GAS6 基因多態(tài)性及其血漿水平與昆明地區(qū)漢族糖尿病腎臟疾病的相關(guān)性

李佳麗，周曉偉，郭偉昌，陳 婕，張 帆，李會(huì)芳

（1） 昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院糖尿病科，云南昆明 650032；2） 朔州市大醫(yī)院內(nèi)分泌科，山西朔州 036000；3） 昆明醫(yī)科大學(xué)體育部，云南昆明 650500）

近年來(lái)，糖尿病已逐漸成為慢性病、多發(fā)病[1]。其中，DKD 是最常見(jiàn)的糖尿病微血管并發(fā)癥，也是糖尿病患者的主要死因之一[2]。DKD 的發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，主要與血糖長(zhǎng)期控制不佳致機(jī)體出現(xiàn)的氧化應(yīng)激有關(guān)，T2DM 會(huì)使患者出現(xiàn)自身免疫反應(yīng)及低度慢性的臨床炎性反應(yīng)，從而導(dǎo)致DKD 的發(fā)生與發(fā)展[3]。目前，臨床上多用尿微量白蛋白、尿白蛋白肌酐比值等指標(biāo)早期診斷DKD，但這些指標(biāo)受影響的因素較多[4]，因此，尋找診斷DKD 的新型生物標(biāo)志物對(duì)于早期預(yù)防疾病有重要的意義。

研究表明[5]，DKD 患者普遍存在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、炎癥因子水平上升等表現(xiàn)。GAS6 是屬于維生素K 依賴蛋白家族的一種分泌蛋白，參與炎癥反應(yīng)過(guò)程[6]。Hung 等[7]證實(shí)在新發(fā)糖尿病患者中，血漿GAS6 水平與血糖水平、炎癥、內(nèi)皮功能異常標(biāo)志物呈負(fù)相關(guān)。GAS6 不僅與糖尿病發(fā)生相關(guān)，更有研究證實(shí)[8]，GAS6 在DKD 的初始階段也發(fā)揮重要作用。GAS6 可與Axl（受體酪氨酸激酶） 結(jié)合，促進(jìn)P27 的表達(dá)，P27 是細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)因子之一，能誘導(dǎo)G1 期細(xì)胞周期停滯，導(dǎo)致腎小球系膜細(xì)胞肥大，促使DKD 發(fā)生、發(fā)展[9]。Arai 等[10]在GAS6 基因敲除小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)腎小球的肥大程度有所減輕。Yanagita 等[11]的研究明確，華法林可抑制GAS6 及其受體Axl 的表達(dá)，從而減輕腎小球系膜細(xì)胞的肥大并改善腎小球的超濾狀態(tài)，從而抑制蛋白尿的產(chǎn)生。魯偉等[12]通過(guò)比較微量白蛋白尿的T2DM 患者、正常白蛋白尿的T2DM 患者以及健康者的血漿GAS6 水平，發(fā)現(xiàn)微量白蛋白尿組血漿GAS6 水平高于正常白蛋白尿組及健康者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且血漿GAS6 水平與24 h 尿微量白蛋白及HbA1c 水平均呈正相關(guān)，而正常白蛋白尿組與健康者的血漿GAS6 水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在聶明明等[13]的研究中，DKD 組血漿GAS6 水平與總膽紅素（TBIL） 水平、間接膽紅素（IBIL） 水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示GAS6 水平與DKD 的發(fā)生有關(guān)。這一系列相關(guān)研究提示，GAS6 在DKD 的發(fā)生中起到重要作用。本研究旨在探討GAS6 基因多態(tài)性及其血漿水平與昆明地區(qū)漢族人群糖尿病腎臟疾病的發(fā)生、發(fā)展是否具有相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取血糖正常的NC 組成員186例，其中女85例，男101例，均為在昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院體檢中心體檢過(guò)的健康對(duì)照者，年齡（51.90±5.27） 歲，空腹血糖≤5.6 mmol/L；T2DM 組由225例2017年9月至2018年1月在昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的2 型糖尿病患者組成，女110例，男115例，均符合1999年WHO 制定的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，且臨床未診斷為DKD，年齡均在40 歲至55 歲之間；選取在昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院確診為糖尿病腎臟疾病（DKD 組） 患者127例，其中男63例，女64例，納入標(biāo)準(zhǔn)：符合單純2 型糖尿病組（T2DM 組） 納入標(biāo)準(zhǔn)且尿白蛋白肌酐比值＞30 mg/g 或24 h 尿白蛋白排泄率＞30 mg/24 h，并排除其他可能導(dǎo)致尿白蛋白排泄增加的原因和腎臟疾病，年齡均在40～55 歲。研究對(duì)象均已知情同意。

