川南腌菜耐鹽生香酵母的篩選、鑒定及特性

唐紅梅，王浩文，吳華昌，鄧 靜*，劉 陽(yáng)，王藝瑾

（1.四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 宜賓 644000；2.四川旅游學(xué)院食品學(xué)院，四川 成都 610100；3.四川旅游學(xué)院 烹飪科學(xué)四川省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610100）

川南腌菜主要以內(nèi)江大頭菜、宜賓芽菜為代表，經(jīng)食鹽高滲、微生物發(fā)酵、蛋白質(zhì)分解及脫水加工制成[1]，具有美味脆爽、咸鮮辛辣等風(fēng)味特點(diǎn)，含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)[2]，具有開胃健脾的功效，深受廣大消費(fèi)者青睞[3]。目前，對(duì)于川南腌菜的研究主要集中于衍生產(chǎn)品的開發(fā)[4]、風(fēng)味及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分析[5]、細(xì)菌群落分析[6]、乳酸菌的篩選、菌相[7]等方面的研究，而對(duì)生香酵母的研究較少。生香酵母作為發(fā)酵產(chǎn)品風(fēng)味形成的重要菌株，目前已有諸多研究。姚博等[8]從甘肅漿水菜中分離了1 株生香酵母并對(duì)其進(jìn)行了增值培養(yǎng)基優(yōu)化。Li Xin等[9]建立了魯氏耐鹽酵母菌的高密度培養(yǎng)方法，以期應(yīng)用于醬油生產(chǎn)中提升產(chǎn)品品質(zhì)。Gu Qihui等[10]從番木瓜中分離出了產(chǎn)香酵母。Akitoshi等[11]從日本海洋沉淀物中分離出甜瓜產(chǎn)香酵母。以上研究為實(shí)驗(yàn)的開展提供了指導(dǎo)。

傳統(tǒng)自然發(fā)酵腌菜微生物體系復(fù)雜，主要優(yōu)勢(shì)菌群是乳酸菌與酵母菌，乳酸菌產(chǎn)生乳酸及細(xì)菌素，在腌菜發(fā)酵過程中主要抑制致病菌的生長(zhǎng)[12]，而要形成腌菜獨(dú)特的風(fēng)味需要乳酸菌與酵母菌的共同作用[13-14]。一般自然發(fā)酵的微生物體系不穩(wěn)定、極易受自然環(huán)境的影響，產(chǎn)品難以達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化、工業(yè)化，極大地限制了腌菜的發(fā)展，所以腌菜發(fā)酵菌劑的制備具有重要現(xiàn)實(shí)意義，而生香酵母的篩選為腌菜發(fā)酵菌劑的制備奠定了基礎(chǔ)。

鹽是腌菜制作過程中必需的原料，影響其感官特性與安全性[15]。使用適當(dāng)濃度的鹽在有效促進(jìn)有益微生物生長(zhǎng)的同時(shí)，還可以提高腌菜的感官品質(zhì)，保證腌菜的質(zhì)量和風(fēng)味[16-17]。目前市場(chǎng)上的腌菜主要是傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)而成，含鹽量較高（含NaCl 10%～20%），但隨著人們健康意識(shí)的提升，低鹽及新工藝腌菜（含NaCl 3%～9%）存在巨大發(fā)展空間[18]。為解決這一問題及適應(yīng)市場(chǎng)的需求，本研究期望從川南腌菜中篩選出耐鹽幅度廣（耐NaCl 3%～15%）、生香能力強(qiáng)的酵母菌，并對(duì)其特性進(jìn)行初步研究，以期為更深入探究及生香酵母活菌劑的制備奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮大頭菜（A） 內(nèi)江市中區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；大頭菜鹽腌汁液（B）、半成品大頭菜塊（C）、半成品大頭菜絲（D） 四川內(nèi)江威寶食品有限公司；新鮮芽菜（E）宜賓翠屏區(qū)菜市場(chǎng)；宜賓芽菜（F） 四川宜賓碎米芽菜有限公司。

