氧化鋅/多孔石墨烯電化學(xué)免疫傳感器檢測食管癌腫瘤標(biāo)志物CEA

景愛華，李 宇，許 瓊，馮文坡

癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)是一種重要的廣譜腫瘤標(biāo)志物，常用作早期診斷結(jié)腸癌和乳腺癌的特異性標(biāo)志物，也與其他腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測用于食管癌、肺癌及其他惡性腫瘤[1-5]。CEA的高靈敏檢測在癌癥的早期診斷和篩選疾病復(fù)發(fā)中扮演重要的角色。許多專業(yè)的檢測手段，如放射免疫分析法、化學(xué)發(fā)光分析法、酶聯(lián)免疫法等已經(jīng)用于CEA的檢測[6-8]。與傳統(tǒng)的免疫方法相比，電化學(xué)免疫法因靈敏度高、成本低、檢測速度快、易于實(shí)時(shí)原位檢測吸引了更多的關(guān)注。石墨烯復(fù)合材料在免疫傳感器領(lǐng)域的應(yīng)用已屢見不鮮[9]，例如Dong等[10]通過金納米粒子固定水溶性石墨烯量子點(diǎn)，Zhu等[11]用金納米粒子復(fù)合石墨烯，王麗娟等[12]使用金納米顆粒和有機(jī)物殼聚糖來復(fù)合石墨烯，Huang等[13]利用Ag/Au納米顆粒來包覆石墨烯，Wang等[14]用硫堇(Thi)/金納米粒子(AuNPs)來修飾氨基官能石墨烯(NH2-G)，Liu等[15]采用金納米粒子/離子液體功能化還原氧化石墨烯(IL-rGO-AuNPs)復(fù)合材料來修飾電極，對CEA進(jìn)行檢測。

此外，復(fù)合材料因其結(jié)合多種材料的優(yōu)點(diǎn)而在生物傳感領(lǐng)域備受矚目。納米氧化鋅(Zinc oxide，ZnO)是一種寬帶隙半導(dǎo)體材料，具有生物相容性好、在生理環(huán)境中化學(xué)穩(wěn)定性相對良好、比表面積大等優(yōu)點(diǎn)，在光學(xué)、光電子學(xué)、傳感器等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[16-18]。

本研究中，首先獲得多孔石墨烯(HGO)，隨后采用濕化學(xué)法將ZnO納米粒子生長在HGO表面，構(gòu)建了一種ZnO/HGO復(fù)合材料的電化學(xué)傳感器，通過抗原抗體之間特異性結(jié)合實(shí)現(xiàn)對CEA的高靈敏檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑CHI660E電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)，三電極體系：工作電極為玻碳電極，參比電極為飽和甘汞電極，鉑絲電極為對電極；FD-ID50冷凍干燥機(jī)(北京盛超科創(chuàng)生物科技有限公司)；JEOL JSM IT100掃描電子顯微鏡(SEM)；D8 ADVANCE X射線衍射儀(XRD)。CEA抗體(anti-CEA)、癌胚抗原(CEA)、牛血清白蛋白(BSA)購于上海生工生物工程公司，磷酸鹽緩沖溶液由0.1 mol·L-1Na2HPO4和0.1 mol·L-1KH2PO4配制，其他試劑均為分析純，使用前未經(jīng)純化處理，實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 HGO的制備GO和HGO都按照以前本實(shí)驗(yàn)室發(fā)表文獻(xiàn)中所示方法獲得[9]。GO通過改良的Hummer法制得，具體如下：首先，低溫時(shí)將3 g KMnO4加入石墨、NaNO3、H2SO4混合液中(質(zhì)量比為3∶1∶85)。接著，在35 ℃保持1 h，然后加入40 mL蒸餾水，0.5 h后，加入0 ℃蒸餾水100 mL。最后，加入5 mL H2O2(30%)，用5%的稀鹽酸和蒸餾水洗滌至溶液的pH值接近6。將產(chǎn)物于真空60 ℃條件下干燥，得到的褐色固體即為氧化石墨烯。重分散于一定的蒸餾水中超聲分散處理30 min。靜置后取上層清液，即得GO。HGO的制備：將5 mL 30%的H2O2溶液與50 mL 2 mg·mL-1的GO溶液混合，然后在100 ℃的溫度下加熱并攪拌2 h。之后離心、洗滌、重分散，最終制得2 mg·mL-1的深色HGO懸浮液，備用。

1.3 ZnO/HGO復(fù)合物的制備ZnO/HGO復(fù)合物的獲得是通過采用水熱法在HGO表面生長ZnO納米顆粒。首先將制備好的HGO 50 μL滴在玻碳電極表面，然后置于40 ℃烘箱內(nèi)烘干。然后面朝下放置在0.05 mol·L-1Zn(NO3)2-NH3H2O (V/V,1∶1)混合液200 mL中，60 ℃恒溫一定時(shí)間。

