利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除XPO1基因?qū)σ认侔┘毎晟飳W(xué)功能的影響

黃嫻嫻，李苑華，黃鳳婷，張世能，莊燕妍

胰腺癌是最具侵襲性的癌癥之一，在全球癌癥 相關(guān)的死亡中排名第七。據(jù)Globocan 2018年的數(shù)據(jù)顯示，胰腺癌在全球最常見的癌癥排名第11位，因其早期癥狀隱匿，往往喪失手術(shù)機會，加之化療效果不佳，其5年生存率僅為9%，形勢仍十分嚴峻［1］。因此，探究新的治療靶點和治療策略成為亟待解決的問題。

真核生物的細胞核具有雙層膜結(jié)構(gòu)，核質(zhì)轉(zhuǎn)運是細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)不可或缺的過程。大分子物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運需要核質(zhì)轉(zhuǎn)運受體的介導(dǎo)才能實現(xiàn)。核輸出蛋白1（exportin?1，XPO1），又稱為染色體區(qū)域穩(wěn)定蛋白1（chromosome region maintenance，CRM1），是重要的核質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白之一，可識別并轉(zhuǎn)運相對分子質(zhì)量大于40 kDa（1 Da=0.9921 u）的RNAs及蛋白質(zhì)的出核，包括多個生長調(diào)節(jié)蛋白及腫瘤抑制蛋白如P53、P21、FOXO、NF?kB等［2］。研究發(fā)現(xiàn)，XPO1 在肺癌［3］、卵巢癌［4］、血液腫瘤［5］、前列腺癌［6］、多發(fā)性骨髓瘤［7］及胰腺癌［8］等多種人類惡性腫瘤中均存在異常表達，通過調(diào)控細胞增殖、凋亡、炎癥反應(yīng)、血管生成等多種機制促進腫瘤演進，可作為腫瘤治療的潛在靶點［9，10］。

CRISPR/Cas9技術(shù)利用Cas9核酸酶對靶向序列進行切割造成雙鏈DNA斷裂，以非同源末端鏈接（NHEJ）或同源重組（HR）方式進行修復(fù)，修復(fù)以非同源末端連接為主。這種只基于斷裂末端的修復(fù)方式會引起堿基缺失、插入及突變，達到基因敲除的目的。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，與正常胰腺導(dǎo)管上皮細胞H6C7、hTERT?HPNE相比，人胰腺癌細胞株 MIA PaCa?2、Capan?2、PANC?1、SW1990的XPO1蛋白表達量升高，以MIA?Paca2最為顯著［11］。因此，本文利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建XPO1敲除的MIA?Paca2細胞株，為后續(xù)XPO1參與胰腺癌演進的具體分子機制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑

細胞株：人胰腺癌細胞株MIA?Paca2購自中科院上海細胞庫，用DMEM培養(yǎng)基（含10%FBS、100 U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素）于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。

主要試劑：Cas9慢病毒、線性化的GV372載體質(zhì)粒、TOP10感受態(tài)菌體、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑和Polybrene均購自上海吉凱基因公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、嘌呤霉素、胰酶（Gibco）；小鼠XPO1單克隆抗體（Santa Cruz Biotechnology）；β?tubulin抗體及對應(yīng)二抗（Cell Signaling Technology，Inc.）、牛血清白蛋白（BSA）、RIPA裂解液、蛋白BCA定量試劑盒（碧云天）PDVF膜、EMD Millipore Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate（ECL超敏發(fā)光液）（Thermo Fisher Scientific Inc。）；細胞培養(yǎng)耗材（corning Incorporated）。

1.2 XPO1基因敲除的MIA?Paca2胰腺癌細胞的構(gòu)建

1.2.1 sgRNA?XPO1慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建 sgRNA?XPO1（序列 GGATTATGTGAACAGAAAAG），XPO1單鏈DNA Oligo（XPO1?sg見表1）由上海吉凱基因公司設(shè)計及合成，把合成的XPO1單鏈DNA Oligo溶解于退火緩沖液中，95℃水浴15min，然后自然冷卻至室溫，形成帶粘性末端的雙鏈，將退火產(chǎn)物稀釋200倍后使用。由BsmBI酶線性化載體質(zhì)粒，取載體質(zhì)粒1 μg，10× Buffer Tango 2 μL，DTT（20 mmol/L）1μL，BsmBI 1μL，加去離子水將體系補至20μL，經(jīng)過37℃酶切3小時得到線性化載體DNA，取雙鏈DNA 0.5μL，線性化的載體質(zhì)粒2μL，10×T4 Buffer 1μL，pEG4000，1μL，T4 DNA Ligase 1μL，加去離子水補至10μL，經(jīng)16℃、3 h孵育獲得酶切連接產(chǎn)物。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至TOP10感受態(tài)菌體內(nèi)，將其均勻地涂布在含氨芐西林（Amp）的固體培養(yǎng)基上，次日挑取單菌落進行PCR鑒定，得到陽性克隆后測序，得到序列正確的表達sgRNA的過表達慢病毒質(zhì)粒。擴增序列正確的克隆菌液，用中小量質(zhì)粒提取試劑盒（天根）提取質(zhì)粒，送檢測序，引物序列為XPO1?seq。

