腸道菌群和免疫在結(jié)直腸腫瘤中作用研究進(jìn)展

梁 睿，淳于緯訓(xùn)，沈 燾，孫 樂(lè)，李云峰

（1） 昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院結(jié)直腸外科，云南昆明 650118；2） 昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)系，云南昆明 650500）

結(jié)直腸腫瘤全球發(fā)病率在所有腫瘤中排第三位，死亡率排在第二位，在我國(guó)，結(jié)直腸腫瘤發(fā)病率、死亡率均位居第四位，并在10 a 有明顯升高趨勢(shì)，發(fā)現(xiàn)新的預(yù)防標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)已成為研究熱點(diǎn)。而腸道菌群超過(guò)100 萬(wàn)億，主要定植在人體的結(jié)直腸中，在機(jī)體免疫系統(tǒng)的形成和疾病抵抗中起著不可或缺的作用。測(cè)序技術(shù)和宏基因組學(xué)的迅速發(fā)展，發(fā)現(xiàn)腸道菌群與機(jī)體免疫系統(tǒng)相互作用，在結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用。

1 結(jié)直腸腫瘤發(fā)生發(fā)展和腸道菌群的關(guān)系

1.1 結(jié)直腸癌發(fā)生和腸道菌群的關(guān)系

2012年[1]有研究表明，具核梭桿菌（Fusobacterium，F(xiàn)n） 相比與正常組織，在結(jié)直腸腫瘤中高度富集，其能誘導(dǎo)局部炎癥，增加炎性細(xì) 胞 因 子 如 IL-6，IL-8，IL-12，TGF-β，TNF-α 等，從而使結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生。此后越來(lái)越多的研究表明，腸道菌群的變化可能是結(jié)直腸癌發(fā)生不可或缺的部分[1-5]。眾所周知，結(jié)直腸癌的發(fā)生主要沿著腺瘤-CRC 軸進(jìn)行（由正常粘膜上皮到異型增生、腺瘤、CRC）。結(jié)合此發(fā)展進(jìn)程及與菌群變化的關(guān)系有兩種著名的假說(shuō)，一是Sears和Pardoll 提出“alpha-bug”假說(shuō)（類(lèi)似于Hajishengallis 提出的keystone pathogen 模型）[6-7]，如脆弱擬桿菌（Bacteroides fragilis，ETBF） 可作為主要致病菌，導(dǎo)致結(jié)腸菌群重構(gòu)，引發(fā)炎癥反應(yīng)和基因毒性反應(yīng)，從而導(dǎo)致上皮增生、異性增生，最后導(dǎo)致CRC 的發(fā)生。二是Tjalsma 等提出的driver-passenger 模型，驅(qū)動(dòng)致病菌（bacteria driver） 在腸道中繁殖，產(chǎn)生驅(qū)動(dòng)的基因毒素，引起腸道微環(huán)境改變和誘發(fā)促炎癥反應(yīng)，進(jìn)而使腸道菌群改變，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的菌群豐度增加，在整個(gè)腸道菌群中超過(guò)驅(qū)動(dòng)致病菌（bacteria driver） 并取代其主導(dǎo)位置導(dǎo)致結(jié)直腸腫瘤的進(jìn)一步發(fā)生，如ETBF 最初可能在腸粘膜上定植，通過(guò)產(chǎn)生B.fragiliusin 毒素（BFT），colibactin 和細(xì)胞死亡毒素（CDT），從而導(dǎo)致腸內(nèi)環(huán)境改變，使梭桿菌和鏈球菌等在整個(gè)腸道微生物群中逐漸超過(guò)ETBF，成為新的優(yōu)勢(shì)菌群，從而進(jìn)一步沿著腺瘤-CRC 進(jìn)行[8]。隨著研究的深入，ETBF 和Fn 等與結(jié)直腸癌發(fā)生相關(guān)的特異性菌株被確定。Fn 是口腔中常見(jiàn)的共生菌，是一種具有侵襲性和促炎性的厭氧菌。Mauro Castellarin 等使用RNA-seq 法篩選結(jié)直腸癌與正常組織標(biāo)本后提出Fn 感染在人類(lèi)結(jié)直腸癌中較為常見(jiàn)，揭示了Fn 在結(jié)直腸癌的發(fā)生中可能起重要作用[1]。Mara Roxana Rubinstein 等進(jìn)一步研究確認(rèn)了Fn 可通過(guò)FadA 粘附與E-cadherin 結(jié)合，激活β-catenin 和Wnt 通路，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)致癌和炎癥反應(yīng)[9]，從而確認(rèn)了Fn 在結(jié)直腸癌中發(fā)生中的作用機(jī)制。

