核受體Nur77對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移的影響及機(jī)制研究

姜 平 楊喜科 王秋宇

在婦科惡性腫瘤中卵巢癌的發(fā)生率和病死率均位居前列，早期的卵巢癌癥狀并不明顯，較少出現(xiàn)急性腹痛，且易與卵巢濾泡囊腫、黃體囊腫、闊韌帶肌瘤等其他疾病引起的癥狀混淆，因此不少缺乏體檢的患者在確診時(shí)腫瘤已進(jìn)入晚期并發(fā)生轉(zhuǎn)移，包括蔓延至輸卵管、子宮、腹膜，嚴(yán)重時(shí)可進(jìn)犯到結(jié)腸內(nèi)發(fā)生梗阻，或者通過(guò)淋巴和血液循環(huán)發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，此時(shí)患者身體狀況日益虛弱，各類藥物療效不佳，導(dǎo)致生存率急劇下降。因此，研究卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制，以此作為評(píng)價(jià)病情的指標(biāo)，并為研制藥物提供作用靶點(diǎn)，是提高卵巢癌晚期患者生存率的有效手段[1]。

Nur77為孤兒受體超家族蛋白，在各種組織，在肺癌、胃癌、結(jié)腸癌和肉瘤等腫瘤中常存在過(guò)度表達(dá)，且對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移均起到促進(jìn)作用[2]。有研究報(bào)道，Nur77在卵巢上皮性癌組織中的表達(dá)明顯高于良性卵巢腫瘤、交界性腫瘤及正常的卵巢組織，而且表達(dá)水平隨著臨床病理分期的增加而上升，且隨訪發(fā)現(xiàn)Nur77陽(yáng)性的患者術(shù)后3年的復(fù)發(fā)率明顯增加，確診時(shí)均為晚期且伴有轉(zhuǎn)移，提示Nur77可能與卵巢癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3]。有細(xì)胞研究表明，在SKOV3、HO-8910、HO-8910-PM和3AO等多種卵巢癌細(xì)胞中，具有高轉(zhuǎn)移性的HO-8910-PM細(xì)胞存在Nur77高表達(dá)[4]。據(jù)此，本研究以人高轉(zhuǎn)移性卵巢癌細(xì)胞HO-8910PM為研究對(duì)象，通過(guò)下調(diào)Nur77表達(dá)量或激活其活性，研究Nur77在卵巢癌發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中所產(chǎn)生的作用和病理機(jī)制。

材料與方法

1.材料：(1)藥品與試劑：殼囊孢酮 B(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、高糖DMEM培養(yǎng)基、特級(jí)胎牛血清、0.25%胰酶溶液(美國(guó)Gibco公司)，annexinⅤ-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、BCA法蛋白定量試劑盒試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所)，GAPDH、p-Nur77、p-Akt、Cyclin D1、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin等兔抗人一抗以及羊抗兔二抗(英國(guó)Abcam公司)。TBST緩沖液、Triton X-100溶液、MMP-2、MMP-7、MMP-9 ELISA試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)，Transwell試劑盒(美國(guó)Corning公司)，pLV-U6-MCS-GFP-Puro(型號(hào)：LV008)慢病毒轉(zhuǎn)染載體試劑盒、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、GoTaq?qPCR試劑盒、嘌呤霉素(美國(guó)Promega公司)，shNur77干擾序列 5′-AACTCCAAGTTGGACTATTCCTTAAGTTCTCTAAG GAATAG TCCA ACTTGGTTTTTTC-3′(美國(guó)Invitrogen公司)。(2)儀器:Thermo Forma 3951 細(xì)胞培養(yǎng)箱、Sorvall ST 40臺(tái)式離心機(jī)(美國(guó)Thermo 公司)，F(xiàn)ACS Calibur 型流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)，iMark 680酶標(biāo)儀、Western blot轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-rad公司)，IX71 倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。(3)細(xì)胞:人高轉(zhuǎn)移性卵巢癌細(xì)胞HO-8910PM、293T細(xì)胞株(美國(guó)ATCC生物資源中心)，Tran5α感受態(tài)細(xì)胞(法國(guó)Transgene公司)。

