乳腺浸潤性導(dǎo)管癌BRCA1/2基因變異與腫瘤突變負(fù)荷相關(guān)

廖健偉， 吳畏， 李曉娟， 蕭曉琴， 蔣圓玲， 彭小芳， 歐陽能太*

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤［1］，可分為浸潤性和非浸潤性。其中浸潤性導(dǎo)管癌占了乳腺癌患者的絕大多數(shù)，以ER、PR、HER2為基礎(chǔ)的分子分型對此類乳腺癌內(nèi)分泌治療和靶向治療有明確指導(dǎo)作用，然而其晚期治療效果有待進(jìn)一步提升。近年來，以免疫檢查點(diǎn)抑制劑為代表的免疫治療備受關(guān)注，2019年P(guān)D?L1抑制劑Atezolizumab被FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于轉(zhuǎn)移性三陰性乳腺癌的治療。然而，包括乳腺癌在內(nèi)多種實(shí)體腫瘤采用免疫治療的平均應(yīng)答率只有20%左右，挖掘免疫治療的療效預(yù)測因子至關(guān)重要。腫瘤突變負(fù)荷（TMB）作為極具潛力的免疫療效預(yù)測因子，已列入非小細(xì)胞肺癌NCCN指南。TMB是指在基因組DNA每百萬堿基中被檢測出的體細(xì)胞基因變異總數(shù)，包含堿基替換、插入或缺失等變異。經(jīng)典的檢測TMB方法是用全外顯子組測序，檢測2萬多個基因的全外顯子區(qū)，檢測成本較高，然而以FoundationOne為代表的多基因靶向測序也可計算TMB，成本相對較低，臨床相對容易推廣。最近美國FDA受理了PD1抑制劑Prebrolizumab單藥治療TMB高且既往治療后進(jìn)展的實(shí)體瘤，預(yù)示該預(yù)測因子將有可能成為泛癌種免疫治療預(yù)測標(biāo)志物?；仡櫺匝芯恳喟l(fā)現(xiàn)，TMB與免疫檢查點(diǎn)抑制劑的療效成正相關(guān)［2］。進(jìn)一步有研究發(fā)現(xiàn)，POLE基因變異與TMB的高低有顯著相關(guān)性，POLE突變的腫瘤TMB較高，免疫療效較好［3］。然而，其它基因與TMB的相關(guān)性仍不清楚。高通量測序技術(shù)的應(yīng)用使得腫瘤分子分型變得更加精細(xì)，可一次性檢測多個基因，更全面地了解腫瘤基因突變譜，同時計算TMB，為快速尋找新的療效預(yù)測因子以及探索TMB的內(nèi)在生物學(xué)機(jī)制提供了可能。本研究旨在通過高通量測序技術(shù)，全面分析乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的基因突變情況，尋找潛在新的免疫療效標(biāo)志物，為進(jìn)一步藥物研發(fā)以及臨床診治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2018年10月至2020年3月中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院收治的原發(fā)性乳腺癌患者32例，平均（50.5±10.20）歲，所有病例的腫瘤組織均經(jīng)病理科確診均為乳腺浸潤性導(dǎo)管癌，ER、PR、HER2的表達(dá)情況如表1。

1.2 DNA提取及雜交捕獲測序

FFPE腫瘤組織標(biāo)本及外周血白細(xì)胞DNA的測序建庫采用OncoScreen Plus試劑盒（燃石，廣州），流程如下：取200 ng DNA，用Covaris M220（Covaris，MA，USA）進(jìn)行打斷，接著依次進(jìn)行末端修復(fù)、磷酸化和接頭連接。然后將200～400 bp的片段經(jīng)過探針雜交、磁珠純化、PCR擴(kuò)增形成目的文庫。文庫定量后，在 Nextseq550測序儀（Illumina，Inc.，USA）進(jìn)行雙端測序檢測，檢測520個癌癥相關(guān)基因，總覆蓋長度1.64 Mb，組織標(biāo)本平均測序深度1000×，白細(xì)胞標(biāo)本平均測序深度100×。