富集培養(yǎng)基：130.1 g麥芽汁培養(yǎng)基，加入1 000 mL蒸餾水，調(diào)節(jié)適宜的鹽度及pH值；酵母膏胨葡萄糖瓊脂（yeast peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：葡萄糖2%，酵母膏1%，蛋白胨2%，加入2%瓊脂粉，自然pH值；酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）液體培養(yǎng)基：葡萄糖2%，酵母膏1%，蛋白胨2%，自然pH值；孟加拉紅固體培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）液體培養(yǎng)基：馬鈴薯20%，葡萄糖2%，自然pH值；氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyte-trazoliumchloride，TTC）上層培養(yǎng)基[19]：TTC 0.05 g，葡萄糖0.5 g，瓊脂1.5 g，蒸餾水100 mL，121 ℃滅菌20 min。培養(yǎng)基滅菌后，冷卻至50～60 ℃左右時(shí)，再加入0.05 g TTC，搖勻后，立即傾于底層平板上；TTC下層培養(yǎng)基：葡萄糖2 g，蛋白胨2 g，酵母膏1 g，瓊脂2 g，蒸餾水100 mL，121 ℃滅菌20 min。以上培養(yǎng)基均在121 ℃滅菌25 min。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外分光光度計(jì) 北京萊伯泰科儀器有限公司；GZ-150-S生化培養(yǎng)箱 韶關(guān)市廣智科技設(shè)備有限公司；搖床 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品理化性質(zhì)的測(cè)定

根據(jù)GB 5009.44—2016《食品中氯化物的測(cè)定》[20]對(duì)樣品的含鹽量進(jìn)行測(cè)定；根據(jù)GB/T 10468—1989《水果和蔬菜產(chǎn)品pH值的測(cè)定方法》[21]對(duì)樣品pH值進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2 菌種富集[22]

根據(jù)1.3.1節(jié)測(cè)定的樣品含鹽量及pH值，調(diào)節(jié)相應(yīng)富集培養(yǎng)基的鹽度及pH值，為酵母菌提供最適的生長(zhǎng)環(huán)境。取液體樣品2.5 mL、切碎混勻后的固體樣品2.5 g分別裝入含100 mL富集培養(yǎng)基的三角瓶，28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后，再吸取2.5 mL富集培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到新的富集培養(yǎng)基中，置于同樣條件下再次富集培養(yǎng)。

1.3.3 分離耐鹽酵母菌

為避免直接從高鹽度進(jìn)行篩選得出嗜鹽菌的情況，采用從低鹽度至高鹽度逐步篩選的方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取經(jīng)過2 次富集培養(yǎng)后的菌懸液1 mL接種于質(zhì)量分?jǐn)?shù)3% NaCl的100 mL YEPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h，測(cè)OD600nm值。以未接菌的YEPD液體培養(yǎng)基作空白對(duì)照，判斷有無活菌存在。若有則分別取0.1 mL（100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8的菌液稀釋液）涂布于孟加拉紅固體培養(yǎng)基中，每個(gè)梯度涂2 個(gè)平板，28 ℃培養(yǎng)2～3 d，待長(zhǎng)出菌落后，挑取變紅單菌落經(jīng)初步鏡檢確定為酵母菌后，進(jìn)一步在YPD培養(yǎng)基上劃線純化2～3 次，至純種為止。

1.3.4 初篩

取純化后的酵母菌2 環(huán)接種于50 mL NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9%的YEPD液體培養(yǎng)基中，以未接菌的YEPD液體培養(yǎng)基作空白對(duì)照，于28 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h，測(cè)定OD600nm值，判斷各菌株生長(zhǎng)情況即反映菌株耐鹽能力的強(qiáng)弱。選擇耐9% NaCl能力強(qiáng)的菌株進(jìn)行耐15% NaCl能力測(cè)試，最后在耐15% NaCl基礎(chǔ)上選擇耐鹽能力強(qiáng)的菌株進(jìn)行耐18% NaCl測(cè)試。一般在培養(yǎng)24 h左右大多數(shù)酵母菌便進(jìn)入穩(wěn)定期[23-25]，所以可根據(jù)24 h OD600nm值反應(yīng)各菌株耐鹽能力強(qiáng)弱。菌株耐鹽能力強(qiáng)弱標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 酵母菌株耐鹽能力標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for evaluation of salt tolerance of yeast strains

1.3.5 復(fù)篩

1.3.5.1 感官篩選

前期實(shí)驗(yàn)證明酵母菌在PDA液體培養(yǎng)基中的產(chǎn)香效果優(yōu)于YEPD液體培養(yǎng)基，所以選擇PDA液體培養(yǎng)基作為生香實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基。將制備好的菌懸液按2%的比例接種到50 mL PDA液體培養(yǎng)基中，以不接菌的PDA作空白對(duì)照，每個(gè)樣品做3 個(gè)平行，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后采用嗅聞法進(jìn)行感官評(píng)定，排除產(chǎn)香能力較弱及產(chǎn)不良?xì)馕兜木?。感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2[26-27]。