1.2 研究方法

使用DNA 抽提試劑盒提取所有樣本的DNA，并按文獻(xiàn)報(bào)道合成引物。

單核苷酸多態(tài)性（rs8191974），上游序列（5’-TTGAGCGCACCTTGCGTGTG-3’），下游序列（5'-ACTGTGAGCTGGGAGTTGCC-3’）。

PCR 反應(yīng)體系：1 μL DNA 模板，上下游引物共2 μL，2X Tap PCR Master Mix 12.5 μL，加dH2O 9.5 μL至總體積25 μL，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增：預(yù)變性處理，95℃5 min，單循環(huán)；變性處理30 s，55℃；退火處理30 s；延伸處理72℃40 s；終末延伸處理7 min，整體35 個(gè)循環(huán)。最后由上海生物工程有限公司進(jìn)行Sanger 測(cè)序，測(cè)定所有樣本GAS6 基因rs8191974 位點(diǎn)的基因多態(tài)性。ELISA 法測(cè)定血漿Gas6 含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 三組間臨床指標(biāo)和GAS6 水平比較

DKD 組的SBP 和TG 均高于NC 組和T2DM 組（P＜0.017），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；DKD 組的病程、BMI、DBP、TC、LDL、FBG 均高于NC 組，但是HDL 要低于NC 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.017）；DKD 組UACR 和HbA1c 水 平 均 高 于T2DM 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.017）；T2DM組病程、BMI、SBP、DBP、TG、LDL、FBG 均要比NC 組組，HDL 水平比NC 組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.017）；DKD 組及T2DM 組的GAS6 水平均低于NC 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.017）；而GAS6 水平在DKD 組與T2DM 組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 三組的GAS6 水平及各項(xiàng)指標(biāo)的比較（） （1）Tab.1 Comparison of GAS6 levels and clinical indexes among the three groups （） （1）

表1 三組的GAS6 水平及各項(xiàng)指標(biāo)的比較（） （1）Tab.1 Comparison of GAS6 levels and clinical indexes among the three groups （） （1）

與NC 組比較，*P ＜0.05；與T2DM 組比較，△P ＜0.05。

表1 三組的GAS6 水平及各項(xiàng)指標(biāo)的比較（） （2）Tab.1 Comparison of GAS6 levels and clinical indexes among the three groups （） （2）

表1 三組的GAS6 水平及各項(xiàng)指標(biāo)的比較（） （2）Tab.1 Comparison of GAS6 levels and clinical indexes among the three groups （） （2）

與NC 組比較，*P ＜0.05；與T2DM 組比較，△P ＜0.05。

表1 三組的GAS6 水平及各項(xiàng)指標(biāo)的比較（） （3）Tab.1 Comparison of GAS6 levels and clinical indexes among the three groups （） （3）

表1 三組的GAS6 水平及各項(xiàng)指標(biāo)的比較（） （3）Tab.1 Comparison of GAS6 levels and clinical indexes among the three groups （） （3）

