牦牛曲拉源乳酸菌的產(chǎn)香性能比較

文鵬程，曹 磊，楊 敏，馬瑞娟，張忠明，張衛(wèi)兵,*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學理學院，甘肅 蘭州 730070）

發(fā)酵乳中的風味物質(zhì)形成主要歸因于發(fā)酵劑的作用，發(fā)酵劑中乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的風味物質(zhì)是發(fā)酵乳典型特征風味的基礎，發(fā)酵劑中乳酸菌菌株的質(zhì)量與活力對發(fā)酵乳的風味和品質(zhì)影響較大[1-2]。牦牛曲拉是將牦牛乳脫脂后，在自然條件下進行發(fā)酵使酪蛋白凝結(jié)、干燥后制成的一種發(fā)酵乳制品[3-5]。牦牛曲拉不僅可以食用，還可作為制作酸奶的發(fā)酵劑，其中蘊藏著豐富的乳酸菌資源[6]。實驗室前期從牦牛曲拉中篩選得到了幾株發(fā)酵性能優(yōu)良的乳酸菌，但對其產(chǎn)香性能尚不明確。

固相微萃?。╯olid phase microextraction，SPME）技術具有靈敏度高、檢出限低、分析范圍廣、萃取條件溫和等特點，可直接與氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用[7-9]。近年來，SPME-GC-MS技術在食品風味分析中有了快速發(fā)展，其在醋[10]、紅酒[11]、果蔬[12]、綠茶[13]等相關研究中的應用越來越廣泛。

本實驗以牦牛曲拉源乳酸菌為研究對象，利用SPME-GC-MS檢測分析發(fā)酵乳中揮發(fā)性風味物質(zhì)，采用相對氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）探討分析發(fā)酵乳中的關鍵性風味物質(zhì)，并利用主成分分析法對其產(chǎn)香性能進行比較，以期為青藏高原乳酸菌資源的利用開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂乳粉 黑龍江完達山乳業(yè)；MRS瓊脂培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基 青島海博生物技術有限公司。

乳酸菌菌株：Q1嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus），Q2耐久腸球菌（Enterococcus durans），G1、G2、G3、G4瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）由甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院實驗室保藏。

1.2 儀器與設備

SW-CJH-2FD型超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；YX-280A型高壓滅菌鍋 上海三申醫(yī)療器械有限公司；HG303-4型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學儀器有限公司；TRACE1310-ISQ型GC-MS聯(lián)用儀 美國Thermo Scientific公司；DVB/CAR/PDMS型萃取頭 美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵酸乳樣品的制備

參照萬金敏[14]的方法。發(fā)酵酸乳的制作流程：原料乳→檢驗→標準化→巴氏殺菌（90 ℃，5 min）→加糖→均質(zhì)（6 8～7 2 ℃，二級均質(zhì)1.5×1 04、5×103kPa）→接種（乳基發(fā)酵劑添加量為3%）→發(fā)酵（42 ℃，4～7 h）→降溫→后發(fā)酵（4 ℃，24 h）→成品。

1.3.2 揮發(fā)性風味物質(zhì)測定

萃取條件：取8 mL樣品于頂空瓶并加入2 g NaCl，密封并搖勻。50 ℃平衡60 min，萃取頭于50 ℃水浴鍋中磁力攪拌吸附30 min；萃取頭在250 ℃老化1 h；250 ℃解吸附3 min。

GC條件：HP-5毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；采用程序升溫方式，起始溫度35 ℃，保持5 min，以5 ℃/min上升至140 ℃，保持2 min，以10 ℃/min上升至250 ℃，保持3 min；汽化室溫度250 ℃；載氣為He，流速1.0 mL/min；不分流進樣。

MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；燈絲電流0.20 mA；離子源溫度230 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 40～500；發(fā)射電流100 μA。