表2 酵母菌株感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Criteria for sensory evaluation of yeast strains

1.3.5.2 理化篩選

在感官評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)上篩選出能產(chǎn)生較明顯香氣的菌株，作為理化篩選的出發(fā)菌株，進(jìn)一步篩選出具備較強(qiáng)產(chǎn)香能力的優(yōu)良酵母菌株。酵母在發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生很多風(fēng)味物質(zhì)，包括醇類、酸類、酯類等，其含量可以反映出生香能力的強(qiáng)弱。

將制備好的菌懸液按5%的比例接種于50 mL PDA培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min培養(yǎng)72 h后，進(jìn)行總酯、總酸、產(chǎn)醇能力測(cè)試。總酯、總酸測(cè)定參考文獻(xiàn)[28]；產(chǎn)醇能力測(cè)定采用TTC顯色法[29]。產(chǎn)醇能力評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)見表3。

表3 產(chǎn)醇能力評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Criteria for evaluation of alcohol production ability of yeast strains

1.3.6 菌株鑒定

基因組D N A的提取按D P 3 3 6試劑盒的操作進(jìn)行，選擇ITS rDNA序列通用引物[30]（ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增。PCR條件：98 ℃預(yù)變性3 min，98 ℃變性10 s，53 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物的測(cè)序工作由成都擎科生物梓熙生物技術(shù)有限公司完成，將測(cè)序結(jié)果登錄NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)，用ClustalX軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，用MEGA7繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.7 酵母菌特性分析

1.3.7.1 生長(zhǎng)曲線及pH值測(cè)定

按5%接種量將擴(kuò)大培養(yǎng)后酵母菌懸液接種于200 mL液體YEPD培養(yǎng)基中，振蕩搖勻后，于28 ℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)0、4、8、12、16、20、24、26、28、30、32、34、36 h后，測(cè)定生長(zhǎng)曲線及pH值的變化情況。

1.3.7.2 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)總酸含量的影響

取制備好的菌懸液按5%的比例接入100 mL含6%、9%、12%、15%質(zhì)量分?jǐn)?shù)NaCl的PDA液體培養(yǎng)基中，以0%質(zhì)量分?jǐn)?shù)NaCl作為對(duì)照組（CK），于28 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)，取12、24、36、48、60、72 h的酵母發(fā)酵液，對(duì)總酸進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品理化性質(zhì)測(cè)定結(jié)果

根據(jù)GB 5009.44—2016[20]與GB/T 10468—1989[21]對(duì)樣品的含鹽量及pH值進(jìn)行測(cè)定（表4），發(fā)現(xiàn)樣品B、C、D、F的含鹽量均低于文獻(xiàn)所述[31]，可能是由于樣品是經(jīng)過脫鹽處理或者是低鹽工藝加工而成的。6 個(gè)樣品整體pH值偏低，可有效抑制腌菜中腐敗菌的生長(zhǎng)?！纒。

表4 樣品理化指標(biāo)Table 4 Physicochemical parameters of samples

2.2 耐鹽酵母菌的篩選

分離出酵母疑似菌179 株，后經(jīng)YPD培養(yǎng)基劃線純化后對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)酵母菌形態(tài)，初步篩選出形態(tài)具有較明顯差異的酵母菌121 株。由實(shí)驗(yàn)可知，所有菌株均可耐受質(zhì)量分?jǐn)?shù)9% NaCl且能較好生長(zhǎng)。由表5可知，51 株酵母菌能夠耐受質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%的NaCl。選取在15% NaCl耐鹽能力中等及以上的26 株菌進(jìn)行更高鹽濃度耐受實(shí)驗(yàn)。由表5、6可知，從川南腌菜中篩選得到的酵母菌株最高可耐15% NaCl，在18% NaCl下生長(zhǎng)受到了嚴(yán)重抑制。

課堂學(xué)習(xí)效果V2（83.7）中難點(diǎn)解決V21（85.2）、知識(shí)應(yīng)用V22（85.0）、實(shí)操技能V25（85.4）分?jǐn)?shù)最高，大部分學(xué)生較好掌握，說明任課教師專業(yè)理論和實(shí)踐教學(xué)能力強(qiáng)、重點(diǎn)難點(diǎn)把握到位；交流討論V23（77.9）、團(tuán)隊(duì)協(xié)作V24（78.6）得分較低，說明任課教師課堂教學(xué)過程中調(diào)動(dòng)學(xué)生積極參與討論、引導(dǎo)學(xué)生注重團(tuán)隊(duì)協(xié)作方面略顯不足。

