S100A4和S100A6在成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化中表達(dá)及意義

袁赤亭 洪 盾 朱麗君 李紫嫣

骨質(zhì)疏松是不同原因引起的，以單位體積內(nèi)骨量減少為特點(diǎn)的代謝性骨病變。臨床表現(xiàn)以骨骼疼痛、易于骨折為特征；病理解剖可見骨小梁變細(xì)、 斷裂、 稀疏萎縮，骨皮質(zhì)多孔、變薄[1]。骨是復(fù)雜的組織，不斷地通過破骨細(xì)胞吸收舊骨和成骨細(xì)胞形成新骨，保持動(dòng)態(tài)平衡。破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收和成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成是決定骨量?jī)蓚€(gè)重要的因素；如兩者失衡,會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松、骨軟骨病、骨硬化病等骨相關(guān)疾病[2]。

研究報(bào)道S100蛋白與成骨細(xì)胞分化方面有著密切關(guān)系[3]。S100蛋白在1965年被首先發(fā)現(xiàn)，因其在中性飽和硫酸銨中溶解率100%而命名，相對(duì)分子質(zhì)量為9～13kDa，是一種鈣結(jié)合蛋白家族，只在脊椎動(dòng)物中表達(dá)。具有兩個(gè)EF手模序結(jié)構(gòu)，分別位于羧基端和氨基末端；氨基末端EF手是這個(gè)家族所特有的，由于S100蛋白家族成員具有不同結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致具有不同功能[4]。研究發(fā)現(xiàn)S100蛋白既具有細(xì)胞內(nèi)功能，也有細(xì)胞外功能作用[5]。Duarte等[6]研究發(fā)現(xiàn)S100A4蛋白在成骨誘導(dǎo)分化及礦物質(zhì)吸收過程中起負(fù)性調(diào)節(jié)作用。Hong等[7]研究發(fā)現(xiàn)S100蛋白隨著地塞米松濃度作用而表達(dá)升高，主要發(fā)現(xiàn)S100A4和S100A6等。S100A4和S100A6在骨代謝方面是研究的焦點(diǎn)，但S100A4和S100A6蛋白對(duì)骨代謝的作用機(jī)制未闡明，有待于進(jìn)一步研究和探索。因此本研究探討S100A4和S100A6 mRNA與成骨和破骨細(xì)胞分化的相關(guān)性研究。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料與試劑：EDTA(上海捷瑞生物工程有限公司)，胰酶(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)，TRIzol(美國(guó)Life Technologies公司)，7300 real time PCR 系統(tǒng)(美國(guó)Applied Biosystems公司)，SYBR Green Masrer Mix(瑞士Roche公司)，引物(上海捷瑞生物工程有限公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(瑞士Thermo Scientific公司)。

2.MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)：將MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)在10%小牛血清的а-MEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，置于5%CO2及37℃保濕的溫箱中，定期換液，等細(xì)胞生長(zhǎng)到密度為90%左右，吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，用滅菌PBS清洗3次，加入適量含0.02%EDTA的0.25%胰酶消化30～60s后，加入適量培養(yǎng)基終止消化，反復(fù)吹打細(xì)胞，使其細(xì)胞分散，將其移至離心管后，室溫1000r/min 5min，吸出上清液，加入適量培養(yǎng)基后，將其吹打成細(xì)胞懸液，以1∶2接種到新培養(yǎng)瓶中，置于5%CO2及37℃保濕的溫箱中培養(yǎng)。