1.4 電化學(xué)免疫傳感器的制備將ZnO/HGO/GCE修飾電極置于anti-CEA溶液(0.3 ng·mL-1)中，4 ℃下孵育12 h。接著，將電極浸于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25% BSA(w/w)溶液中，在37 ℃下孵育40 min ，封閉非特異性吸附活性位點(diǎn)。最后放入CEA溶液中，37 ℃下孵育1 h，即制得電化學(xué)免疫傳感器并置于4 ℃的冰箱中保存待用。

2 結(jié)果

2.1 材料的表征對所制備的ZnO/HGO材料進(jìn)行表征。圖1中片層堆積的HGO表面，覆蓋顆粒狀ZnO，ZnO/HGO整體呈現(xiàn)比較有序的致密堆疊結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)間有空隙，形成三維狀，可以有效增大修飾電極表面積。XRD衍射圖如圖2，其中，ZnO/HGO衍射峰中31.6°、34.5°、35.1°、47.1°、56.7°、62.6°為ZnO的衍射峰，分別對應(yīng)于(100)、(002)、(101)、(102)，(110)、(103)。這些峰與ZnO的六方纖鋅礦晶體結(jié)構(gòu)(JCPDS文件編號99-0111)完全一致[19]。表明水熱生長在HGO表面上的ZnO具有比較高的晶體質(zhì)量。

2.2 修飾電極的電化學(xué)行為CV和電化學(xué)EIS是考查電極表面常用的電化學(xué)檢測方法。圖3-4是玻碳電極(GCE)和修飾了ZnO/HGO、anti-CEA、BSA、CEA后的CV和EIS圖。從圖3中，當(dāng)電極上依次修飾上ZnO/HGO/GCE(a),anti-CEA(b)，BSA(c)和CEA(d)后，峰電流逐漸降低。這是由于隨著anti-CEA，BSA和CEA修飾在電極表面，這些生物分子不導(dǎo)電，阻礙了電子在這些分子界面的傳遞，導(dǎo)致氧化還原峰電流隨著修飾步驟進(jìn)展而逐漸降低。圖4中可以看出，隨著玻碳電極表面逐步修飾了ZnO/HGO、anti-CEA、BSA、CEA后，EIS譜中容抗弧半徑越來越大，這也是因?yàn)閍nti-CEA、BSA、CEA等蛋白質(zhì)生物分子不導(dǎo)電，阻礙了電極表面電子的有效傳遞過程，從而在極化電阻上顯示出逐漸增大的情況。該結(jié)果同圖3所示CV的結(jié)果相對應(yīng)，表明免疫傳感器順利制備出來。

圖1 ZnO/HGO掃描電鏡圖

圖2 ZnO/HGO和HGO的XRD衍射圖

a-d：ZnO/HGO/GCE、anti-CEA/ZnO/HGO/GCE、BSA/anti-CEA/ZnO/HGO/GCE、CEA/BSA/anti-CEA/ZnO/HGO/GCE圖3 不同修飾電極的CV圖

a-d：ZnO/HGO/GCE、anti-CEA/ZnO/HGO/GCE、BSA/anti-CEA/ZnO/HGO/GCE、CEA/BSA/anti-CEA/ZnO/HGO/GCE圖4 不同修飾電極的EIS圖

2.3 不同實(shí)驗(yàn)條件的影響

2.3.1 pH的影響分別考察在pH 6.8～7.6的PBS溶液中，免疫傳感器的電流響應(yīng)情況。如圖5可見，在pH 6.8～7.4范圍內(nèi)，電流隨著pH 的增大而增大，pH 7.4時(shí)電流峰值達(dá)到最大；當(dāng)pH由7.4增大到7.6時(shí)，峰電流又隨著pH的增大而降低，峰電流在pH7.4時(shí)達(dá)到最大值，這和體液環(huán)境的pH相似。在實(shí)驗(yàn)過程中，選擇pH 7.4的測試底液。

圖5 pH的影響

2.3.2 CEA孵育時(shí)間的影響傳感器于相同濃度的CEA 標(biāo)準(zhǔn)溶液中孵育不同時(shí)間的電化學(xué)響應(yīng)情況如圖6所示，隨著孵育時(shí)間延長，抗原與抗體結(jié)合量逐漸增大，響應(yīng)增強(qiáng)，在40 min后，傳感器響應(yīng)情況趨于平衡，抗原抗體的結(jié)合達(dá)到飽和。選擇孵育時(shí)間為40 min。