表5 酵母菌株耐15% NaCl實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Tolerance of yeast strains to 15% NaCl

表6 酵母菌株耐18% NaCl實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6 Tolerance of yeast strains to 18% NaCl

2.3 生香酵母的篩選

2.3.1 感官篩選結(jié)果

選擇耐15% NaCl較好的26 株菌（表7），根據(jù)感官篩選出能產(chǎn)生較明顯的酯香、醇香或其他香氣的15 株酵母菌：YC4、YC17、YA2、YD11、YC14、YF24、YB6、YB10、YF17、YB4、YB14、YF21、YB18、YC5、YC9。

表7 耐鹽酵母菌株生香能力Table 7 Aroma production ability of salt-tolerant yeast strains

2.3.2 理化篩選結(jié)果

2.3.2.1 總酯測(cè)定結(jié)果

酯類作為酵母發(fā)酵產(chǎn)物中主要的呈香物質(zhì)，可產(chǎn)生豐富的果香[32]、花香[33]、蜜香[34]等，是評(píng)判酵母菌株生香能力的重要指標(biāo)。采用皂化回流法對(duì)感官嗅聞生香能力較強(qiáng)的15 株菌進(jìn)行總酯的測(cè)定。由圖1可知，培養(yǎng)72 h后發(fā)酵液中總酯含量較高的酵母菌株為YF17、YB4、YC14、YB18、YB14，菌株YF17、YB4的產(chǎn)酯能力最強(qiáng)，分別為1.75、1.66 g/100 mL；菌株YC14、YB18次之，分別為1.37、1.34 g/100 mL。

圖1 耐鹽酵母菌株總酯含量Fig. 1 Total ester contents of salt-tolerant yeast strains

2.3.2.2 總酸測(cè)定結(jié)果

有機(jī)酸影響發(fā)酵產(chǎn)品的風(fēng)味與滋味，是構(gòu)成酵母揮發(fā)性風(fēng)味的重要前體物質(zhì)，可與醇發(fā)生酯化反應(yīng)，生成酯類物質(zhì)，對(duì)發(fā)酵風(fēng)味貢獻(xiàn)較大[35]。采用滴定法對(duì)發(fā)酵液中的總酸含量進(jìn)行測(cè)定，由圖2可知，菌株YB4的產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，YC4次之，YB14最弱。菌株YB4 72 h總酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.225%，比YC4高1.71 倍，比YB14高12.24 倍。

圖2 耐鹽酵母菌株總酸含量的測(cè)定結(jié)果Fig. 2 Total acid contents of salt-tolerant yeast strains

2.3.2.3 產(chǎn)醇實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表8 耐鹽酵母菌株產(chǎn)醇能力比較Table 8 Comparison in alcohol production ability of four salt-tolerant yeast strains

根據(jù)產(chǎn)酯、產(chǎn)酸及產(chǎn)醇能力的測(cè)試結(jié)果，綜合分析篩選出生香能力最優(yōu)的菌株YB4、YB18、YC14、YF17。

2.4 菌株的鑒定

2.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定

將篩選出的4 株優(yōu)勢(shì)菌，平板劃線接種于PDA、YPD、孟加拉紅培養(yǎng)基上進(jìn)行形態(tài)觀察，結(jié)果見圖3。4 株酵母菌在3 種培養(yǎng)基上菌落呈現(xiàn)出不同的形態(tài)特征及顏色，其中YB4、YB18在孟加拉紅培養(yǎng)基上呈現(xiàn)深紅色，YC14、YF17呈現(xiàn)的粉紅色；YB4細(xì)胞形態(tài)為圓形或卵圓形，YB18、YC14、YF17細(xì)胞形態(tài)為卵圓形。

圖3 菌株在不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)（×400）Fig. 3 Colony morphology and cell morphology (× 400) of strains when cultured on different media

2.4.2 菌株分子鑒定

將PCR擴(kuò)增得到的單一DNA片段，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳得出700 bp左右的擴(kuò)增條帶，擴(kuò)增圖譜見圖4。

圖4 4 株菌的ITS rDNA擴(kuò)增片段凝膠電泳圖Fig. 4 Gel electrophoretograms of amplified ITS rDNA from four yeast strains