3.茜素紅染色:MC3T3-E1細(xì)胞被分成成骨誘導(dǎo)組和對(duì)照組，等培養(yǎng)瓶中MC3T3-E1細(xì)胞生長(zhǎng)密度為90%左右時(shí)，用 PBS 輕緩清洗細(xì)胞表面3次，胰酶消化、培養(yǎng)基終止、離心、收集，向離心管中加入適量新鮮培養(yǎng)基，吹散細(xì)胞后混勻，按1×105/ml密度接種到6孔板上，在有或無成骨誘導(dǎo)液的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3、7、14和21天。棄去培養(yǎng)基，PBS清洗3次，用90%冰乙醇固定、PBS清洗3次，加入茜素紅染液，置于37℃溫箱中孵育10min。用無菌PBS輕緩清洗細(xì)胞表面3次，靜置5分鐘/次；顯微鏡下觀察、拍照，收集、整理。

4.堿性磷酸酶染色：MC3T3-E1細(xì)胞被分成成骨誘導(dǎo)組和對(duì)照組。等培養(yǎng)瓶中MC3T3-E1細(xì)胞生長(zhǎng)密度為90%左右時(shí)，胰酶消化、培養(yǎng)基終止、離心，向離心管中加入適量新鮮培養(yǎng)基，吹散細(xì)胞后混勻，按1×105/ml密度接種到6孔板上，在有或無成骨誘導(dǎo)液的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3、7、14和21天。棄去培養(yǎng)基，用無菌PBS輕緩清洗細(xì)胞表面3次，靜置5分鐘/次；用堿性磷酸酶試劑盒中固定液固定1min。用無菌PBS輕緩清洗細(xì)胞表面3次，靜置5分鐘/次；加入堿性磷酸酶染色液，置于37℃溫箱中孵育45min。用無菌PBS輕緩清洗細(xì)胞表面3次，靜置5分鐘/次；顯微鏡下觀察、拍照，收集、整理。

5.總RNA提取和real time RT-PCR:等培養(yǎng)的MC3T3-E1細(xì)胞密度及狀態(tài)均良好時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用無菌PBS輕柔清冼細(xì)胞表面3次，用含有血清的新鮮培養(yǎng)基終止消化，在室溫下離心(1000r/min、5min)，再用無菌PBS清洗后離心，收集細(xì)胞。總RNA提取用TRIzol方法，具體提取過程根據(jù)試劑說明書。通過測(cè)量在260nm和280nm處吸光度RNA濃度和純度。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，用提取的1μl 總RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。通過7300 real time PCR 系統(tǒng)檢測(cè)目的基因mRNA表達(dá)情況，引物的設(shè)計(jì)詳見表1。PCR擴(kuò)增是通過20μl混合體系(1μl cDNA和0.05μmol/L引物，10μl SYBR Green Masrer Mix)中完成，反應(yīng)溫度條件如下：58℃反轉(zhuǎn)錄在2min,95℃反轉(zhuǎn)錄酶失活10min,40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增(95℃ 15s，60℃ 1min),根據(jù)熔解曲線分析判斷PCR結(jié)果的特異性。通過7300 real time PCR系統(tǒng)收集PCR結(jié)果數(shù)據(jù)。

6.RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)：將RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)在10%小牛血清的a-MEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，置于5%CO2及37℃保濕的溫箱中，等細(xì)胞生長(zhǎng)到密度為90%左右，吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，用滅菌PBS清洗3次，加入適量含0.02%EDTA的0.25%胰酶消化30～60s后，顯微鏡下觀察，等見到細(xì)胞單層收縮突起出現(xiàn)空隙時(shí)，加入適量培養(yǎng)基終止消化，反復(fù)吹打細(xì)胞，使其細(xì)胞分散，將其移至離心管后，室溫1000r/min 5min，吸出上清液，加入適量培養(yǎng)基后，將其吹打成細(xì)胞懸液，以1∶2接種到新培養(yǎng)瓶中，置于5%CO2及37℃保濕的溫箱中培養(yǎng)。