1.3.3 定性與定量分析

揮發(fā)性成分利用MS全離子掃描模式下的總離子流圖譜，以NIST08標準庫自動檢索獲得各組分的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，通過峰面積歸一化法計算各組分相對峰面積的百分含量。每份樣品取樣3 次，取平均值作為各風味物質(zhì)組分的相對含量。

1.3.4 關鍵揮發(fā)性物質(zhì)評價

參照劉登勇等[15]的方法，用ROAV法確定樣品中關鍵揮發(fā)性風味物質(zhì)。先定義對樣品風味貢獻最大的組分為ROAVmax=100，其他風味成分ROAV計算公式如下：

式中：Ci和Ti分別為各揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量/%和對應的感覺閾值/（μg/L）；Cmax和Tmax分別為對樣品總體風味貢獻最大組分的相對含量/%和對應的感覺閾值/（μg/L）。

所有組分的ROAV不大于100，而且ROAV越大的組分對樣品總體風味的貢獻也越大。一般認為ROAV不小于1的組分為所測樣品的關鍵風味化合物，0.1≤ROAV＜1的組分對所測樣品的總體風味具有重要修飾作用[16]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 18.0（SPSS Inc.,USA）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行分析，采用ANOVA進行方差分析，用Duncan法進行多重顯著性分析和標準偏差計算，利用Origin 8.0軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單菌發(fā)酵乳中揮發(fā)性風味物質(zhì)檢測分析

利用SPME-GC-MS技術對6 株不同的乳酸菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生的風味物質(zhì)進行檢測，得到揮發(fā)性成分的總離子流圖，將每份樣品取樣3 次測定后，發(fā)現(xiàn)獲得的總離子流圖大體相同，結(jié)果如圖1所示。

圖1 乳酸菌發(fā)酵乳中揮發(fā)性成分總離子流圖Fig. 1 Total ion current (TIC) chromatograms of volatiles extracted from fermented milk produced with pure cultures by SPME-GC-MS

表1 單菌發(fā)酵牛乳樣品中揮發(fā)性風味物質(zhì)SPME-GC-MS分析Table 1 Major volatile compounds extracted from fermented milk produced with pure cultures by SPME-GC-MS

使用NIST08譜庫檢索得到發(fā)酵乳揮發(fā)性風味物質(zhì)的組成和含量，結(jié)果如表1所示。篩選并除去一部分硅氧烷類雜質(zhì)峰，6 株乳酸菌發(fā)酵共產(chǎn)生60 種揮發(fā)性物質(zhì)，不同菌種發(fā)酵產(chǎn)生的風味物質(zhì)組成和含量存在差異。由表1可知，發(fā)酵乳樣品中的風味物質(zhì)主要以酸、酮、醛和酯類物質(zhì)為主，6 株菌發(fā)酵均產(chǎn)生2-庚酮、2-壬酮、2-十三酮、正丁酸、異戊醇、糠醇、乙偶姻、乙酸、己酸、癸酸和辛酸，且風味物質(zhì)含量存在差異。菌株G1產(chǎn)2-庚酮能力顯著高于其余菌株（P＜0.05），而在其余菌株之間含量差異不顯著（P＞0.05）；菌株G1和Q1產(chǎn)生異戊醇與己酸能力強，顯著高于其余菌株（P＜0.05）；菌株G2產(chǎn)乙偶姻、糠醇和2-十三酮能力顯著高于其他菌株（P＜0.05）；菌株G4產(chǎn)乙酸和丁酸能力較強。

另由表1可知，4 株桿菌發(fā)酵均產(chǎn)生己醛，而在球菌發(fā)酵的樣品中未檢出，且菌株G1產(chǎn)己醛能力高于其他菌株；只在球菌發(fā)酵的樣品中檢測出2,3-戊二酮，且相對含量差異不顯著（P＞0.05）。另外，乙基苯、正戊酸和萘為G1發(fā)酵產(chǎn)生的特有物質(zhì)；雙戊烯、麥芽醇、2-糠酸甲酯、二羥基丙酮為G2發(fā)酵產(chǎn)生的特有成分；間二甲苯為G3所特有的成分；G4發(fā)酵產(chǎn)生丙酸和2-丁酮；Q2發(fā)酵可產(chǎn)生棕櫚酸。