將ITS測(cè)序結(jié)果輸入NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)，選取同源性較高的模式菌株運(yùn)用鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，且Bootstrap對(duì)進(jìn)化樹進(jìn)行1 000 次可信度分析，見圖5。YF17經(jīng)多次純化后多次測(cè)序，結(jié)果均顯示為雙峰，應(yīng)用ITS測(cè)序的方式不能進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，可能是由于ITS測(cè)序方式不適用于YF17的鑒定。

圖5 3 株菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 5 Phylogenetic tree of three identified yeast strains

2.5 4 株酵母菌生長(zhǎng)曲線與pH值的變化情況

圖6 4 株酵母菌生長(zhǎng)曲線與pH值變化情況Fig. 6 Growth curves and changes in pH of four yeast strains

酵母在生長(zhǎng)過程中的一些代謝產(chǎn)物會(huì)使培養(yǎng)基的pH值發(fā)生改變，監(jiān)控發(fā)酵過程中酵母菌株的生長(zhǎng)情況及發(fā)酵液的pH值變化，可為酵母菌的實(shí)際應(yīng)用提供依據(jù)。由圖6可知，YB4在24 h后進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期；YB18在30 h后出現(xiàn)一定程度的衰亡，可能是生長(zhǎng)繁殖旺盛消耗大量底物導(dǎo)致不能提供充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以供其繼續(xù)生長(zhǎng)或細(xì)胞穩(wěn)定性較差；YC14在24 h后進(jìn)入穩(wěn)定期；YF17在20 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。以上可以看出，相同接種量、培養(yǎng)條件下，YB4、YC14、YF17的細(xì)胞穩(wěn)定性優(yōu)于YB18；YF17最先進(jìn)入穩(wěn)定期；酵母菌在pH 3.8～6.0的范圍內(nèi)能夠較好地生長(zhǎng)，因此4 株菌產(chǎn)生的pH值環(huán)境均在各自生長(zhǎng)能接受的范圍內(nèi)。

2.6 4 株酵母菌總酸的變化情況

通過測(cè)定培養(yǎng)過程中總酸的變化，可以反映菌株自身的生香特性及不同NaCl濃度對(duì)菌株生香的影響。由圖7可知，與對(duì)照組相比，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaCl對(duì)YB4產(chǎn)酸均產(chǎn)生了不同程度的抑制且各鹽度下YB4總酸變化情況不同：對(duì)照組總酸含量呈急劇下降后緩慢上升最后再下降的變化趨勢(shì)；6% NaCl下，12～48 h總酸含量出現(xiàn)較小幅度的降低，48 h后總酸含量發(fā)生增加；在9%、15%的NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，總酸含量呈先下降后上升再下降后緩慢上升的規(guī)律性變化；在12% NaCl下，總酸含量先降低后上升最后趨于穩(wěn)定。通過縱向比較發(fā)現(xiàn)：在12～72 h，各實(shí)驗(yàn)組的總酸含量與對(duì)照組相比有顯著性差異（P＜0.05）。

圖7 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)YB4總酸含量的影響Fig. 7 In fluence of different salt concentrations on total acid production of YB4

由圖8可知，在12～60 h，與對(duì)照組相比，6%、9%、12%、15%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaCl均對(duì)YB18產(chǎn)酸量產(chǎn)生了明顯抑制（P＜0.05）。培養(yǎng)至第72小時(shí)，6% NaCl下的總酸含量顯著高于其余各實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05），可能由于YB18的適鹽能力的激發(fā)，一定程度的含鹽量反而有利于產(chǎn)酸能力的增強(qiáng)。

圖8 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)YB18總酸含量的影響Fig. 8 Inf l uence of different salt concentrations on total acid production of YB18

由圖9可知，YC14在各NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)下的總酸含量整體呈上升趨勢(shì)，9% NaCl總酸含量與對(duì)照組變化規(guī)律一致；60 h后6% NaCl下YC14的總酸含量明顯增加，至第72小時(shí)總酸含量接近對(duì)照組，這與YB18在6% NaCl下的總酸變化規(guī)律相似。從縱向分析，培養(yǎng)時(shí)間為12～60 h時(shí)，6%、9%、12%、15% NaCl均對(duì)總酸含量有明顯的抑制作用（P＜0.05）；培養(yǎng)72 h，6% NaCl下的總酸含量與對(duì)照組相比無顯著性差異（P＞0.05）。

圖9 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)YC14總酸含量的影響Fig. 9 Inf l uence of different salt concentrations on total acid production of YC14