表1 32例乳腺癌患者ER、PR、HER2表達(dá)情況表

1.3 測序數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析流程參照先前的報道［4］。體細(xì)胞變異主要通過與人類參考基因組hg19版本比較得出?？截悢?shù)變異的計算以待測樣本檢測深度與陰性樣本基線（n＞50）進(jìn)行統(tǒng)計分析，拷貝數(shù)低于1.5為缺失，大于2.64為擴(kuò)增。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性主要檢測63個微衛(wèi)星的狀態(tài)，＞40%微衛(wèi)星異常判定為MSI?H，同時通過檢測 MLH1、MSH2、MSH6、PMS2和EpCAM等錯配修復(fù)基因的突變進(jìn)一步確認(rèn)。腫瘤突變負(fù)荷TMB的計算排除拷貝數(shù)變異、基因重排、大片段重排以及EGFR、ALK基因的激酶區(qū)變異，編碼區(qū)域?yàn)?.26 Mb，計算公式為TMB=基因變異（上述變異除外）/1.26 Mb。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0軟件和GraphPad Prism 7進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)分析。根據(jù)分組采用Fisher確切概率法比較組間的差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。比較兩組樣本均數(shù)采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 32例乳腺癌的基因變異結(jié)果

取32例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌標(biāo)本共檢測出體細(xì)胞基因變異482個，按不同的變異方式可分為9類（如表2所示）。其中，發(fā)生頻率最高的變異類型是拷貝數(shù)擴(kuò)增和錯義變異。由于同義變異多數(shù)不影響蛋白功能，將同義變異剔除后進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，檢出率最高的變異基因?yàn)門P53和PIK3CA，分別占7%和5%（表3）。腫瘤突變負(fù)荷中位值約為5.6。分別以5和10作為分界閾值，大于10/Mb的有3例，5～10/Mb的有15例，小于5/Mb的有14例（表4）。

表2 32例乳腺癌基因變異類型

2.2 基因變異與乳腺癌分子分型的關(guān)系

根據(jù)ER、PR、HER2的免疫組化結(jié)果，將32例乳腺癌進(jìn)行分組，分別為三陰性組4例、HER2陽性組4例和其它表達(dá)組24例。分別比較不同組之間TP53、PIK3CA和TMB基因突變。結(jié)果如表5～7所示，32例標(biāo)本中，檢測出84.4%TP53突變（27/32例），50%PIK3CA突變（16/32例）。另外，我們對乳腺癌的重要基因BRCA1/2和PI3K信號通路的的抑制因子PTEN也進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示18.8%BRCA1/2突變（6/32例），和9.4%PTEN突變（3/32例）。BRCA1/2、TP53、PIK3CA、PTEN以及TMB的突變與ER、PR、HER2的表達(dá)均無明顯相關(guān)性（P＞0.05）。

表3 32例乳腺癌各變異基因的占比

表4 32例乳腺癌腫瘤突變負(fù)荷的分布

2.3 不同基因變異與TMB的相關(guān)性

如圖1所示，BRCA1/2基因有害變異與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的TMB高低明顯相關(guān)，攜帶BRCA有害突變的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌TMB明顯高于未攜帶BRCA突變者（P＜0.05）。常見變異如TP53、PIK3CA以及PTEN與TMB的高低均未發(fā)現(xiàn)明顯相關(guān)性（P＞0.05）。

3 討論

近年來，因?yàn)橹委熜Ч@著，以PD1/PD?L1為代表的免疫治療逐步推廣到各種腫瘤的臨床治療中，然而整體有效率較低，因此尋找有效的免疫治療療效預(yù)測因子顯得尤為重要。