王偉君等[17]研究發(fā)現(xiàn)，嗜熱鏈球菌發(fā)酵產(chǎn)生的風味物質(zhì)主要包括2,3-戊二酮和2,3-丁二酮，這與本研究的結(jié)果相似。雷華威等[18]研究發(fā)現(xiàn)瑞士乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的風味物質(zhì)中酸類物質(zhì)占最高比重，與本實驗結(jié)果一致，原因是本研究的瑞士乳酸菌的產(chǎn)酸能力較強。王丹等[1]研究嗜熱鏈球菌發(fā)酵酸乳，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在嗜熱鏈球菌發(fā)酵時沒有產(chǎn)生乙醛，與本實驗結(jié)果一致。而Chaves等[19]發(fā)現(xiàn)嗜熱鏈球菌具有較強的產(chǎn)乙醛的能力，這可能與不同來源的菌株間的代謝差異性有關。綜上所述，不同乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的代謝物質(zhì)存在差異，因而導致發(fā)酵酸乳的風味物質(zhì)組成有差異。

表2 單菌發(fā)酵牛乳中各類揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)量Table 2 Compositions and contents of volatile compounds extracted from fermented milk produced with pure cultures

由表2可知，菌株G1、G2、G3、G4、Q1、Q2發(fā)酵分別產(chǎn)生了29、36、30、32、25、27 種揮發(fā)性風味物質(zhì)，其中，菌株G2和G4發(fā)酵的牛乳產(chǎn)生風味物質(zhì)較多，風味物質(zhì)組成不同及各組分相對含量的不同體現(xiàn)出菌株之間的差異性。酸類物質(zhì)相對含量在31.18%～76.13%之間，對發(fā)酵乳風味的形成具有巨大貢獻；酮和醇類物質(zhì)在2.13%～13.49%范圍內(nèi)，相對含量較高。其余揮發(fā)性物質(zhì)的含量較少，但對形成發(fā)酵乳的總體風味依然具有重要作用。王丹等[1]認為發(fā)酵乳中復雜多樣的揮發(fā)性物質(zhì)賦予發(fā)酵乳獨特風味，而不同類型的乳酸菌產(chǎn)生這些風味物質(zhì)的能力存在差異，這與本實驗結(jié)果一致。在后續(xù)實驗中不同乳酸菌的代謝差異性可以通過轉(zhuǎn)錄組、代謝組學的方法進一步深入研究。

圖2 單菌發(fā)酵牛乳樣品中揮發(fā)性風味物質(zhì)相對含量熱圖Fig. 2 Heatmaps of volatile flavor substances in fermented milk samples produced with pure cultures

發(fā)酵乳樣品中檢測出的羧酸類化合物較多，對酸乳的風味影響很大，酸類物質(zhì)用于食品中可有效預防雜菌繁殖，賦予食品微酸味而又不掩蓋本身所具有的天然風味和香氣。乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生較多的酮類和較少的醛類物質(zhì)。酮類風味物質(zhì)主要來源于多不飽和脂肪酸的氧化和微生物自身的代謝等[20-21]；雖然檢測到的醛類物質(zhì)組分相對較少，但醛類物質(zhì)閾值整體相對較小，對風味影響巨大[22]。另外，本實驗乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生少量的酯和內(nèi)酯及醇類物質(zhì)。內(nèi)酯類化合物具有極低的閾值，因此對發(fā)酵酸乳風味貢獻巨大[23]，酯類主要來源于微生物通過自身代謝產(chǎn)生和一部分脂肪酸水解形成，通過這些作用形成內(nèi)酯和甲基酮等物質(zhì)對發(fā)酵乳風味有重要影響[20]；雖然乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生了少量的醇類物質(zhì)，但醇類物質(zhì)閾值基本都很高，因此，其對整體風味影響極小，只有在較高濃度下才對風味產(chǎn)生影響[24]。