1.2.2 sgRNA?XPO1慢病毒包裝 將狀態(tài)良好的293T細胞接種于六孔板，細胞密度達70%時更換成無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)2 h，取2支1.5 mL離心管，一支加入慢病毒包裝輔助載體psPAX2、pCMV?VSV?G質(zhì)粒各250 ng，sgRNA?XPO1質(zhì)粒500 ng，無血清培養(yǎng)基50μL，另一支加入3μL轉(zhuǎn)染劑及47μL無血清培養(yǎng)基，靜置10 min，將2支離心管液體混勻，室溫孵育20 min，加入293T細胞的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后收集293T細胞上清液，離心去沉淀，上清用0.22μm濾膜過濾后即為慢病毒液。

1.2.3 sgRNA?XPO1慢病毒感染細胞及穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選 將生長狀態(tài)良好的MIA?Paca2細胞種于六孔板，細胞密度為30%時加入1 mL慢病毒液及5μg/mL促感染試劑（Polybrene），培養(yǎng)12 h后更換為完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。將轉(zhuǎn)染后細胞接種于24孔板，細胞密度為80%時分別加入含0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0及4.0μg/mL嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基，取5天內(nèi)殺死所有細胞的最低濃度為最適篩選濃度（2.0μg/mL），細胞培養(yǎng)3 d，用2μg/mL嘌呤霉素篩選3 d獲得XPO1敲除穩(wěn)轉(zhuǎn)株，用有限稀釋法將細胞接種至96孔板，取單細胞生長的孔進行擴增，再用半數(shù)篩選濃度維持培養(yǎng)，擴增后送DNA測序及后續(xù)細胞功能檢測。

1.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測細胞XPO1蛋白表達

將細胞培養(yǎng)24 h后，用RIPA裂解液（碧云天）提取細胞總蛋白，5×SDS上樣緩沖液變性蛋白，BCA法（碧云天）測定蛋白濃度，取30μg總蛋白上樣，70 V轉(zhuǎn)110V，恒壓條件下進行SDS?PAGE電泳90 min，250 mA恒流低溫條件下至PVDF膜濕轉(zhuǎn)120 min，5%BSA搖床封閉1 h，一抗（XPO1，CST，1∶1000；GAPDH，CST，1∶1000）4℃孵育過夜，用TBST洗10 min×3次，用二抗（CST，1∶5000）室溫孵育1 h，TBST洗10 min×3次，ECL化學(xué)顯色，ImageJ軟件分析蛋白條帶，實驗重復(fù)3次。

1.4 流式細胞分析檢測細胞凋亡及周期

取生長狀態(tài)良好的野生型及XPO1敲除的MIA?Paca2細胞株，用胰酶消化并制成（2～5）×105/mL濃度的細胞懸液，0.5 mL用于細胞凋亡檢測，0.5 mL用于細胞周期檢測，其他步驟嚴格遵照試劑盒說明書。實驗獨立重復(fù)3次。

1.5 CCK8法檢測IC50

將野生型及XPO1敲除的MIA?Paca2細胞株以5×103個細胞/孔濃度接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后加入用完全培養(yǎng)基稀釋的不同濃度的吉西他濱（GEM，8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03 mmol/L）作用48 h后，棄培養(yǎng)基，更換為含10%CCK8的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3 h后，于450 nm波長處測吸光度值（A450 nm），求得各組A450 nm值的平均值。用SPSS軟件計算藥物作用的50%抑制濃度（IC50）。實驗獨立重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計分析

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組間采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。每種實驗獨立重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 sgRNA?XPO1慢病毒的構(gòu)建

由BbsI酶切的線性化GV372載體質(zhì)粒（圖1），與設(shè)計好的sgRNA?XPO1連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到TOP10感受態(tài)菌體內(nèi)，挑取單菌落進行鑒定及測序，引物序列XPO1?seq見表1。測序結(jié)果顯示，sgRNA?XPO1慢病毒已成功插入紅色方框所示sgRNA?XPO1序列（圖2）。

圖1 GV392質(zhì)粒載體圖譜

表1 引物序列

圖2 sg?XP01質(zhì)粒測序圖（紅色邊框區(qū)域為插入的sg?XP01片段）

2.2 XPO1敲除MIA?Paca2細胞的構(gòu)建

sgRNA?XPO1慢病毒感染MIA?Paca2細胞，12 h后換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，2 d后換含2μg/mL嘌呤霉素培養(yǎng)基篩選3 d。用有限稀釋法獲得單克隆細胞并進行擴增。蛋白質(zhì)印跡法檢測野生型與XPO1敲除細胞株XPO1蛋白表達情況，XPO1敲除細胞株XPO1蛋白表達（0.2003±0.0844）水平較野生型（0.4611±0.139）明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖3）。取蛋白質(zhì)印跡法蛋白印跡灰度明顯降低的細胞擴增培養(yǎng)，即單克隆細胞株KO組，提取野生型細胞及KO組細胞株基因組DNA送測序。由Cas9核酸酶產(chǎn)生的多個切割位點發(fā)生插入突變，KO組相比野生型發(fā)生多個堿基突變（圖4）?；蚣暗鞍姿綑z測結(jié)果證實成功構(gòu)建 XPO1敲除的MIA?Paca2細胞株。