表1 目的基因引物等相關(guān)情況

7.TRAP染色:RAW264.7細(xì)胞分成破骨細(xì)胞誘導(dǎo)組和對(duì)照組，按1×105/ml密度接種到6孔板上。RAW264.7細(xì)胞在有破骨細(xì)胞誘導(dǎo)液(50ng/ml RANKL和25ng/ml M-CSF)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1、3和5天時(shí)，去掉上清液，用 PBS 輕緩清洗細(xì)胞表面3次，加入多聚甲醛固定20min，然后TRAP避光染色2h，用 PBS 輕緩清洗細(xì)胞表面3次，顯微鏡下觀察、拍照，收集、整理及統(tǒng)計(jì)圖片。

8.總RNA提取和real time RT-PCR:RAW264.7細(xì)胞分成破骨細(xì)胞誘導(dǎo)組和對(duì)照組，按1×105/ml密度接種到6孔板上。RAW264.7細(xì)胞在有破骨細(xì)胞誘導(dǎo)液(50ng/ml RANKL和25ng/ml M-CSF)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1、3和5天時(shí)，收集各時(shí)間段細(xì)胞，引物的設(shè)計(jì)詳見表1，通過real time RT-PCR的方法檢測(cè)S100A4、S100A6及TRAP mRNA等表達(dá)情況，收集、整理和統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)(表2)。

表2 目的基因引物相關(guān)情況

結(jié) 果

1.茜素紅染色結(jié)果:成骨誘導(dǎo)組MC3T3細(xì)胞誘導(dǎo)3和7天時(shí)未出現(xiàn)鈣結(jié)節(jié)，14天時(shí)出現(xiàn)散在較小不典型結(jié)節(jié)，21天時(shí)出現(xiàn)數(shù)量較多以及直徑較大典型鈣結(jié)節(jié)。對(duì)照組培養(yǎng)過程中始終未出現(xiàn)典型鈣結(jié)節(jié)(圖1)。

圖1 MC3T3-E1細(xì)胞誘導(dǎo)3、7、14及21天時(shí)茜素紅染色結(jié)果(×100)A.成骨誘導(dǎo)組；B.對(duì)照組

2.堿性磷酸酶染色結(jié)果:成骨誘導(dǎo)組MC3T3細(xì)胞誘導(dǎo)3天時(shí)基本上無陽性，7天時(shí)少數(shù)散在細(xì)胞陽性，14天時(shí)陽性細(xì)胞較多及表達(dá)較高，21天時(shí)出現(xiàn)陽性細(xì)胞較多，但較14天時(shí)陽性率及陽性強(qiáng)度減弱。對(duì)照組MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)過程中無陽性反應(yīng)(圖2)。

圖2 MC3T3-E1細(xì)胞誘導(dǎo)3、7、14及21天時(shí)ALP染色結(jié)果(×100)A.成骨誘導(dǎo)組；B.對(duì)照組

3.MC3T3-E1細(xì)胞成骨誘導(dǎo)中細(xì)胞real time RT-RCR結(jié)果:與未加誘導(dǎo)液組作為對(duì)照，MC3T3-E1細(xì)胞誘導(dǎo)3、7和14天時(shí)，S100A4 和RANKL mRNA表達(dá)逐漸減弱，而誘導(dǎo)21天時(shí)S100A4 和RANKL mRNA表達(dá)比14天時(shí)要增加；S100A6 mRNA表達(dá)在誘導(dǎo)7和14天時(shí)較低，在3和21天時(shí)表達(dá)逐漸較高；ALP 和RUNX2 mRNA在3、7和14天時(shí)表達(dá)逐漸增加，之后出現(xiàn)減弱趨勢(shì)；OPG mRNA 表達(dá)逐漸減弱。S100A4、S100A6、OPG、RANKL、ALP及RUNX2在各時(shí)間段比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖3)。

圖3 S100A4、S100A6、OPG、RANKL、ALP和RUNX2 mRNA表達(dá)結(jié)果A.S100A4；B.S100A6；C.OPG；D.RANKL；E.ALP；F.RUNX2