另一方面，家族性息肉病和結(jié)腸炎被認(rèn)為是結(jié)直腸癌的癌前疾病。Dejea Christine M 等[10]證實(shí)在家族性息肉病患者中（FAP），當(dāng)產(chǎn)生BFT 的ETBF 和pks+的大腸桿菌同時(shí)存在時(shí)才能促進(jìn)CRC 的發(fā)生，ETBF 降解粘液層增加pks+的大腸桿菌的粘附，誘導(dǎo)colibactin 產(chǎn)生，導(dǎo)致結(jié)腸上皮細(xì)胞DNA 損傷，表明菌群致癌作用在結(jié)直腸癌前疾病中同樣占有重要地位。已有研究表明患有炎癥性腸?。↖BD） 的患者，包括克羅恩?。–D） 和潰瘍性結(jié)腸炎（UC），患CAC（結(jié)腸炎相關(guān)性CRC） 的風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)很高，預(yù)后較差[11-12]。介于結(jié)腸炎和結(jié)腸癌之間密切的關(guān)系，通過(guò)比較炎癌轉(zhuǎn)化之間的細(xì)菌變化來(lái)找到相關(guān)致病菌和開(kāi)發(fā)針對(duì)其的特效抗生素成為熱點(diǎn)。在急性和慢性的結(jié)腸炎性疾病的致病過(guò)程中，微生物的主要角色地位已被確定[13-14]。隨著化學(xué)致癌的小鼠結(jié)直腸炎癥和腫瘤模型的成功構(gòu)建為后續(xù)的研究墊定了基礎(chǔ)。單劑量的氧化偶氮甲烷（AOM） 和三個(gè)循環(huán)的DSS可以在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)從結(jié)腸炎到結(jié)腸腫瘤的模型（CAC），對(duì)CAC 小鼠模型的縱向研究揭示了在化學(xué)誘導(dǎo)的慢性腸道炎癥存在下腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化[15-16]。使得在結(jié)直腸炎癥時(shí)期控制菌群變化降低結(jié)腸腫瘤的發(fā)生成為可能。腸道菌群在炎癌之間的作用已日益明顯，隨著糞菌移植（FMT） 的飛速發(fā)展，或許能夠在腸道炎癌的治療上起到不可或缺的作用。目前臨床上以將FMT 治療復(fù)發(fā)性艱難梭桿菌列入治療指南[17]。許多研究已表明FMT 在克羅恩病，腸易激綜合征等疾病中治療的有效性[18-21]。移植健康供體在厭氧條件下制備的混合糞菌，可有效持久的緩解輕中度UC[22]。雖然FMT 在治療腸道炎癥具有一定優(yōu)勢(shì)，但其在疾病中的效果和臨床試驗(yàn)仍需進(jìn)一步規(guī)范和發(fā)展，此外其在結(jié)直腸腫瘤中的效果也待研究。