2.4 傳感器的響應(yīng)特性在優(yōu)化條件下，利用免疫傳感器對不同濃度的CEA進(jìn)行測定，記錄它們的差分脈沖伏安信號。從圖7可見，隨著CEA濃度的增加，CEA/BSA/anti-CEA/ZnO/HGO/GCE免疫傳感器的峰值電流也逐步增加。圖8為電流響應(yīng)隨CEA濃度變化的線性關(guān)系圖，校準(zhǔn)曲線顯示峰電流變化值與CEA的對數(shù)濃度在0.1～40 ng·mL-1范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程分別為，△I=5.95+1.48 log CCEA(ng·mL-1)，相關(guān)系數(shù)為0.9932(S/N=3)，檢出限為0.07 ng·mL-1。將本方法與文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行了比較，見表1。結(jié)果表明，本研究制備的傳感器與其他研究具有相似的靈敏度、線性范圍和檢出限。

圖6 CEA孵育時(shí)間的影響

圖7 免疫傳感器對不同濃度CEA的DPV響應(yīng)(0.1、0.2、0.5、1.0、5.0、10、20和40 ng·mL-1)

圖8 免疫傳感器對CEA的校正曲線

表1 不同文獻(xiàn)報(bào)道免疫傳感器檢測CEA比較

2.5 特異性、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性本研究引入了幾種人體環(huán)境可能存在的干擾物來探討該免疫傳感器的特異性，包括L-半胱氨酸(L-Cysteine)、甲胎蛋白(AFP)、葡萄糖(Glucose)、牛血清蛋白(BSA)、人免疫球蛋白(human IgG)、尿酸(UA)。檢測情況如圖9所示，CEA濃度低(1 ng·mL-1)時(shí)獲得檢測信號的強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他干擾物質(zhì)濃度高(50 ng·mL-1)時(shí)的信號強(qiáng)度(n=5)，這表明使用該免疫傳感器測定CEA時(shí)，干擾物質(zhì)不會對CEA的測定產(chǎn)生干擾，免疫傳感器特異性良好。重現(xiàn)性是評價(jià)免疫傳感器性能的一個(gè)重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中，使用相同的方法制備5支免疫傳感器，分別用于測定10 ng·mL-1CEA，所得的峰電流的相對標(biāo)準(zhǔn)差為3.6%，可見該免疫傳感器重現(xiàn)性良好。此外，研究發(fā)現(xiàn)，該免疫傳感器在4 ℃下保存2周后，仍舊能夠保留原電流響應(yīng)強(qiáng)度的96%，可見其穩(wěn)定性良好。

圖9 免疫傳感器的特異性

2.6 樣品測定用所制電化學(xué)免疫傳感器測定食管癌患者血清樣品，取PBS溶液稀釋10倍的血清樣品進(jìn)行測定，結(jié)果如表2所示，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差3.5%～5.7%，回收率93.4%～103.2%。說明該方法測定食管癌患者血清中的CEA含量，所得結(jié)果準(zhǔn)確可信。

表2 樣品測定

3 討論

本實(shí)驗(yàn)利用ZnO/HGO構(gòu)建了一種新型的CEA電化學(xué)免疫傳感器。首先通過濕化法獲得多孔石墨烯(HGO)，這是一種二維基面上具有納米級孔隙的碳材料，它不僅能提高物質(zhì)運(yùn)輸效率、增大了比表面積、增多了活性位點(diǎn)，還能夠有效地防止石墨烯的團(tuán)聚，隨后采用濕化學(xué)法將ZnO納米粒子生長在HGO表面，構(gòu)建了一種ZnO/HGO復(fù)合材料的電化學(xué)傳感器，將ZnO寬帶隙、生物相容性好、在生理環(huán)境中化學(xué)穩(wěn)定性相對良好、比表面積大等優(yōu)點(diǎn)，與石墨烯優(yōu)良的導(dǎo)電性、活性電位結(jié)合起來，具有較大的比表面積、優(yōu)良的生物相容性以及良好的催化作用，不僅大大增加了生物分子的固定量，還顯著提高了傳感器的檢測靈敏度和穩(wěn)定性。

隨后該研究將免疫學(xué)方法與電化學(xué)方法相結(jié)合，以[Fe(CN)6]3-/4-為電化學(xué)探針，通過抗原抗體之間高度的特異性結(jié)合實(shí)現(xiàn)對CEA的高靈敏檢測，取得了較寬的響應(yīng)范圍0.1～40 ng·mL-1，較低的檢測下限0.07 ng·mL-1，最后將該免疫傳感器用于食管癌患者血清樣品中CEA的檢測，效果良好，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差3.5%～5.7%，回收率93.4%～103.2%。說明該方法測定食管癌患者血清中的CEA含量，所得結(jié)果準(zhǔn)確可信。與傳統(tǒng)的免疫方法相比，此免疫傳感器制作簡單、使用方便、成本低、靈敏度高、檢測速度快、易于實(shí)時(shí)原位檢測。在生物醫(yī)學(xué)、臨床診斷、健康檢測等方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。