腫瘤突變負(fù)荷TMB定義為每兆堿基發(fā)生的體細(xì)胞變異總數(shù)。一般認(rèn)為，腫瘤的體細(xì)胞變異頻率越高，越容易產(chǎn)生能被免疫細(xì)胞所識別的抗原，有利于免疫殺傷。有研究發(fā)現(xiàn)，腸癌腫瘤抗原的增加與腫瘤浸潤性免疫細(xì)胞的數(shù)量正相關(guān)，并且患者有更高的生存率［5］。黑色素瘤的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤基因突變越多，患者對細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（cytotoxic lymphocyte antigen 4，CTLA?4）抑制劑的反應(yīng)越好，可能的原因是抗原多的情況下，CTLA?4抑制劑使得免疫細(xì)胞的活化與效力更強(qiáng)［6，7］。而在一項(xiàng)非小細(xì)胞肺癌的研究中，腫瘤突變負(fù)荷越高，其客觀緩解率越高，且無進(jìn)展生存期（progression free survival，PFS）越長，中位PFS約為14.5個月，而TMB低的亞組中位PFS只有3.5月［8］。對于小細(xì)胞肺癌，高的TMB同樣被證實(shí)可作為免疫療效好的預(yù)測因子［9］。一項(xiàng)針對泛癌種的超過7000名患者的研究發(fā)現(xiàn)，包括乳腺癌在內(nèi)的大多數(shù)實(shí)體瘤，TMB越高，對免疫抑制劑應(yīng)答反應(yīng)越好，總體生存率越高［10］。PD?L1表達(dá)已被批準(zhǔn)用于免疫治療的伴隨診斷，但PDL1與TMB無明顯相關(guān)性［11］。

表5 不同受體分型與TP53、PIK3CA基因變異的關(guān)

表6 不同受體分型與BRCA1/2、PTEN基因突變的關(guān)系

表7 不同受體分型與TMB的關(guān)系

圖1 BRCA1/2、TP53、PIK3CA、PTEN突變與TMB的相關(guān)性

伴隨MSI、NTRK重排等為代表的新型分子標(biāo)志物的問世，應(yīng)用高通量測序技術(shù)可以從腫瘤患者甄別出獲益群體，達(dá)到精準(zhǔn)診療［12-14］。本研究采用高通量測序技術(shù)，分析乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中不同亞型的基因突變狀態(tài)，并圍繞TMB進(jìn)行了相關(guān)性分析。據(jù)文獻(xiàn)報道，TP53、PIK3CA是乳腺癌最常見的變異基因，均占27%［15］。BRCA1/2突變發(fā)生率約為11%［16］。而我們檢測到TP53突變占84.4%，PIK3CA突變占50%，BRCA1/2突變占18.8%，是否與以前報道不一樣，還需增大樣本量進(jìn)一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)，TP53突變、PIK3CA激活突變或PTEN失活突變與TMB的高低均無顯著相關(guān)性。

在一項(xiàng)3000多例乳腺癌樣本的研究中，TMB的中位值約為2.63，低于本研究，該差異可能是入組標(biāo)準(zhǔn)和病例數(shù)不同所致。本研究的TMB值在不同受體分組中無明顯差別，與一項(xiàng)轉(zhuǎn)移性乳腺癌循環(huán)腫瘤DNA的小樣本研究中觀察到的結(jié)果一致［17］。另外，我們發(fā)現(xiàn)攜帶BRCA1/2基因變異的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌亞組，其TMB水平比沒有BRCA1/2變異的組高。BRCA1/2基因是同源重組修復(fù)的重要基因，其突變導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，與乳腺癌、卵巢癌等多種腫瘤易感性密切相關(guān)，并且是PARP抑制劑的療效標(biāo)志物。近年來，盡管BRCA1/2突變的病例在胰腺癌中占比較少，但基于良好的治療效果，美國FDA批準(zhǔn)PARP抑制劑Olaparib用于治療攜帶BRCA1/2胚系突變的轉(zhuǎn)移性胰腺癌。而有趣的是，不管微衛(wèi)星狀態(tài)是否穩(wěn)定，攜帶BRCA1/2突變的胰腺癌其TMB和PD?L1表達(dá)均較高［18］。可能的原因是BRCA1/2突變介導(dǎo)的同源重組修復(fù)缺陷導(dǎo)致基因組修復(fù)能力減弱，變異增多。因此，BRCA1/2基因不僅可作為PARP抑制的療效預(yù)測分子，還可能作為TMB的潛在預(yù)測因子。

綜上所述，我們的研究結(jié)果提示乳腺浸潤性導(dǎo)管癌BRCA1/2的有害突變是與TMB相關(guān)，可能是免疫療效的潛在預(yù)測因子。BRCA1/2基因突變的患者TMB較高，可能對免疫治療較敏感。