1.2 結(jié)直腸癌發(fā)展和腸道菌群的關(guān)系

近年來(lái)隨著HMP 計(jì)劃（人體微生物組計(jì)劃）和EMP 計(jì)劃的（地球微生物基因組研究項(xiàng)目） 不斷展開(kāi)，結(jié)直腸癌發(fā)展中菌群的作用研究也受到越來(lái)越多研究者的關(guān)注。Chung Yu Ta 等[23]研究發(fā)現(xiàn)化療后復(fù)發(fā)患者的結(jié)直腸癌組織中的Fn 豐度異常增高，并且與患者的臨床病理學(xué)特征有關(guān)，并揭示Fn 靶向TLR4 和MYD88 先天免疫信號(hào)傳導(dǎo)和特異性微小RNA 以激活自噬途徑，導(dǎo)致CRC 的化療耐受。Deng Xingming 等[24]利用16S rRNA 基因測(cè)序檢測(cè)手術(shù)或化療后結(jié)直腸癌患者菌群的變化，發(fā)現(xiàn)手術(shù)治療后腸道菌群的多樣性顯著降低，同時(shí)擬桿菌及厚壁菌的豐度降低，以及變形菌的豐度增加；在化療病人中，一些特定菌株如薩特氏菌、殊異韋榮菌與化療有關(guān)，提示這些細(xì)菌可能與化療抗性存在著潛在的關(guān)聯(lián)。有研究表明，結(jié)直腸癌組織中的Fn 等菌群會(huì)隨著癌細(xì)胞一同轉(zhuǎn)移，F(xiàn)n 可能與其他種屬細(xì)菌共同作用，促進(jìn)CRC的肝轉(zhuǎn)移[25]。目前針對(duì)結(jié)直腸癌臨床TNM 分期或病理分級(jí)與腸道菌群的研究尚少，了解其進(jìn)展中菌群的變化可進(jìn)一步深入了解及完善腸道菌群和CRC 發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系。

這些研究表明腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化在CRC 的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，這預(yù)示著腸道菌群中的特定菌群變化可以作為結(jié)直腸的預(yù)防性生物標(biāo)志物，從而用于早癌篩查是未來(lái)研究的方向。此外，針對(duì)如Fn 類(lèi)促癌菌群的特異性抗菌劑也是未來(lái)治療結(jié)直腸腫瘤待解決的問(wèn)題。

2 結(jié)直腸腫瘤、腸道菌群和免疫

在過(guò)去幾年中，隨著腸道菌群的研究在神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)等疾病的深入研究，其逐漸被認(rèn)為是人類(lèi)第二套的基因，在各種疾病中起著不可或缺的作用[26-28]。人類(lèi)流行病學(xué)研究和小鼠模型實(shí)驗(yàn)表明，腸道微生物群決定了抗癌免疫治療的有效性。因此，微生物群提供了新的預(yù)后生物標(biāo)志物，并顯示出作為未來(lái)抗腫瘤治療的前景。腸道微生物組，腸道生理學(xué)，全身代謝，免疫系統(tǒng)和腫瘤疾病之間出現(xiàn)了多維功能連接網(wǎng)絡(luò)。方法學(xué)進(jìn)展標(biāo)志著筆者能夠描述個(gè)體細(xì)菌物種對(duì)腸屏障和機(jī)體廣泛免疫反應(yīng)的影響[29-30]。在下文中筆者從菌群和免疫，菌群、結(jié)直腸腫瘤和免疫分別討論。

2.1 腸道菌群和免疫

哺乳動(dòng)物的胃腸道內(nèi)有多種微生物群落，包括細(xì)菌、真菌和病毒。腸道微生物群形成先天免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫，調(diào)節(jié)腸道和全身疾病的發(fā)病機(jī)制[31-32]。而在Paul Wilmes 的研究中發(fā)現(xiàn)通過(guò)順產(chǎn)的嬰兒會(huì)從母體縱向獲得擬桿菌門(mén)、放線菌門(mén)中的23 個(gè)分類(lèi)群（包括擬桿菌屬和雙歧桿菌屬），并且這些菌群和LPS（腸道脂多糖） 的合成有關(guān)，LPS 可刺激免疫系統(tǒng)，引起TNF-α 和IL-18 的升高，而剖腹產(chǎn)嬰兒體內(nèi)缺乏這一類(lèi)菌群，從而影響免疫功能[33]，表明腸道菌群在免疫形成階段可能也起著不可或缺的功能。