由圖10可知，對(duì)照組與6% NaCl下總酸含量變化趨勢(shì)一致，9%、15% NaCl下總酸含量變化趨勢(shì)一致，12% NaCl下總酸含量在12～24 h下降，24～72 h上升后又趨于穩(wěn)定。在培養(yǎng)過程中總酸量出現(xiàn)下降可能是由于部分酸揮發(fā)或與醇類結(jié)合生成酯。從縱向比較，第72小時(shí)時(shí)，6%、9%、12%、15% NaCl的總酸含量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。

圖10 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)YF17總酸含量的影響Fig. 10 Inf l uence of different salt concentrations on total acid production of YF17

由圖7～10可知，在第72小時(shí)，YB4的總酸含量比YC14與YF17的總酸含量低，這與2.3.2.2節(jié)的結(jié)果有異，原因可能是由YB4生長(zhǎng)特性、接種量多少、培養(yǎng)基體積、取樣方式不同造成。

3 討 論

3.1 耐鹽生香酵母的篩選、鑒定

通過梯度耐鹽篩選、感官與理化相結(jié)合的方式從川南腌菜中篩選出4 株耐鹽幅度廣（3%～15% NaCl）生香能力強(qiáng)的酵母菌株YB4、YB18、YC14、YF17，經(jīng)ITS rDNA鑒定結(jié)果分別為M. guilliermondii、D. hansenii、C. parapsilosis，其中YF17經(jīng)多次純化后測(cè)序結(jié)果均為雙峰，表明ITS rDNA測(cè)序方式并不適用于所有真菌的鑒定。

3.2 4 株酵母菌生長(zhǎng)情況及pH值變化

對(duì)4 株菌的生長(zhǎng)情況及培養(yǎng)過程中的pH值進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)，在相同接種量、培養(yǎng)條件下，YF17最先進(jìn)入穩(wěn)定期；YB4、YC14、YF17的細(xì)胞穩(wěn)定性優(yōu)于YB18；4 株菌產(chǎn)生的pH值環(huán)境均在各自生長(zhǎng)能接受的范圍內(nèi)。

3.3 4 株酵母菌總酸變化情況

對(duì)4 株菌的總酸進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，6%、9%、12%、15% NaCl對(duì)4 株菌產(chǎn)酸情況的影響不同?？傮w來說，培養(yǎng)過程中6%、9% NaCl對(duì)菌株YB4、YB18產(chǎn)酸能力的抑制低于質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%、15% NaCl；6% NaCl對(duì)菌株YC14、YF17產(chǎn)酸能力的抑制低于其余3 種NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)。YB18、YC14在培養(yǎng)過程中可能由于適鹽能力的激發(fā)，6% NaCl反而有利于產(chǎn)酸能力的增強(qiáng)，當(dāng)培養(yǎng)60 h后總酸含量出現(xiàn)大幅上升。菌株培養(yǎng)過程中總酸含量下降可能是由于一部分酸揮發(fā)或與醇類結(jié)合生成酯。菌株的總酸含量還可能受各自生長(zhǎng)特性、接種量多少、培養(yǎng)基體積、取樣方式的影響。

4 結(jié) 論

本研究以川南名腌菜各部位（A、B、C、D、E、F）為原料，采用梯度耐鹽篩選、感官與理化相結(jié)合的方式篩選出4 株耐鹽幅度廣（3%～15% NaCl）、生香能力強(qiáng)的酵母菌株，經(jīng)ITS rDNA鑒定，結(jié)果為YB4（M. guilliermondii）、YB18（D. hansenii）、YC14（C. parapsilosis），YF17不能由ITS rDNA 測(cè)序方式進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。3 株菌（YB4、YC14、YF17）的細(xì)胞穩(wěn)定性較好，所有菌株產(chǎn)生的pH值均在生長(zhǎng)能接受的范圍內(nèi)。12%、15% NaCl對(duì)菌株YB4、YB18產(chǎn)酸能力的抑制作用較強(qiáng)；質(zhì)量分?jǐn)?shù)6% NaCl對(duì)菌株YC14、YF17產(chǎn)酸能力的抑制作用較弱。培養(yǎng)過程中，YB18、YC14在質(zhì)量分?jǐn)?shù)6% NaCl中產(chǎn)酸能力增強(qiáng)，可能是由于菌種適鹽性的激發(fā)。本研究篩選出4 株耐鹽幅度廣（質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%～15% NaCl）生香能力強(qiáng)的酵母菌株，為腌菜發(fā)酵菌劑的制備提供了理論支持。