由圖2可以看出，所有乳酸菌產(chǎn)生風味物質(zhì)的組成及含量存在差異。根據(jù)熱圖中組成及含量的聚類分析可知，菌株G3和Q2發(fā)酵產(chǎn)生的風味物質(zhì)含量和組成相似，可將其聚為一類，說明這兩株菌的產(chǎn)香性能大致相似。另外，菌株Q1與菌株G3和Q2發(fā)酵產(chǎn)生的風味物質(zhì)組成及含量接近。菌株G4與其余菌株發(fā)酵產(chǎn)生風味物質(zhì)的差異最大，距離最遠。因此，不同乳酸菌菌株產(chǎn)生風味物質(zhì)組成及含量差異較大，說明了乳酸菌種間的差異性，其產(chǎn)香能力存在差異。

2.2 不同發(fā)酵乳中關鍵風味化合物的ROAV分析

表3 單菌發(fā)酵牛乳中關鍵性風味物質(zhì)及對應ROAVTable 3 ROAVs of key aroma compounds in fermented milk produced with pure cultures

為進一步確定不同乳酸菌產(chǎn)香性能的差異，采用ROAV法對所發(fā)酵產(chǎn)生的風味物質(zhì)組成和含量結(jié)合其感覺閾值進行完善分析，確定其中的關鍵性風味物質(zhì)。如表3所示，對未查詢到閾值的物質(zhì)不作分析。6 株乳酸菌菌種發(fā)酵的酸乳中，發(fā)酵酸乳樣品中關鍵性風味物質(zhì)存在差異，說明不同乳酸菌的產(chǎn)香性能不同。菌株G1、G2、G3、G4、Q1、Q2發(fā)酵酸乳的關鍵性風味物質(zhì)分別為10、11、9、8、10、7 種。

酸類物質(zhì)中辛酸、丁酸和己酸為關鍵性風味物質(zhì)（ROAV≥1），辛酸具有水果酸味和淡酸味[25]，乙酸能夠呈現(xiàn)出醋酸的味道，丁酸有奶酪的味道[20,26]。其中，丁酸的ROAV在4.88～79.06范圍內(nèi)，在酸類物質(zhì)中對風味的貢獻大，在菌種G4和G1發(fā)酵樣品中ROAV分別達到79.06和57.79，說明丁酸是這2 株菌發(fā)酵乳的關鍵性風味物質(zhì)。酮類物質(zhì)中有3 種關鍵性風味物質(zhì)，分別為2-庚酮、乙偶姻和2-壬酮，2-庚酮具有藥香氣味[25]、乙偶姻具有奶香和強烈的奶油味[27]、2-壬酮具有奶香氣味[28]。其中，2-壬酮的ROAV在47.16～100區(qū)間內(nèi)，對風味貢獻巨大，在G1和Q2菌株發(fā)酵的樣品中ROAV分別為100和88.64，因此，這2 株菌產(chǎn)生的2-壬酮能夠賦予發(fā)酵乳特殊的風味。另外，菌株G2發(fā)酵乳中乙偶姻的ROAV為72.34，為關鍵性風味物質(zhì)，2-庚酮在菌株G1中發(fā)揮較大作用，其ROAV為11.26。