圖3 XP01敲除細胞株與野生型細胞XP01蛋白表達

圖4 XP01敲除細胞株與野生型細胞基因序列對比

2.3 XPO1敲除對細胞凋亡及周期的影響

流式細胞分析示，與野生型MIA?Paca2細胞相比，XPO1敲除的細胞株細胞凋亡率升高（圖5A）；其細胞周期G1期及S期細胞比例無明顯變化，G2/M期細胞比例明顯升高（圖5B），提示XPO1敲除后細胞發(fā)生G2/M期阻滯，與凋亡率升高呈正相關(guān)關(guān)系。

2.4 XPO1敲除對細胞吉西他濱敏感性的影響

CCK8法檢測野生型及XPO1敲除的MIA?Paca2細胞株對吉西他濱敏感性，結(jié)果顯示，野生型及XPO1敲除的細胞株對吉西他濱IC50分別為6.45 mmol/L及2.27 mmol/L。XPO1敲除后，MIA?Paca2細胞對吉西他濱的敏感性提高（圖6）。

3 討論

蛋白質(zhì)的錯誤定位將導(dǎo)致腫瘤、自身免疫性疾病等疾病的發(fā)生，而核質(zhì)轉(zhuǎn)運系統(tǒng)調(diào)節(jié)多種物質(zhì)的亞細胞定位，XPO1作為核質(zhì)轉(zhuǎn)運的重要受體在多種侵襲性腫瘤中異常高表達。XPO1介導(dǎo)的核質(zhì)轉(zhuǎn)運需通過識別特異的核輸出信號（nuclear export signal，NES）序列，NES是一段高度保守且富含亮氨酸的疏水氨基酸序列。XPO1與含有NES序列的貨物蛋白結(jié)合并將其轉(zhuǎn)運到胞質(zhì)［12］。XPO1表達增高使更多的生長調(diào)節(jié)蛋白（GRPs，如c?myc及BCR?ABL）被轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中并激活下游信號傳導(dǎo)，導(dǎo)致持續(xù)的細胞增殖，而輸出腫瘤抑制蛋白（TSP，如Rb，p53，p21或p27）使其功能被滅活，使腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)視［13］。XPO1靶向小分子抑制劑如雷帕霉素，核出口選擇性抑制劑（SINE）如KPT?330、KPT?8602與含 NES 的蛋白競爭結(jié)合XPO1的疏水性凹槽結(jié)構(gòu)（疏水活性口袋）中的活性Cys528位點，抑制出核運動［14］，進而發(fā)揮抗腫瘤作用。

圖5 XP01敲除對細胞凋亡及周期的影響

圖6 XP01敲除細胞株與野生型細胞對吉西他濱IC50擬合曲線

CRISPR/Cas9技術(shù)是目前較為先進而被廣泛應(yīng)用的基因編輯技術(shù)，相較轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)核酸酶（TALEN）和鋅指核酸酶（ZFN）分子技術(shù)，它具有設(shè)計簡單、特異性高、效率高、成本低的優(yōu)點［15］，在基因組編輯、基因治療、遺傳篩查等方面有廣泛的應(yīng)用前景。本文用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測正常胰腺導(dǎo)管上皮細胞及胰腺癌細胞株XPO1表達量，選取表達最高的MIA?Paca2細胞做XPO1基因敲除，利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建XPO1敲除的MIA?Paca2細胞株，并探討XPO1敲除對細胞凋亡、細胞周期及對吉西他濱敏感性的影響。結(jié)果顯示，XPO1敲除后，MIA?Paca2細胞凋亡率升高，細胞周期發(fā)生G2/M期阻滯，對吉西他濱IC50降低，提示XPO1基因敲除增強了吉西他濱的化療敏感性。

我們前期研究已證實XPO1抑制劑KPT?330可抑制胰腺癌細胞的增殖及凋亡，但XPO1影響胰腺癌發(fā)生發(fā)展的具體分子及機制尚不明確，仍有待進一步研究。我們已通過CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建XPO1基因敲除的MIA?Paca2細胞株，擬進一步設(shè)計并構(gòu)建質(zhì)粒對Cas9核酸酶切除位點插入片段造成同義突變，進一步驗證XPO1位點敲除及同義修復(fù)前后對細胞功能及藥物敏感性的影響，并開展動物實驗，從分子層面探討XPO1在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展的具體機制。