2.方法：(1)細(xì)胞的培養(yǎng)：將細(xì)胞接種于含10% FBS, 100U/ml青霉素，0.1g/L硫酸鏈霉素的高糖 DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、飽和濕度、5% CO2、95% 空氣的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)覆蓋約至 80%時(shí)，用0.25%胰酶消化傳代，并按5×104個(gè)/毫升密度接種于培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)備用。(2)干擾質(zhì)粒的克隆:將正、反義寡核苷酸鏈和反應(yīng)緩沖液各1μl加進(jìn)17μl 純化水，加熱至95℃，10min后自然冷卻至室溫。在37℃加入T4磷酸化酶作用30min使寡核苷酸鏈的5′端磷酸化。將LV008載體、寡核苷酸雙鏈、連接反應(yīng)緩沖液、T4連接酶各1μl 加入6μl 純化水，室溫反應(yīng)30min。冰浴中將50～100ng連接產(chǎn)物分別加入至50μl Tran5α感受態(tài)細(xì)胞中。輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，冰浴30min，42℃水浴熱休克90s。快速將管轉(zhuǎn)移至冰浴中，冰浴2min。分別加入500μl LB培養(yǎng)基，37℃、150r/min振蕩培養(yǎng)40min。將150μl菌液涂布于含氨芐青霉素(100μg/ml)的LB平板表面，室溫下放置，至液體吸收。倒置平板，轉(zhuǎn)移入37℃生化培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。(3)慢病毒包裝:轉(zhuǎn)染前將培養(yǎng)好293T的細(xì)胞培養(yǎng)基更換為無(wú)血清培養(yǎng)基。向一滅菌離心管中加入所制備的各DNA溶液(pLV-gene載體10μg，pGag/Pol載體5μg、pRev載體5μg、pVSV-G載體5μg)，與相應(yīng)體積的Opti-MEM 混合均勻，調(diào)整總體積為 1.5ml。把稀釋后的DNA與稀釋后的Lipofectamine 2000 進(jìn)行混合，在室溫孵育20min后，液轉(zhuǎn)移至293T細(xì)胞的培養(yǎng)液中細(xì)胞培養(yǎng)箱中，6h后更換含血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h。收集轉(zhuǎn)染后的293T 細(xì)胞上清液，于 4℃，4000×g離心10min，除去細(xì)胞碎片。把病毒液樣品加進(jìn)濾杯插到濾過(guò)液收集管中，5000×g離心15min，至濃縮病毒樣品的體積。將病毒濃縮液移出，分裝后保存在病毒管中，可在4℃保存1周，或-80℃長(zhǎng)期保存。(4)干擾穩(wěn)定細(xì)胞系的構(gòu)建:從冰箱取出并在37℃水浴中快速融化病毒，用新鮮的完全培養(yǎng)基稀釋成所需濃度，準(zhǔn)備好HO-8910PM 細(xì)胞，研究組加入shNur77干擾序列載體，對(duì)照組加入慢病毒空載體，加入聚凝胺 37℃培養(yǎng)過(guò)夜。第2天，吸去含病毒的培養(yǎng)液，換上新鮮的完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。第3天，換上含適當(dāng)濃度嘌呤霉素的培養(yǎng)液，篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞株。10～12天后可獲得穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞克隆。熒光顯微鏡下拍照觀察GFP陽(yáng)性率>95%。(5)細(xì)胞的分組處理：按不同的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和處理方式設(shè)對(duì)照組、研究組、Csn-B組、Csn-B(Nur77-/-)組共4個(gè)組別進(jìn)行研究，詳見表1。(6)細(xì)胞周期的檢測(cè)：將細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)，分組處理24h，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌后加入用0.25%胰酶(不含EDTA)于37℃進(jìn)行消化，然后加入500μl 75%的預(yù)冷乙醇，4℃固定過(guò)夜，預(yù)冷PBS洗滌后離心，吸棄上清液，加入100μl RNase A，37℃水浴30min，加入PI染液400μl，4℃避光保存30min，流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞周期。(7)蛋白表達(dá)量的檢測(cè):在6孔板中將培養(yǎng)好的細(xì)胞分組處理24h，用PBS 沖洗2次，加入預(yù)冷細(xì)胞裂解液作用30min， 12000r/min 4℃離心15min，沉淀細(xì)胞碎片等雜質(zhì)，取上清液，BCA法測(cè)定蛋白量。用含12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)上，5%BSA封閉90min，加入稀釋好的一抗，在4℃條件下孵育過(guò)夜。TBST洗膜后，加入二抗，37℃孵育1h，再洗滌2次，ECL試劑暗室顯影，采用成像系統(tǒng)軟件分析膠片中條帶的灰度面積，以內(nèi)參GAPDH基準(zhǔn)計(jì)算各待測(cè)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。(8)基質(zhì)金屬蛋白酶的檢測(cè):在6孔板中將培養(yǎng)好的細(xì)胞分組處理24h，吸取上清液，3000×g離心10min去除細(xì)胞殘屑，按試劑盒說(shuō)明書操作檢測(cè)，以對(duì)照組為參照，比較各藥物組細(xì)胞培養(yǎng)液中MMP-2、MMP-7、MMP-9的相對(duì)分泌量。(9)細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲力的檢測(cè):將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞10cm接種于培養(yǎng)皿中，分組處理24h。將Transwell小室架于配套的24孔板上，按1∶7比例將50mg/L Matrigel膠與無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液混合均勻，取100μl加至小室中央，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育6h，然后棄去殘余液體。將細(xì)胞按2×105個(gè)/孔接種至Transwell小室內(nèi)，下小室加入800μl含10%胎牛血清DMEM培培養(yǎng)24h后，棄去培養(yǎng)液，無(wú)水乙醇固定細(xì)胞10min，0.1% 結(jié)晶紫染色30min，洗滌后在顯微鏡下觀察，隨機(jī)統(tǒng)計(jì)從中間和四周5個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)，求其平均值及標(biāo)準(zhǔn)差。

