng)激活誘導(dǎo)表達Fas，表達水平有較大變異，但以免疫系統(tǒng)的表達最豐富。FasL的表達較局限，主要存在于活化的T淋巴細胞、NK細胞、LAK細胞等免疫細胞的胞膜上。研究表明［6-8］，通過干擾Fas/FasL通路能影響細胞凋亡，說明Fas/FasL系統(tǒng)在細胞凋亡過程中起著重要作用。

在腫瘤細胞中，F(xiàn)as/FasL系統(tǒng)有調(diào)控細胞凋亡的作用，已成為腫瘤免疫治療研究的熱點。研究證實［9，10］，在多種惡性腫瘤細胞中，F(xiàn)as表達下降，F(xiàn)asL表達上調(diào)，使得淋巴細胞無法識別并激活腫瘤細胞表面的Fas，相反，惡性腫瘤細胞表達的FasL可識別并激活淋巴細胞表面的Fas啟動凋亡程序。本實驗亦觀察到胃癌細胞高表達FasL，提示胃癌細胞可能是通過高表達FasL介導(dǎo)逃避機體的免疫監(jiān)視。

RNAi的出現(xiàn)可以沉默胃癌細胞的FasL基因，下調(diào)胃癌細胞FasL的產(chǎn)生，或誘導(dǎo)Fas蛋白的高表達，消除或減弱腫瘤細胞對機體活性淋巴細胞的誘導(dǎo)凋亡作用，從而使機體對腫瘤的殺傷免疫潛能被激活。已有學(xué)者成功應(yīng)用RNAi調(diào)控腫瘤細胞的FasL表達并促進細胞凋亡［11］。本實驗我們用RNAi處理后的胃癌細胞，檢測FasL?mRNA量較處理前下降，說明導(dǎo)入的FasL?siRNA能夠抑制胃癌細胞表達FasL，在與腫瘤特異性CTL共培養(yǎng)后，胃癌細胞凋亡增加，證實應(yīng)用RNAi能使胃癌細胞FasL表達下降，并使其不能識別激活CTL表面的 Fas配體，這與Toshiki等［12］學(xué)者研究結(jié)果一致，且侵襲試驗亦顯示RNA干擾沉默降低了胃癌細胞的侵襲能力。

現(xiàn)階段對于siRNA的傳遞和導(dǎo)入方法仍需要進一步改善，對于多個siRNA同時導(dǎo)入體內(nèi)或siR?NA與化療藥物同時導(dǎo)入體內(nèi)產(chǎn)生的影響還需進一步研究。本實驗只在體外驗證RNAi能干擾胃癌細胞表達FasL，并使其不能逃避腫瘤特異性CTL的免疫清除，尚未在動物實驗體內(nèi)種植RNAi處理的胃癌細胞并跟蹤其生長、浸潤情況。因此，有關(guān)腫瘤細胞與免疫清除的相互作用仍需要后續(xù)進一步研究。