與NC 組比較，*P ＜0.05；與T2DM 組比較，△P ＜0.05。

2.2 各組間GAS6 基因rs8191974 位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較

GAS6 基因rs8191974 位點(diǎn)多態(tài)性測(cè)序圖，箭頭所示基因型分別為GG、GA、AA（見(jiàn)圖1～圖3）。

2.3 各組樣本的Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)

各組樣本的GAS6 基因rs8191974 位點(diǎn)基因型頻率均與Hardy-Weinberg 遺傳定律一致（P＞0.05）。其中，G、A 等位基因頻率分別為0.78、0.22，見(jiàn)表2。

2.4 各組間GAS6 基因rs8191974 位點(diǎn)基因型頻率比較

用R×C 表χ2檢驗(yàn)比較三組間GAS6 基因rs8191974 位點(diǎn)基因型頻率，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=12.122，P=0.016）。再拆分為2×C 表做χ2檢驗(yàn)，最后進(jìn)行兩兩比較，α’=0.05/3=0.017。兩兩比較結(jié)果顯示，T2DM 組的GA、AA 基因型頻率低于NC 組，GG 基因型頻率卻比NC 組高，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=10.779，P=0.005）；DKD組與NC 組及T2DM 組的基因型頻率均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=25.180，P=0.075；χ2=0.805，P=0.669），見(jiàn)表3、表4。

2.5 各組間GAS6 基因rs8191974 位點(diǎn)等位基因頻率比較

用R×C 表χ2檢驗(yàn)將各組rs8191974 位點(diǎn)的等位基因頻率對(duì)比，差異顯著（χ2=11.633，P=0.003）。進(jìn)一步拆分為2×C 表做χ2檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，α’=0.05/3=0.017。結(jié)果顯示，NC 組的A 等位基因頻率要大于T2DM 組，而G 等位基因頻率要小于T2DM 組，差異顯著（χ2=10.701，P=0.001）；DKD 組與NC 組、T2DM 組間的等位基因頻率的差異均不顯著（χ2=4.994，P=0.025；χ2=0.327，P=0.567），見(jiàn)表5、表6。

2.6 糖尿病腎臟疾病相關(guān)因素的Logistic 回歸分析

將糖尿病腎臟疾病與否定為因變量（未診斷=0，診斷=1），自變量包含性別（男性=1，女性=2）、年齡、T2DM 病程、HBP 病程、吸煙史（無(wú)=0，有=1）、飲 酒 史（無(wú)=0，有=1）、BMI、SBP、DBP、TC、TG、LDL、HDL、FBG、GAS6基因rs8191974 基因型（GG=1，GA=2，AA=3），行Logistic 回歸分析后發(fā)現(xiàn)HBP 病程、SBP 和FBG可能是糖尿病腎臟疾病發(fā)生的危險(xiǎn)因素，但是GAS6 基因rs8191974 多態(tài)性及其血漿水平可能與糖尿病腎臟疾病的發(fā)生無(wú)相關(guān)性，見(jiàn)表7。

圖1 GG 基因型Fig.1 GG genotype

圖2 GA 基因型Fig.2 GA genotype

圖3 AA 基因型Fig.3 A genotype

表2 各組樣本的Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)［n（%）］Tab.2 He Hardy-Weinberg blance test in samples from the three groups ［n（%）］

表3 rs8191974 位點(diǎn)基因型頻率比較［n（%）］Tab.3 Cmparisons of genotype frequency of rs8191974 ［n（%）］

表4 rs8191974 位點(diǎn)基因型頻率的兩兩比較Tab.4 Pairwise comparisons of genotype frequency of rs8191974 locus

表5 rs8191974 位點(diǎn)等位基因頻率的比較［n（%）］Tab.5 Comparisons of allele frequency of rs8191974 ［n（%）］

表6 rs8191974 位點(diǎn)等位基因頻率的兩兩比較Tab.6 Pairwise comparison of allele frequency of rs8191974

表7 相關(guān)危險(xiǎn)因素的Logistic 回歸分析Tab.7 Logistic regression analysis of the risk factors