4.TRAP染色結(jié)果:RAW264.7細(xì)胞在分化5天時(shí)，出現(xiàn)典型TRAP染色結(jié)果(圖4)。

圖4 RAW264.7細(xì)胞分化TRAP染色結(jié)果(×100)A.1天；B.3天；C.5天

5.RAW264.7細(xì)胞分化中real time RT-RCR結(jié)果:與未加誘導(dǎo)液對(duì)照，隨著RAW264.7細(xì)胞逐漸分化， TRAP mRNA表達(dá)逐漸增加，S100A4 mRNA表達(dá)逐漸增加，S100A6 mRNA表達(dá)逐漸下降。S100A4和TRAP 3天和5天比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而S100A6在1天和3天比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖5)。

圖5 S100A4、S100A6 和 TRAP mRNA在破骨細(xì)胞形成各時(shí)間段時(shí)表達(dá)結(jié)果A.S100A4;B.S100A6;C.TRAP

討 論

原發(fā)性骨質(zhì)疏松是骨吸收和骨形成平衡受到破壞，骨吸收明顯增加，是一種全身代謝性疾病，包括絕經(jīng)后、老年性和特發(fā)性等3種，是一種以骨量減少及骨組織結(jié)構(gòu)變化，導(dǎo)致骨脆性增加及骨折風(fēng)險(xiǎn)增加的全身代謝性骨病。隨著生活水平提高，老齡化越來越嚴(yán)重，骨質(zhì)疏松患病率不斷升高而備受人們的重視[8,9]。原發(fā)性骨質(zhì)疏松是由多種基因-環(huán)境因素等微小作用積累的共同結(jié)果，但具體發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，主要表現(xiàn)為破骨細(xì)胞功能增強(qiáng)或成骨細(xì)胞功能減弱，導(dǎo)致骨骼形成減少或骨骼破壞增加而引起骨質(zhì)疏松。

研究發(fā)現(xiàn)S100蛋白可能參與調(diào)節(jié)骨形成或骨吸收[10]。Yoshida等[11]研究發(fā)現(xiàn)S100蛋白可增加可溶性RAGE，從而直接或間接參與sRANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成。Kato等[12]用siRNA抑制牙周韌帶細(xì)胞中S100A4蛋白后，發(fā)現(xiàn)骨鈣素(osteocalcin)和骨保護(hù)素(osteoprotegerin)等成骨相關(guān)因子表達(dá)減弱，礦物質(zhì)化受到抑制，推測(cè)S100A4蛋白與牙周韌帶細(xì)胞成骨分化及礦物質(zhì)化有關(guān)。本研究通過檢測(cè)S100A4和S100A6 mRNA在成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化中表達(dá)的變化，探討S100A4和S100A6骨形成與骨吸收的關(guān)系。