雖然腸道上皮細(xì)胞不是傳統(tǒng)意義上的免疫細(xì)胞，但其配有豐富的免疫受體，這些受體的表達(dá)和活性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)腸道菌群的識(shí)別，是維持腸道穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵。在上皮特異性缺失的情況下，腸道屏障被破壞，共生菌和腸道固有層分離，導(dǎo)致組織自發(fā)性炎癥的產(chǎn)生[34]。模式識(shí)別受體PRRs（如TOLL 樣受體TLRs 和NOD 樣受體NOD1 和NOD2）在其中起著關(guān)鍵性作用。TLRs 中腸上皮表達(dá)的TLR5，在2 周新生小鼠高表達(dá)，深入研究表明TLR5 能夠和細(xì)菌鞭毛蛋白結(jié)合，致使Reg3γ 分泌，限制表達(dá)鞭毛蛋白的細(xì)菌在腸道定植，確保正常菌群在腸道的建立[35]，表明免疫系統(tǒng)和菌群彼此作用，維持腸道穩(wěn)態(tài)。在小腸潘氏細(xì)胞中高表達(dá)的NOD2 能夠被細(xì)菌的肽聚糖激活產(chǎn)生一系列細(xì)胞反應(yīng)，包括細(xì)胞因子的分泌，誘導(dǎo)自噬，上皮再生，以及抗菌肽的產(chǎn)生，從而引起菌群結(jié)構(gòu)的改變[36-38]。Khosravi 等[39]的研究表明在缺乏微生物群的情況下，無(wú)菌小鼠骨髓中髓樣細(xì)胞的發(fā)育減少，導(dǎo)致全身細(xì)菌感染的清除延遲。在腸道中，微生物產(chǎn)生的SCFAs（短鏈脂肪酸） 可作為改變局部巨噬細(xì)胞表達(dá)譜信號(hào)[40]。目前絕大多數(shù)研究集中在先天淋巴細(xì)胞（ILCs） 上，研究表明，其發(fā)育不受菌群影響，但其正常功能依賴于共生菌的定植，Yoshiyuki Goto 等[41]發(fā)現(xiàn)ILC3 在腸道共生菌群的適當(dāng)刺激下能夠分泌IL-22，誘導(dǎo)上皮細(xì)胞的巖藻糖基化，抵御外來(lái)病原菌。

由上皮細(xì)胞分泌的免疫球蛋白IgA 在腸道菌群也有著重要作用，Jehane Fadlallah 等的通過(guò)分析IgA 缺乏患者和健康人的糞菌，患者腸道菌群輕度失調(diào)，部分促炎分類(lèi)菌增加，抗炎分類(lèi)菌減少，說(shuō)明IgA 能夠參與塑造腸道菌群[42]。此外Atarashi K 等研究表明在腸道中的一些細(xì)菌如分節(jié)絲狀菌可粘附在腸道上皮細(xì)胞從而誘導(dǎo)Th17 細(xì)胞（促炎細(xì)胞） 的積累，同時(shí)還從潰瘍性結(jié)腸炎患者糞便中分離出20 種此類(lèi)細(xì)菌[43]，表明腸道菌群有可能是Th17 增殖過(guò)程中重要的“刺激劑”。Th17 細(xì)胞與Tregs（調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞，抑炎細(xì)胞） 共同存在于腸道固有層，兩者數(shù)量的平衡對(duì)腸道穩(wěn)態(tài)的維持至關(guān)重要，Tregs 可以被細(xì)菌的產(chǎn)物短鏈脂肪酸誘導(dǎo)[44]，這都表明腸道菌群與先天免疫及適應(yīng)性免疫都存在重要的相互作用。