3 討論

糖尿病腎臟疾病是常見(jiàn)的糖尿病慢性并發(fā)癥，表現(xiàn)為腎小球?yàn)V過(guò)率減小以及持續(xù)白蛋白尿，病情早期還可能會(huì)出現(xiàn)腎臟高濾過(guò)、腎小球肥大以及系膜細(xì)胞增殖等變化。已有研究明確，GAS6 來(lái)自小鼠腎小球系膜細(xì)胞，是一種生長(zhǎng)因子。它能作為內(nèi)源性的有絲分裂原，引起系膜細(xì)胞的大規(guī)模增殖[14]。Naga 等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，在鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠體內(nèi)，腎小球內(nèi)皮細(xì)胞及系膜細(xì)胞GAS6及其Axl 表達(dá)量明顯增加。而GAS6 及其Axl 表達(dá)量的增加，會(huì)通過(guò)Akt/mTOR 途徑上調(diào)P27 的表達(dá)，P27 是細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)因子之一，能誘導(dǎo)G1期細(xì)胞周期停滯，最終引起腎小球肥大[9]。若GAS6 基因被敲除，小鼠Akt 活性則減低，進(jìn)而減輕腎小球肥大程度[10]。Yanagita 等[11]的研究明確，華法林可抑制GAS6 及其受體Axl 的表達(dá)，從而減輕腎小球系膜細(xì)胞的肥大并改善腎小球的超濾狀態(tài)，從而抑制蛋白尿的產(chǎn)生。這一系列相關(guān)研究提示，GAS6/Axl 信號(hào)傳導(dǎo)通路在DKD 發(fā)生中起到重要作用，若抑制該信號(hào)通路，就能夠延緩糖尿病腎臟疾病的進(jìn)展，從而改善病人生活質(zhì)量。

本研究發(fā)現(xiàn)，DKD 組、NC 組及T2DM 組相比，GAS6 基因rs8191974 位點(diǎn)GG、GA 及AA 基因型頻率的分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=5.180，P=0.075；χ2=0.805，P=0.669），并且等位基因頻率在各組間也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=4.994，P=0.025；χ2=0.327，P=0.567），所得研究結(jié)果與Erkoc 等[15]相同，推測(cè)GAS6 rs8191974 位點(diǎn)基因多態(tài)性與DKD 可能不存在相關(guān)性。Li 等[16]研究GAS6 的血漿濃度會(huì)與糖尿病及糖尿病腎臟疾病嚴(yán)重程度平行，從而推測(cè)出血漿中GAS6 的含量也許與蛋白尿的產(chǎn)生負(fù)相關(guān)，并提出在早期診斷DKD 時(shí)，GAS6 可能是非侵入性生物標(biāo)志物較好的選擇，而Erek-Toprak 等[17]推測(cè)血漿GAS6 含量與T2DM 患者尿白蛋白水平呈正相關(guān)關(guān)系，提出較高水平的血漿GAS6 含量可能會(huì)使糖尿病腎臟疾病風(fēng)險(xiǎn)有不同程度的增加。本研究結(jié)果顯示，T2DM 組及DKD 組血漿GAS6 水平均低于NC 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但是這兩組間的血漿GAS6 水平不存在顯著性差異，由此推測(cè)出血漿GAS6 水平可能與T2DM 的發(fā)生有關(guān)而與DKD 的發(fā)生無(wú)關(guān)。而這與Li[8]和Erek-Toprak 等[9]的結(jié)果不一致，可能是遺傳異質(zhì)性、地域差異以及種族差異帶來(lái)的影響。

在本研究中，昆明地區(qū)的漢族人群中，GAS6基因rs8191974 位點(diǎn)基因多態(tài)性及其血漿水平與糖尿病腎臟疾病可能不存在相關(guān)性，也可能與樣本量較小，差異性難以顯現(xiàn)有關(guān)，有待后續(xù)擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步深入研究。