CHC患者HCV基因分型及與肝功能指標(biāo)的關(guān)系

楊慧潔 虞莉莎 殷雪瑞 陳占國(guó) 鄭曉群

世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，每年新發(fā)丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染病例約300萬(wàn)～400萬(wàn)，感染率約3%[1]。大多數(shù)情況下，丙型肝炎已被證實(shí)無(wú)臨床表現(xiàn)，但延誤診斷可能導(dǎo)致肝細(xì)胞癌和肝硬化的晚期發(fā)作[2]。因此，HCV感染的防治形勢(shì)仍然非常嚴(yán)峻。HCV是一種具有高度遺傳多樣性的正股單鏈RNA病毒，HCV 基因分型有助于了解丙肝的危險(xiǎn)因素以及肝臟疾病的進(jìn)展情況[3]。因此，不同基因型的HCV感染患者在臨床抗病毒用藥方面需差異性對(duì)待[4, 5]。本研究采用反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)一步法對(duì)慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C，CHC)患者進(jìn)行基因分型，探討CHC患者HCV基因分型與肝功能指標(biāo)和HCV RNA拷貝數(shù)的關(guān)系，為CHC患者臨床判斷CHC病情提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

對(duì)象與方法

1.研究對(duì)象：回顧性分析2018年1月～2019年7月在筆者醫(yī)院門(mén)診或住院接受HCV基因分型的CHC患者94例作為研究對(duì)象，其中男性64例，女性30例，患者年齡23～73歲，中位年齡43歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合CHC的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；②在HCV基因分型前未接受過(guò)抗病毒治療；③無(wú)合并其他感染、腫瘤、炎癥等疾病，臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①已接受或正在接受抗病毒治療；②合并其他感染，如乙肝等；③急性丙型肝炎病毒感染。本研究已獲筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書(shū)。

2.主要儀器和試劑：ABI 7500型熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)、西門(mén)子ADVIA2400全自動(dòng)生化分析儀(德國(guó)Siemens公司)、Anadas9850全自動(dòng)核酸提純系統(tǒng)(廈門(mén)安普利生物工程有限公司)。丙型肝炎基因分型試劑盒(泰普生物科學(xué)有限公司，批號(hào)311902)，HCV RNA定量試劑盒(廈門(mén)安普利生物工程有限公司，批號(hào)201901002)、丙氨酸轉(zhuǎn)移酶試劑盒(德國(guó)Siemens公司，批號(hào) R1試劑 217AL，R2試劑 218AL)，天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(德國(guó)Siemens公司，批號(hào) R1試劑 218AS，R2試劑 219AS)、總膽紅素(德國(guó)Siemens公司，批號(hào) R1試劑 433BR，R2試劑 435BR)、直接膽紅素(德國(guó)Siemens公司，批號(hào) R1試劑 425BR，R2試劑 427BR)。

3.標(biāo)本處理：采用EDTA抗凝真空管采集受檢者靜脈血2ml，充分混勻，3500r/min離心5min，留取上層血漿，并轉(zhuǎn)移至紫外消毒的無(wú)菌管中，置-80℃冰箱內(nèi)待檢。

4.HCV RNA定量檢測(cè)：采用廈門(mén)安普利生物工程有限公司的HCV RNA定量試劑盒進(jìn)行HCV RNA定量檢測(cè)，即采用配套的Anadas9850全自動(dòng)核酸提純系統(tǒng)進(jìn)行HCV核酸提取，最后在美國(guó)ABI公司的ABI 7500熒光定量PCR進(jìn)行PCR擴(kuò)增。檢測(cè)過(guò)程嚴(yán)格按照儀器及試劑標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)進(jìn)行。

5.肝功能相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)：采用德國(guó)Siemens公司ADVIA2400全自動(dòng)生化分析儀及配套丙氨酸轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽紅素(TIBL)、直接膽紅素(DIBL)測(cè)定試劑盒檢測(cè)。