表1 細(xì)胞的分組處理

結(jié) 果

1.慢病毒載體的轉(zhuǎn)染:從圖1A 可觀察到對(duì)照組和研究組的細(xì)胞在熒光顯微鏡下均可觀察到標(biāo)記蛋白GFP的綠色熒光，兩組的熒光強(qiáng)度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；圖1B可見對(duì)照組Nur77的WB顯影條帶與研究組比較明顯較深；圖1C柱狀圖所示研究組的Nur77相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明慢病毒載體已轉(zhuǎn)染成功，已達(dá)到下調(diào) Nur77表達(dá)量的目的。

圖1 慢病毒載體轉(zhuǎn)染HO-8910PM 細(xì)胞A.轉(zhuǎn)染后對(duì)照組與研究組的熒光成像(×200)；B.轉(zhuǎn)染后對(duì)照組與研究組Nur77的WB顯影條帶；C. 轉(zhuǎn)染后Nur77的相對(duì)表達(dá)量比較;與對(duì)照組比較，*P<0.05

2.細(xì)胞周期分布的檢測(cè)：流式細(xì)胞法檢查各組細(xì)胞在不同細(xì)胞周期的數(shù)量分布，如圖2A所示，圖中紅色部分表示細(xì)胞處于G0和G1期，黃色部分表示處于S期，藍(lán)色部分表示處于G2期和M期。圖2B所示為處于各個(gè)周期的細(xì)胞數(shù)量百分比， S、G2和M期的比例依次為：研究組

3.p-Nur77、p-Akt、Cyclin D1含量的檢測(cè)：WB的顯影條帶如圖3A所示， p-Nur77、p-Akt、Cyclin D1的三者含量呈正相關(guān)變化，含量依次為研究組

圖2 各細(xì)胞周期的細(xì)胞數(shù)量比例A.流式細(xì)胞法檢測(cè)細(xì)胞周期；B.處于不同周期的細(xì)胞數(shù)量比例；與對(duì)照組比較，*P<0.05;與研究組比較，#P<0.05

圖3 WB檢測(cè)p-Nur77、p-Akt、Cyclin D1的表達(dá)量A.各蛋白的WB顯影條帶；B.各蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較;與對(duì)照組比較，*P<0.05；與研究組比較，#P<0.05

4.細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白含量的檢測(cè)：WB的顯影條帶如圖4A所示，E-cadherin的含量依次為研究組> Csn-B(Nur77-/-)組>對(duì)照組>Csn-B組，而N-cadherin和Vimentin的含量則與之相反，依次為研究組

圖4 WB檢測(cè)E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的含量A.各蛋白的WB顯影條帶；B.各蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較;與對(duì)照組比較，*P<0.05；與研究組比較，#P<0.05