2.2 結(jié)直腸腫瘤、腸道菌群和免疫

越來(lái)越多的研究表明，腸道微生物可以影響各種癌癥并對(duì)癌癥免疫治療的療效起著重要的作用。2018年發(fā)表的幾項(xiàng)研究表明在接受過(guò)PD-1抑制劑治療肺癌、腎癌等不同類(lèi)型腫瘤患者中，未服用抗生素而菌群正常的患者總生存率明顯優(yōu)于服用過(guò)抗生素導(dǎo)致菌群異常的患者，在黑色素瘤中同樣存在類(lèi)似結(jié)果，表明菌群在免疫治療中可能起到重要作用[45-47]。此外菌群可能直接作用于免疫細(xì)胞改善腫瘤進(jìn)展，最新研究表明從健康志愿者糞便中分離的11 株菌在聯(lián)合定植與小鼠腸道時(shí)，可通過(guò)依賴于CD103+樹(shù)突細(xì)胞和MHC Ia 抗原呈遞分子在小鼠腸道誘導(dǎo)生成IFN-γ+CD8T 細(xì)胞，增強(qiáng)抗腫瘤免疫，抑制小鼠的腫瘤進(jìn)程，而這些菌株在人體腸道為低豐度，可能為腫瘤治療提供新的思路[48]。

在結(jié)直腸癌的免疫研究已逐漸深入。Chen Grace Y 等[49]在NOD1-/-小鼠中發(fā)現(xiàn)，共生腸道菌群能夠通過(guò)NOD1 刺激保護(hù)腸上皮屏障，以限制對(duì)腸上皮的損傷，此外能夠特異性激活NOD1 的共生細(xì)菌比具有低特異性的細(xì)菌更能預(yù)防結(jié)腸腫瘤的發(fā)生，這一研究表明機(jī)體免疫和某些共生菌群的相互協(xié)助在結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生中可能起到不可或缺的作用。Tsoi Ho 等[50]研究發(fā)現(xiàn)厭氧鏈球菌在人結(jié)腸癌和腺瘤組織中高表達(dá)，這種細(xì)菌通過(guò)和腸上皮細(xì)胞的TLR2 和TLR4 相互作用，增加ROS（活性氧） 水平，促進(jìn)膽固醇合成和細(xì)胞增殖，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。Kostic A 等[51]進(jìn)一步研究證明，使用ApcMin/+小鼠喂養(yǎng)8 周Fn 和不喂養(yǎng)組作為對(duì)照，檢測(cè)腫瘤中免疫細(xì)胞發(fā)現(xiàn)喂養(yǎng)Fn能夠選擇性的增加CD11b+髓樣細(xì)胞，包括MDSCs（骨髓抑制細(xì)胞）、TAMs（腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞）、DCs（樹(shù)突狀細(xì)胞），這些細(xì)胞能夠抑制T 細(xì)胞的應(yīng)答，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。臨床研究證明了Fn 在結(jié)直腸腫瘤中所起的作用，鑒于Fn 在下調(diào)T 細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫應(yīng)答反應(yīng)中的作用，未來(lái)針對(duì)Fn 的免疫療法也是一個(gè)開(kāi)展方向。而Malik Ankit等[52]研究表明IL-33 能夠促進(jìn)IgA 的產(chǎn)生，維持腸道菌群的穩(wěn)態(tài)，從而限制結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生。CTLs（腫瘤細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞）、TH1（輔助性T 細(xì)胞）、Tregs（胸腺來(lái)源的調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞）、Tfh（濾泡輔助性T 細(xì)胞） 在結(jié)直腸腫瘤中的浸潤(rùn)可延長(zhǎng)患者生存期。Cremonesi Eleonora 等[53]通過(guò)相關(guān)實(shí)驗(yàn)證明在腸道菌群的刺激下，結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞分泌大量趨化因子，而這些因子能夠招募相關(guān)T 淋巴細(xì)胞（如CCL5、CXCL9、CXCL10 能夠招募CTLs 和Th1，CCL17、CCL22、CXCL12 招募Th1 和Tregs，CXCL13 招 募Tfh，CCL20 和CCL17 能夠招募Th17），從而延長(zhǎng)患者預(yù)后，而CCL20，CXCL10 和CXCL11 的表達(dá)水平與細(xì)菌負(fù)荷明顯相關(guān)，此外檢測(cè)到Rikenellaceae，Ruminococcace 和 Lachnospiracee 豐 度 與 CCL5，CCL20 和CXCL11 表達(dá)水平之間有著明顯的相關(guān)性。