醇類物質(zhì)中異戊醇和糠醇為所有菌株發(fā)酵產(chǎn)生的醇類關鍵性風味物質(zhì)。異戊醇在菌株G1和Q1發(fā)酵乳中是關鍵性風味物質(zhì)（ROAV≥1），在其余菌株發(fā)酵的酸乳中對風味具有修飾作用（0.1≤ROAV＜1）?？反贾辉诰闓2發(fā)酵的酸乳中是關鍵風味物質(zhì)，對風味貢獻較大；壬醛、己醛和乙醛是醛類物質(zhì)中關鍵性風味物質(zhì)（ROAV≥1），壬醛具有蠟香和脂肪香[29]、乙醛可賦予發(fā)酵乳清爽的芳香味[30]。其中，壬醛和己醛是菌株G1發(fā)酵產(chǎn)生的關鍵性風味物質(zhì)，其ROAV分別為81.56和56.74，對酸乳的風味貢獻較大。乙醛是菌株G2、G3和Q2發(fā)酵酸乳的關鍵性風味物質(zhì)。酯類物質(zhì)中己酸乙酯是菌株G1、G2、Q1的關鍵性風味物質(zhì)，其ROAV分別為30.14、24.82和53.19，對風味的形成影響較大。

2.3 發(fā)酵乳中關鍵性風味物質(zhì)的主成分分析

表4 主成分特征值及方差貢獻率Table 4 Eigenvalues of principal components and their variance contribution rates

利用主成分分析研究ROAV大于0.1的風味物質(zhì)，提取不小于1的主成分特征值，結(jié)果如表4所示。前3 個主成分的累計方差貢獻率為79.36%。

圖3 發(fā)酵牛乳關鍵揮發(fā)性風味物質(zhì)主成分載荷圖Fig. 3 Principal component analysis loading plots of key volatile compounds of fermented milk produced with pure cultures

由圖3可知，第1、2、3主成分的方差貢獻率分別為38.70%、21.27%和19.39%。其中，主成分1中載荷最高的正影響揮發(fā)性風味物質(zhì)為苯乙醇，與主成分1呈高度負相關的揮發(fā)性風味物質(zhì)為乙酸；主成分2中載荷最高的正相關揮發(fā)性風味物質(zhì)為丁位辛內(nèi)酯，呈高度負相關的揮發(fā)性物質(zhì)為乙醛；主成分3中載荷最高的正相關揮發(fā)性風味物質(zhì)為己醛，呈高度負相關的發(fā)揮性風味物質(zhì)為癸酸。上述結(jié)果說明苯乙醇、乙酸、丁位辛內(nèi)酯、乙醛、己醛和癸酸是不同菌株發(fā)酵產(chǎn)生風味物質(zhì)含量有顯著差異的揮發(fā)性物質(zhì)。

圖4 發(fā)酵牛乳樣品主成分得分圖（A）和聚類圖（B）Fig. 4 Principal component analysis score plot (A) and clustering diagram (B) of fermented milk

由圖4A可知，主成分1很好地將G4和其他菌株區(qū)分開，菌株G4發(fā)酵樣品在主成分1的負半軸；菌株G1發(fā)酵樣品在主成分2的正半軸，主成分2可以將其與其他菌株完全區(qū)分開。從圖4觀察到6 株乳酸菌發(fā)酵乳分別位于圖中的4 個象限，表明PCA可以將不同菌株的產(chǎn)香能力完全分開，對其進行有效區(qū)分。由圖4B可知，菌株G3和Q2距離最為較近，聚為一類，與其余菌株距離較遠。G4和G1與其余菌株的距離最遠，這一結(jié)果與圖2分析結(jié)果一致。

3 結(jié) 論

采用SPME-GC-MS技術從6 株牦牛曲拉源乳酸菌的發(fā)酵乳中共鑒定出60 種揮發(fā)性風味物質(zhì)，ROAV分析表明不同乳酸菌菌株發(fā)酵產(chǎn)生的關鍵性風味物質(zhì)的組成及含量存在明顯差異。菌株的產(chǎn)香能力比較結(jié)果表明，菌株G1產(chǎn)生2-庚酮能力顯著高于其余菌株；菌株G1和Q1產(chǎn)生異戊醇與己酸能力強；菌株G2產(chǎn)乙偶姻、糠醇和2-十三酮能力顯著高于其他菌株；菌株G4產(chǎn)乙酸和丁酸能力較強。主成分分析結(jié)果也說明不同乳酸菌的產(chǎn)香性能存在差異。