5.MMPs分泌量的檢測(cè)：ELISA檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，MMP-2、MMP-7和MMP-9的相對(duì)含量依次為研究組

圖5 MMP-2、MMP-7和MMP-9分泌量的比較與對(duì)照組比較，*P<0.05；與研究組比較，#P<0.05

6.細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲能力的檢測(cè)：圖6A所示為穿過(guò)Transwell小室轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)板孔內(nèi)的細(xì)胞；圖6B所示為采用目鏡微尺的細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，培養(yǎng)板孔內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量依次為研究組< Csn-B(Nur77-/-)組<對(duì)照組< Csn-B，與對(duì)照組比較，各藥物組細(xì)胞數(shù)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

討 論

目前發(fā)現(xiàn)的在人孤兒核受體(orphan nuclear receptor)有25個(gè)成員，之所以成為孤兒受體，是因?yàn)樗鼈兲禺愋缘捏w內(nèi)配體至今仍未確定。Nur77 (也稱為TR3或NGFI-B)就是其中1個(gè)孤兒核受體，其定位于人12號(hào)染色體, 由NR4A1編碼, 是類固醇/甲狀腺受體/視黃酸受體超家族成員。NR4A家族包含3個(gè)成員，即Nur77(NR4A1)、Nurr1(NR4A2)和Nor-1(NR4A3), 它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上都具有典型的核受體特征。在人乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、卵巢癌等各種惡性腫瘤中均存在Nur77高表達(dá)，提示Nur77可能參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。研究表明，各種有絲分裂原都可以顯著提高Nur77的蛋白表達(dá)，表皮生長(zhǎng)因子、血清等促有絲分裂刺激物能夠強(qiáng)烈地誘導(dǎo)Nur77表達(dá), 從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。轉(zhuǎn)染外源Nur77質(zhì)粒能夠加速細(xì)胞周期進(jìn)程, 增加S/G2期的細(xì)胞數(shù)量, 而抑制內(nèi)源Nur77表達(dá)水平則明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖速度。Nur77高水平表達(dá)是許多腫瘤生長(zhǎng)、增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲的關(guān)鍵因素之一[5]。

圖6 Transwell法檢測(cè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲能力A.轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)板孔內(nèi)的細(xì)胞(×200)；B.細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果的比較;與對(duì)照組比較，*P<0.05；與研究組比較，#P<0.05

Nur77在卵巢上皮性癌組織中的表達(dá)明顯高于良性卵巢腫瘤、交界性腫瘤及正常的卵巢組織，而且表達(dá)水平隨著臨床病理分期的增加而上升，提示Nur77可能與卵巢癌的轉(zhuǎn)移和侵襲密切相關(guān)。卵巢癌的轉(zhuǎn)移包括以下4種方式：(1)直接轉(zhuǎn)移：當(dāng)腫瘤發(fā)展到與周圍的組織器官發(fā)生黏連，可直接蔓延至輸卵管、子宮、腹膜，嚴(yán)重時(shí)可進(jìn)犯到結(jié)腸表面。(2)植入轉(zhuǎn)移：當(dāng)腫瘤細(xì)胞不斷增殖穿破包膜，脫落并擴(kuò)散至腹腔或盆腔內(nèi)，進(jìn)而依附腔內(nèi)臟器繼續(xù)生長(zhǎng)。(3)淋巴轉(zhuǎn)移：卵巢癌可通過(guò)卵巢門血管轉(zhuǎn)移到腹主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)和腹股溝淋巴等組織。(4)血性轉(zhuǎn)移：通過(guò)血液循環(huán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移至肺部、肝臟、骨等部位，各種方式的轉(zhuǎn)移和侵襲均涉及到腫瘤細(xì)胞的迅速增殖，細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變以及產(chǎn)生各種能夠分解正常組織基質(zhì)的分子，包括各類基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)[6]。