本研究中茜素紅染色和ALP染色結(jié)果提示MC3T3-E1細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化成功，然后在轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)了S100和成骨相關(guān)因子等表達(dá)情況。與對(duì)照組比較，ALP 和RUNX2 mRNA在誘導(dǎo)3、7和14天時(shí)表達(dá)逐漸增加，之后出現(xiàn)減弱趨勢(shì)。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)ALP mRNA表達(dá)結(jié)果和實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)跨度的選擇，考慮誘導(dǎo)10天左右時(shí)ALP mRNA表達(dá)可能出現(xiàn)最高峰，這樣與理論水平基本一致；RUNX2是一類參與調(diào)控成骨的特異性轉(zhuǎn)錄因子，在成骨細(xì)胞分化中早期階段高表達(dá)，到晚期出現(xiàn)下降趨勢(shì)，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合[13,14]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)早期時(shí)細(xì)胞中OPG mRNA表達(dá)均比對(duì)照組高，但呈逐漸下降趨勢(shì)，晚期表達(dá)與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；成骨誘導(dǎo)早期RNAKL表達(dá)趨勢(shì)與OPG一樣，晚期表達(dá)出現(xiàn)升高趨勢(shì)；OPG屬于腫瘤壞死因子受體家族成員，在成骨細(xì)胞中高表達(dá)[15]；理論上OPG在成骨細(xì)胞分化中表達(dá)逐漸升高，但實(shí)際上OPG表達(dá)和分泌受到其他基因的正負(fù)調(diào)控，以及MC3T3-E1細(xì)胞分化過程中可能會(huì)分泌下調(diào)OPG表達(dá)的細(xì)胞因子或其他成分，從而出現(xiàn)OPG表達(dá)變化量在減少；對(duì)照組晚期出現(xiàn)鈣結(jié)節(jié)，提示部分MC3T3細(xì)胞已經(jīng)分化為成骨細(xì)胞，導(dǎo)致OPG表達(dá)升高，因此在誘導(dǎo)晚期出現(xiàn)誘導(dǎo)組和對(duì)照組OPG表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；RANKL表達(dá)在一定程度上受到OPG及其他成骨相關(guān)因子影響，因此本實(shí)驗(yàn)OPG和RANKL結(jié)果與實(shí)際情況相符合。最后，筆者發(fā)現(xiàn)S100A4 mRNA在誘導(dǎo)3、7和14天時(shí)表達(dá)逐漸減弱，之后出現(xiàn)增加趨勢(shì)，但與對(duì)照組比較，仍是下降趨勢(shì)。S100A6 mRNA在誘導(dǎo)3天和21天較高，在誘導(dǎo)7天和14天較低，無明顯時(shí)間依賴性變化。本研究S100A4結(jié)果與Duarte等[6]研究發(fā)現(xiàn)S100A4蛋白在成骨細(xì)胞分化及礦物質(zhì)吸收過程中起負(fù)性調(diào)節(jié)作用的結(jié)果基本相符合。而S100A6蛋白在成骨誘導(dǎo)分化中目前暫無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。因此根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，筆者推測(cè)S100A4蛋白參與調(diào)控成骨誘導(dǎo)分化過程，而S100A6蛋白可能與成骨誘導(dǎo)分化過程中某個(gè)時(shí)期相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)S100A4和S100A6 mRNA在RAW264.7細(xì)胞分化過程中表達(dá)情況。筆者發(fā)現(xiàn)TRAP在RAW264.7細(xì)胞誘導(dǎo)破骨細(xì)胞過程中表達(dá)逐漸增加，具有時(shí)間依賴性；TRAP是破骨細(xì)胞形成的相關(guān)因子，主要由破骨細(xì)胞分泌，代表破骨細(xì)胞活性，在分化晚期表達(dá)最高，因此TRAP結(jié)果與實(shí)際情況相符合。與未加誘導(dǎo)液比較，S100A4 mRNA在破骨細(xì)胞形成過程中表達(dá)逐漸升高，在分化晚期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；S100A6 mRNA 在破骨細(xì)胞形成過程中表達(dá)逐漸下降，但始終比對(duì)照組高，在分化早期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Yoshida等[11]研究發(fā)現(xiàn)S100蛋白可增加可溶性RAGE，從而直接或間接參與sRANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成。綜合研究結(jié)果和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，本研究推測(cè)S100A4和S100A6蛋白可能參與調(diào)控破骨細(xì)胞過程。

綜上所述，S100蛋白可能參與調(diào)控絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制。本研究從轉(zhuǎn)錄水平上檢測(cè)S100A4和S100A6蛋白在成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞形成中表達(dá)結(jié)果，筆者推測(cè)S100A4蛋白既參與調(diào)控成骨過程，又參與調(diào)控破骨過程；而S100A6可能僅參與調(diào)控破骨過程，今后將進(jìn)一步探討S100A4和S100A6蛋白對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制，以及在臨床上驗(yàn)證S100A4和S100A6蛋白在骨質(zhì)疏松標(biāo)本中表達(dá)及意義。