至此，筆者以得知腸道菌群具有促進(jìn)抗腫瘤免疫反應(yīng)和抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)的雙重作用，然而目前對(duì)于菌群中有利于腸道保護(hù)，抵抗結(jié)直腸癌腫瘤的發(fā)生的純培養(yǎng)菌株研究尚少，且機(jī)制研究不明確，如何利用菌群的促進(jìn)抗腫瘤的免疫反應(yīng)并改善腫瘤免疫微環(huán)境，抑制其害處是未來(lái)研究的熱點(diǎn)。此外如同在其他腫瘤中的作用，調(diào)整菌群能否改善免疫治療對(duì)結(jié)直腸腫瘤的作用也是新的方向。

3 展望

腸道菌群在腫瘤中的作用吸引了越來(lái)越多的研究者關(guān)注，對(duì)其中機(jī)制的研究也在逐漸深入，但仍有大量問(wèn)題需要解決。人體腸道菌群超過(guò)100萬(wàn)億，與人體細(xì)胞數(shù)量相同。而目前技術(shù)對(duì)于菌群的具體研究也只是滄海一粟，對(duì)于更多細(xì)菌的認(rèn)識(shí)和培養(yǎng)，是未來(lái)研究中必不可少的部分。此外，研究表明梭狀芽孢桿菌分泌的丁酸鹽能夠促進(jìn)Treg 分化，緩解小鼠的結(jié)腸炎[44]。表明腸道菌群的代謝物質(zhì)很大一部分能夠?qū)C(jī)體產(chǎn)生作用，菌群代謝與腫瘤的治療相聯(lián)系仍有很長(zhǎng)的路要走。

近年來(lái)，腸道中真菌在結(jié)直腸癌中的作用也逐漸成為研究熱點(diǎn)。在Wang Tingting 等[54]的研究表明接頭蛋白CARD 的缺乏可以導(dǎo)致巨噬細(xì)胞殺滅真菌的能力受損，小鼠腸道真菌增多，特別是熱帶念球菌，且其能夠?qū)⑿∈蠊撬杓?xì)胞誘導(dǎo)為MDSC（骨髓抑制細(xì)胞） 從而對(duì)免疫細(xì)胞CD4+和CD8+T細(xì)胞有強(qiáng)力抑制作用從而導(dǎo)致結(jié)直腸腫瘤的進(jìn)展。隨著單細(xì)胞測(cè)序的發(fā)展，將其利用到結(jié)直腸腫瘤的菌群免疫中，通過(guò)對(duì)其中的免疫細(xì)胞進(jìn)行分群及其起作用的免疫細(xì)胞鑒定可能也是未來(lái)研究的方向。

總之，筆者可以明顯推斷出在結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，菌群和免疫系統(tǒng)的相互作用一直存在，并起著至關(guān)重要的作用。通過(guò)早期腸道菌群的變化對(duì)結(jié)直腸腫瘤進(jìn)行早期干預(yù)治療將成為未來(lái)研究的一個(gè)重要方向。而維持菌群和人體免疫應(yīng)答的平衡，基于腸道菌群的治療方案將是IBD 和腸道腫瘤的新的突破點(diǎn)。