Cyclin D1是細(xì)胞周期蛋白中最重要的一員，Cyclin D1過(guò)度表達(dá)可使細(xì)胞增殖失控，迅速?gòu)腉1期進(jìn)入S期，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活、生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和代謝因而其在腫瘤學(xué)研究領(lǐng)域常作為一個(gè)觀察腫瘤細(xì)胞增殖狀況的有效指標(biāo)[7，8]。研究表明Cyclin D1的表達(dá)受到上游PI3K/Akt通路的調(diào)控，當(dāng)Akt經(jīng)過(guò)第二信使PI3K磷酸化生成p-Akt后，可延長(zhǎng)下游的信號(hào)通路蛋白Cyclin D1的半衰期，從而促使細(xì)胞增殖加快乃至發(fā)生癌變[9]。有研究者通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細(xì)胞中Nur77可介入PI3K/Akt的調(diào)控，干擾Nur77的表達(dá)可對(duì)PI3K/Akt通路產(chǎn)生抑制作用而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[10]。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)HO-8910PM細(xì)胞Nur77的表達(dá)量可抑制Akt的磷酸化激活，降低Cyclin D1的表達(dá)，遏制細(xì)胞周期的進(jìn)展，最終抑制HO-8910PM細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖[11]。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transformation，EMT)是上皮源性腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的首要階段，在極性上皮細(xì)胞逐漸向間質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的過(guò)程中, 細(xì)胞的遷移、侵襲能力不斷加強(qiáng)，主要發(fā)生機(jī)制為不同亞型鈣黏附蛋白(cadherin)之間的轉(zhuǎn)換[12]。其中E-cadherin是維持上皮細(xì)胞之間的連接黏附，保持細(xì)胞聚集功能的主要分子，因而在正常細(xì)胞組織中保持高水平表達(dá)，若其表達(dá)水平降低，則可導(dǎo)致細(xì)胞復(fù)合體解離; 而cadherin 另一個(gè)亞型N-cadherin 的作用則與之相反，其在某些生長(zhǎng)因子的作用下可使細(xì)胞復(fù)合體解離，在腫瘤細(xì)胞侵襲、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的過(guò)程中起到促進(jìn)作用[13,14]。波形蛋白(Vimentin)是中間絲蛋白家族的主要成員，其多聚體是與肌動(dòng)蛋白和微管蛋白共同構(gòu)成細(xì)胞骨架蛋白的關(guān)鍵成分，研究發(fā)現(xiàn)在癌細(xì)胞侵襲和遷移的過(guò)程中，游離Vimentin含量的不斷增加，意味著細(xì)胞骨架蛋白發(fā)生解離，是EMT開始進(jìn)展的信號(hào)[15]。本研究結(jié)果表明，下調(diào)HO-8910PM細(xì)胞中Nur77的表達(dá)量可抑制E-cadherin向N-cadherin的轉(zhuǎn)化，并維持Vimentin的穩(wěn)定，從而抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移能力[16,17]。

MMPs 是一個(gè)能夠降解和重塑細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白水解酶家族，在正常組織中的表達(dá)和活性相對(duì)較低，但在發(fā)生炎性反應(yīng)、骨質(zhì)疏松、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等病變的時(shí)候，其含量均會(huì)顯著增加。大量臨床研究表明鼻咽癌的轉(zhuǎn)移與MMPs的過(guò)度表達(dá)分泌密切相關(guān)，包括MMP-1、2、7、9、13、14等眾多家族成員，涉及細(xì)胞間質(zhì)、基膜膠原蛋白的降解以及骨質(zhì)的侵蝕[18]。在各種 MMPs 成員中MMP-2、MMP-7和MMP-9與卵巢癌發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系最為密切，它們主要降解的底物為Ⅳ型膠原、明膠、彈力蛋白等組織基膜的主要成分，而基膜的降解是腫瘤細(xì)胞進(jìn)行侵襲與轉(zhuǎn)移首要階段[19]。因此本研究選用MMP-2、MMP-7和MMP-9作為檢測(cè)指標(biāo)，并選用富含層黏連蛋白、Ⅳ型膠原的Matrigel膠作為Transwell實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)皿的基質(zhì)進(jìn)行研究。本研究結(jié)果表明，下調(diào)HO-8910PM細(xì)胞Nur77的表達(dá)量，培養(yǎng)基中的MMP-2、MMP-7和MMP-9含量顯著逐漸減少，結(jié)合Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，下調(diào)Nur77的表達(dá)量能夠抑制HO-8910PM細(xì)胞分泌MMP-2、MMP-7和MMP-9,降低其侵襲轉(zhuǎn)移的能力。