6.HCV基因分型檢測(cè)：本實(shí)驗(yàn)室已做好RT-qPCR一步法檢測(cè)HCV基因分型試劑盒的性能驗(yàn)證，在此基礎(chǔ)上接受HCV基因分型的標(biāo)本檢測(cè)。采用核酸提取柱法對(duì)待測(cè)標(biāo)本進(jìn)行RNA抽提，采用泰普生物科學(xué)有限公司的丙型肝炎基因分型試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，該試劑盒需同時(shí)配制HCV 1b RT-PCR 反應(yīng)液、HCV 2a/6a RT-PCR 反應(yīng)液和HCV 3a/3b RT-PCR 反應(yīng)液，各反應(yīng)管的熒光素標(biāo)記，HCV 1b、HCV 2a和HCV 3a用FAM熒光素標(biāo)記，HCV 6a和HCV 3b用JOE熒光素標(biāo)記。在50μl反應(yīng)體系中每管加試劑40μl和10μl模板。在ABI 7500熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)上完成PCR擴(kuò)增，熒光通道檢測(cè)分別為FAM-MGB和JOE-MGB。

7.質(zhì)量控制及結(jié)果判斷：標(biāo)本檢測(cè)過(guò)程需同時(shí)測(cè)定陰性質(zhì)控和陽(yáng)性質(zhì)控，只有兩者在控時(shí)進(jìn)行結(jié)果判讀。待測(cè)樣本結(jié)果判讀，詳見(jiàn)表1。以上要求需在同一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)滿足，否則本次實(shí)驗(yàn)無(wú)效，需重新進(jìn)行。

8.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用 SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。非正態(tài)分布計(jì)量資料以中位數(shù)(范圍)表示，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分比表示。計(jì)量資料，非正態(tài)分布采用多組獨(dú)立秩和檢驗(yàn)；HCV RNA 的對(duì)數(shù)與肝功能指標(biāo)分析采用Spearman秩相關(guān)法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5種基因型的TIBL和DIBL用中位數(shù)表示并用GraphPad 5.0做圖進(jìn)行比較。

表1 HCV基因分型反應(yīng)管熒光素標(biāo)記及結(jié)果判讀

*表示HCV RNA，單位為拷貝數(shù)/微升

結(jié) 果

1.CHC患者的HCV基因型檢測(cè)結(jié)果：對(duì)94例CHC患者標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，共檢出5種基因型及其他型別， HCV 1b型、2a型、3a型、3b型、6a型和其他型別的RT-qPCR擴(kuò)增曲線。有陽(yáng)性擴(kuò)增曲線的標(biāo)本90例，HCV基因分型檢出率為95.7%，其中1b型30例(31.9%)，2a型6例(6.4%)，3a型12例(12.8%)，3b 型22例(23.4%)，6a型20例(21.2%)，其他型別4例(4.3%)?；蛐头植家?b型、3b型和6a型為主，其中1b型占比最高(圖1)。

圖1 HCV基因型的擴(kuò)增曲線A～F分別代表HCV 1b型、2a型、3a型、3b型、6a型和其他型別，縱坐標(biāo)ΔRn表示熒光值，橫坐標(biāo)Cycle表示循環(huán)數(shù)

2.CHC患者的HCV基因型與血ALT和AST關(guān)系：在HCV基因分型有陽(yáng)性擴(kuò)增曲線的90例CHC患者中，比較不同HCV基因型之間ALT和AST水平。在5種HCV基因型中，HCV 3b型的ALT和AST水平高于其他4種基因型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003，P=0.006，表2)。

表2 不同HCV基因型之間ALT、AST水平和HCV RNA拷貝數(shù)比較[M(范圍)]

3.CHC患者的HCV基因型與HCV RNA拷貝數(shù)的關(guān)系：在90例有陽(yáng)性擴(kuò)增曲線CHC患者的HCV RNA檢測(cè)結(jié)果中，6a型HCV RNA拷貝數(shù)最高，3a型HCV RNA拷貝數(shù)最低。HCV基因型與HCV RNA拷貝數(shù)存在相關(guān)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.041，表2)。

4.CHC患者HCV 基因型與TIBL和DIBL水平的相關(guān)性：不同HCV基因型之間的TIBL和DIBL水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.364，圖2A；P=0.564，圖2B)。

討 論

圖2 不同HCV基因型之間的TIBL和DIBL水平比較A.TIBL;B.DIBL

HCV易導(dǎo)致患者肝臟慢性纖維化甚至演變?yōu)楦伟^發(fā)于HCV感染所致的慢性嚴(yán)重肝病和死亡人數(shù)仍在持續(xù)增長(zhǎng)[7]。因此CHC患者及時(shí)和正確的抗病毒治療對(duì)于防止疾病進(jìn)展、改善預(yù)后至關(guān)重要[8]。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為,抗HCV和HCV RNA拷貝數(shù)是診斷HCV感染的主要指標(biāo)，抗HCV可提示HCV的現(xiàn)癥感染和既往感染，HCV RNA拷貝數(shù)則是診斷HCV病毒復(fù)制活躍程度的指標(biāo)[9]。然而，HCV RNA基因分型結(jié)果有助于判定 HCV 治療的難易程度及制定抗病毒治療的個(gè)體化方案，不同基因型的HCV所針對(duì)的治療藥物并不相同[10～12]。基因測(cè)序被認(rèn)為是目前 HCV分型的金標(biāo)準(zhǔn)，但其操作繁瑣、程序復(fù)雜、成本過(guò)高，難以對(duì)較大樣本進(jìn)行分析，因此在臨床工作中不可行。本研究采用核酸提取柱結(jié)合RT-qPCR一步法檢測(cè)CHC患者的基因型，該方法具有快速、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便和特異性高等優(yōu)點(diǎn)。采用該方法對(duì)筆者醫(yī)院94例已確診的CHC患者進(jìn)行HCV基因分型檢測(cè)，共檢測(cè)出5種基因型，檢出基因型別的有90例，陽(yáng)性檢出率為95.7%，該方法可作為輔助診斷技術(shù)用于確診HCV感染。

國(guó)外研究證實(shí)HCV基因型1是全球最流行的，占所有HCV病例的46.2%，基因型3在全球排名第2位，約占30.1%[13]。在亞洲及我國(guó)大部分地區(qū)流行的 HCV 型別為1b，其次為2a，但近幾年在各種因素影響下，原有基因型分布狀況正迅速發(fā)生改變[9, 14]。本研究中HCV基因型分布以1b型為主，占31.9%，其次為3b型和6a型，占23.4%和21.2%。3b型和6a型正逐漸增長(zhǎng)，成為HCV基因型分布的主要型別，這與我國(guó)南方地區(qū)HCV基因型的分布一致[15]。

不同HCV基因型在肝功能指標(biāo)上也存在差異，本研究發(fā)現(xiàn)3b型的ALT和AST水平均高于其他基因型(P<0.05)，CHC患者不同基因型之間的TIBL和DIBL水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。然而有研究者報(bào)道1b 基因型患者 ALT、AST水平均高于 2a 基因型患者及其他基因型，這與本研究結(jié)果并不一致，其原因可能是HCV基因型與肝功能指標(biāo)相關(guān)性存在地區(qū)差異[16]。ALT和AST可以反映肝臟炎性程度，不同基因型患者的肝臟損害程度可能不同，3b型的肝損較其他基因型要嚴(yán)重。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)HCV基因型與HCV RNA拷貝數(shù)存在相關(guān)性，6a型HCV RNA拷貝數(shù)高于其他基因型(P<0.05)，說(shuō)明6a型患者體內(nèi)HCV含量較其他基因型高，這與Chen等[14]的研究結(jié)果一致。另外， 本研究CHC患者HCV RNA拷貝數(shù)與ALT、AST、TIBL和DIBL水平無(wú)明顯相關(guān)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，該結(jié)果與謝月娜等[17]的報(bào)道一致。

本研究所采用的核酸提取柱結(jié)合RT-qPCR一步法對(duì)筆者醫(yī)院CHC患者的HCV基因型并未做到完全確定型別，仍然存在少數(shù)CHC患者在HCV RNA為陽(yáng)性的情況下，不在所檢測(cè)的5種基因型范圍內(nèi)，該結(jié)果說(shuō)明了有少數(shù)基因型落在HCV 1b型、2a型、3a型，3b型和6a型之外，即HCV RNA>1000拷貝數(shù)/微升但HCV基因分型低于檢測(cè)限。因此，臨床在進(jìn)行HCV基因分型檢測(cè)的同時(shí)需同時(shí)進(jìn)行HCV RNA定量檢測(cè)，以提高其他型別的檢出，降低疑難結(jié)果報(bào)告率。另外，本研究也存在一些不足之處，如研究對(duì)象人數(shù)較少，筆者將在后續(xù)研究中進(jìn)一步增加病例數(shù)。

綜上所述，本研究表明HCV基因型與慢性丙型肝炎患者肝臟功能指標(biāo)和HCV RNA拷貝數(shù)存在相關(guān)性。應(yīng)用核酸提取柱結(jié)合RT-qPCR一步法可以方便快速地檢測(cè)HCV基因型，為臨床判斷CHC病情提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。